代 超，劉亞鑫，岳晉魏，邸師紅，祝 茜，楊秀蓮（寧夏醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院心腦血管病醫(yī)院檢驗(yàn)科，銀川 750000）

近30年來,隨著人們生活水平的提高，臨床高脂血癥患者的數(shù)量逐年增加，根據(jù)2016年《中國(guó)居民營(yíng)養(yǎng)與健康現(xiàn)狀》調(diào)查結(jié)果顯示，我國(guó)血脂異?；疾÷蕿?8.6%，將導(dǎo)致 2010～2030年期間我國(guó)心血管病事件約增加920萬(wàn)，預(yù)示著未來血脂異常導(dǎo)致的相關(guān)疾病將繼續(xù)加重[1]。高脂肪血不僅干擾內(nèi)、外源性凝血系統(tǒng)，使患者的纖溶酶原激活物抑制物活性增高,蛋白C 活化受抑,使得纖溶系統(tǒng)、抗凝系統(tǒng)功能削弱[2-3]，而且因其含有較多的乳糜微粒和三酰甘油，可對(duì)入射光產(chǎn)生散射，導(dǎo)致某些凝血結(jié)果出現(xiàn)偏差或檢測(cè)不出，直接影響臨床治療方案和決策[4]。近年來報(bào)道的消除血脂的方法很多，但用血漿稀釋法消除脂肪血的研究較少。本研究采用血漿稀釋法和高速離心法對(duì)脂肪血標(biāo)本進(jìn)行處理，分析不同方法檢測(cè)結(jié)果的干擾及除脂效果，從而指導(dǎo)實(shí)驗(yàn)室選擇最優(yōu)的消除高脂肪血標(biāo)本的方法，提高凝血檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性，現(xiàn)將結(jié)果總結(jié)如下。

1 材料與方法

1.1 研究對(duì)象 選取2017年1月～2019年12月期間本院門診及住院患者脂肪血標(biāo)本78份（病例組），男性41例、女性37例，年齡25～89歲，中位年齡53歲，根據(jù)入院檢測(cè)的TG值將其分為中度脂肪組（42例）和重度脂肪組（36例），納入標(biāo)準(zhǔn)參照中國(guó)成人血脂異常防治指南（2016年修訂版）[5]：輕度脂肪組TG 1.7～5.56mmol/L、中度脂肪組TG 5.65～11.3mmol/L、重度脂肪組TG＞11.3mmol/L。另選我院體檢健康者正常血漿標(biāo)本100例（正常對(duì)照組），男性66例、女性34例，年齡22～58歲，中位年齡35歲，納入標(biāo)準(zhǔn)：枸櫞酸鈉抗凝的血漿外觀澄清、無溶血、無黃疸、無脂肪，凝血結(jié)果均正常，經(jīng)詢問既往病史無腦血管病、糖尿病、心臟病等基礎(chǔ)疾病，近期未服用任何藥物且體檢健康者；再用脂肪乳將正常血漿標(biāo)本配制成不同程度模擬脂肪血（實(shí)驗(yàn)組），包括輕度脂肪組（33例）、中度脂肪組（33例）和重度脂肪組（34例）。各組患者基線資料差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），具有可比性。

1.2 儀器與試劑 CP2000 全自動(dòng)血液凝固分析儀（日本積水醫(yī)療科技有限公司），ADVIA2400 全自動(dòng)生化分析儀（德國(guó)西門子），Centrifuge 5430高速離心機(jī)（德國(guó)艾本德股份公司）；凝血項(xiàng)目試劑盒PT（批號(hào)：848RKQ），APTT（批號(hào)：825RGQ），F(xiàn)bg（批號(hào)：802RAR），DD（批號(hào)：866RAR）；PT，APTT，F(xiàn)IB 質(zhì)控品（正常值批號(hào)：827RGQ，異常值批號(hào)：827RGQ），DD 質(zhì)控品（正常值批號(hào)：562216，異常值批號(hào)：562116）均購(gòu)自日本積水醫(yī)療有限公司；TG 試劑盒購(gòu)自上海華臣科技有限公司；脂肪乳注射液（批號(hào)：F17060925）購(gòu)自西南藥業(yè)股份有限公司。

1.3 方法

1.3.1 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的檢測(cè)：清晨空腹采集患者枸櫞酸鈉抗凝血標(biāo)本5ml，3 000r/min 離心10 min，分離血漿，用CP2000 全自動(dòng)血液凝固分析儀檢測(cè)PT，APTT，F(xiàn)IB 和DD水平。檢測(cè)前嚴(yán)格參照廠家試劑說明書規(guī)定和儀器標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程設(shè)置參數(shù)進(jìn)行定標(biāo)，確保儀器狀態(tài)良好、質(zhì)控均在控。

1.3.2 模擬脂肪血標(biāo)本的配制：本實(shí)驗(yàn)使用脂肪乳注射液配制模擬脂肪血標(biāo)本。取 100份澄清的正常血清標(biāo)本，每份1 000μl，分為實(shí)驗(yàn)組（500μl）、正常對(duì)照組（500μl），利用脂肪乳注射液分別配制成輕度脂肪血標(biāo)本（1%，TG的濃度范圍為3.955±2.053mmol/L）、中度脂肪血標(biāo)本(2%，TG的濃度范圍為8.020±3.126 mmol/L)及重度脂肪血標(biāo)本（5%，TG的濃度范圍為22.712±5.013 mmol/L）。

1.3.3 血漿稀釋法：參照美國(guó)臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化委員會(huì)（NCCLS）EP7-A2 文件，用正常血漿對(duì)中度、重度模擬脂肪血標(biāo)本進(jìn)行1～10倍稀釋后檢測(cè)PT，APTT，F(xiàn)IB 和DD 指標(biāo)，將檢測(cè)結(jié)果通過稀釋轉(zhuǎn)換公式計(jì)算出消除脂肪血干擾后的計(jì)算值，記錄實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，通過對(duì)比稀釋前后凝血指標(biāo)變化得出不同指標(biāo)的最佳稀釋倍數(shù)。

1.3.4 高速離心法：對(duì)脂肪血標(biāo)本用Centrifuge 5430 高速離心機(jī)進(jìn)行12 000 r/min 離心10 min。

1.3.5 CP2000 全自動(dòng)血液凝固分析儀性能評(píng)價(jià)

1.3.5.1 不精密度：根據(jù)CLSI EP9-A3 指南[6]，選取CP2000 全自動(dòng)血液凝固分析儀檢測(cè)的脂肪血標(biāo)本中的兩個(gè)水平的樣本（正常值與異常值），用血漿稀釋法預(yù)處理脂肪血標(biāo)本后，每一個(gè)濃度在每天相同時(shí)間同批不同位置重復(fù)檢測(cè)5次，連續(xù)5天，計(jì)算檢測(cè)結(jié)果批內(nèi)不精密度（S批內(nèi)）和批內(nèi)變異系數(shù)（coefficient of variation，CV%）；每一個(gè)濃度在不同時(shí)間不同批不同位置測(cè)定1次，連續(xù)10天，計(jì)算檢測(cè)結(jié)果批間不精密度（S批間）和批間變異系數(shù)（coefficient of variation，CV%），批內(nèi)不精密度、批間不精密度應(yīng)在制造商要求標(biāo)準(zhǔn)范圍內(nèi)。

1.3.5.2 線性試驗(yàn)：選取用CP2000 全自動(dòng)血液凝固分析儀檢測(cè)的脂肪血標(biāo)本中的高值樣品（來源于病人異常血漿），F(xiàn)BG為7.73 g/L[高值（highvalue，H）]、DD為9.53 mg/L（H），根據(jù)CLSI EP6-A 指南[7]，分別用正常血漿等比稀釋（0，20%，40%，60%，80%，100%），用CP2000 全自動(dòng)血液凝固分析儀檢測(cè) FIB 和DD，重復(fù)3次，計(jì)算x，檢測(cè)結(jié)果的均值和預(yù)期值進(jìn)行直線回歸統(tǒng)計(jì)，判斷標(biāo)準(zhǔn)：觀察各稀釋點(diǎn)呈較好線性；回歸曲線Y＝aX+b的相關(guān)系數(shù)r≥0.975（r2≥0.95[8]），a 在1±0.05。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析采用SPSS24.0 軟件，應(yīng)用D'Agostino-Pearson檢驗(yàn)正態(tài)性，計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，以P≤0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；用線性回歸分析確定FIB 和DD檢測(cè)線性，應(yīng)用Tukey檢驗(yàn)分析離群值。

2 結(jié)果

2.1 不同程度模擬脂肪血對(duì)凝血項(xiàng)目檢測(cè)結(jié)果的影響 見表1。中度脂肪血組和重度脂肪血組PT，APTT，F(xiàn)IB檢測(cè)水平均高于正常對(duì)照組和輕度脂肪血組，DD檢測(cè)水平均低于正常對(duì)照組和輕度脂肪血組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)，且隨著TG濃度的增高，DD濃度明顯呈下降趨勢(shì)，F(xiàn)IB由于儀器的方法學(xué)，未能檢測(cè)出；輕度脂肪血組各項(xiàng)指標(biāo)與正常對(duì)照組相比差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05)。

表1 模擬不同程度脂肪血組凝血項(xiàng)目檢測(cè)結(jié)果比較（±s）

表1 模擬不同程度脂肪血組凝血項(xiàng)目檢測(cè)結(jié)果比較（±s）

注：當(dāng)TG>15.15mmmol/L時(shí),FIB 未檢測(cè)出。

檢測(cè)項(xiàng)目 正常對(duì)照組 輕度脂肪血組 中度脂肪血組 重度脂肪血組中度脂肪血組 vs 正常對(duì)照組 重度脂肪血組 vs 正常對(duì)照組t P t P PT(s) 12.03±0.63 12.15±0.13 12.33±0.13 12.8±0.28-2.110 0.028-3.100 0.017 APTT(s) 28.72±3.21 30.78±0.85 31.67±0.28 32.7±0.44-3.802 0.013-6.318 0.001 FIB(g/L) 2.259±0.24 2.265±0.06 2.753±0.11 未檢出-2.928 0.100//DD(mg/LFEU) 0.52±0.10 0.51±0.53 0.420±0.45 0.35±0.79-2.559 0.043 2.106 0.033

2.2 CP2000 全自動(dòng)血液凝固分析儀性能驗(yàn)證結(jié)果

2.2.1 不精密度：中度脂肪血和重度脂肪血PT，APTT，F(xiàn)IB 和DD的低值和高值批內(nèi)精密度為0.38%～3.57%，批間精密度為1.43%～7.14%，均在制造商提供的允許范圍內(nèi)，見表2。

表2 凝血檢測(cè)項(xiàng)目不精密度驗(yàn)證結(jié)果的分析（n=20）

2.2.2 FIB 和DD的線性驗(yàn)證：FIB的回歸方程為Y=1.021 3X-0.3243，r2=0.988 4；DD的回歸方程為Y=0.951 3X+0.233 3，r2=0.993 7，CA1500 血凝儀具有良好的線性，見表3、圖1和圖2。

2.3 78例脂肪血患者血漿稀釋法和高速離心法處理前后結(jié)果比較 在中度、重度脂肪血組中，血漿稀釋法和高速離心法與處理前檢測(cè)結(jié)果比較PT，APTT，F(xiàn)IB 和DD檢測(cè)結(jié)果差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)，血漿稀釋法與高速離心法相比，各項(xiàng)指標(biāo)檢測(cè)結(jié)果差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05)，見表4、表5。

表3 FIB 和DD線性范圍驗(yàn)證結(jié)果分析

圖1 FIB線性

圖2 DD線性

表4 42例中度脂肪血患者血漿稀釋法和高速離心法處理前后結(jié)果比較（±s）

表4 42例中度脂肪血患者血漿稀釋法和高速離心法處理前后結(jié)果比較（±s）

檢測(cè)項(xiàng)目 處理前 血漿稀釋法 高速離心法 血漿稀釋法 vs 處理前 高速離心法 vs 處理前t P t P PT(s) 14.8±0.84 11.3±0.69 11.2±1.10 6.560 0.001 4.601 0.004 APTT(s) 35.8±3.54 30.3±2.26 29.5±1.51 6.288 0.012 3.244 0.042 FIB(g/L) 4.17±0.47 3.14±0.35 3.32±0.26 4.319 0.014 4.811 0.009 DD(mg/L FEU) 0.24±0.06 0.35±0.08 0.37±0.05-4.013 0.028-2.286 0.015

表5 36例重度脂肪血患者血漿稀釋法和高速離心法處理前后結(jié)果的比較（±s）

表5 36例重度脂肪血患者血漿稀釋法和高速離心法處理前后結(jié)果的比較（±s）

檢測(cè)項(xiàng)目 處理前 血漿稀釋法 高速離心法血漿稀釋法 vs 處理前 高速離心法 vs 處理前t P t P PT(s) 15.2±1.06 12.1±0.97 11.5±0.56 2.590 0.041 8.655 0.000 APTT(s) 39.5±226 25.5±2.39 26.2±2.46 5.928 0.023 5.402 0.030 FIB(g/L) 未檢出 3.55±0.54 3.73±0.69////DD(mg/L FEU) 0.25±0.05 0.60±0.12 0.63±0.16-4.225 0.020-2.376 0.010

3 討論

在臨床檢測(cè)中，高脂血標(biāo)本日益增多，由于實(shí)驗(yàn)室凝血儀器大多采用了光學(xué)比濁法分析凝血相關(guān)檢測(cè)項(xiàng)目，高脂血標(biāo)本成為臨床檢驗(yàn)結(jié)果準(zhǔn)確性的常見干擾因素[9]。因此通過實(shí)驗(yàn)分析高脂血癥干擾檢測(cè)的機(jī)理，降低甚至消除脂血帶來的干擾對(duì)避免發(fā)出與臨床不符的檢測(cè)報(bào)告給臨床醫(yī)師造成誤診有重要意義[10]。本研究結(jié)果顯示，在不同程度模擬脂肪血中，中度脂肪血組和重度脂肪血組中PT，APTT，F(xiàn)IB檢測(cè)水平均高于正常對(duì)照組和輕度脂肪血組，DD檢測(cè)水平均低于正常對(duì)照組和輕度脂肪血組(均P<0.05)，而輕度脂肪血對(duì)凝血結(jié)果無明顯影響。原因分析如下：①實(shí)驗(yàn)采用的CP2000 血凝分析儀原理主要是光學(xué)比濁法，以透光度降低為判斷終點(diǎn)，輕度脂肪血標(biāo)本中因三酰甘油含量較低，對(duì)凝血檢測(cè)光吸收強(qiáng)度改變較弱，因此對(duì)檢測(cè)結(jié)果影響較小。②中、重度脂肪血標(biāo)本因三酰甘油含量較高，導(dǎo)致吸光強(qiáng)度改變較大，進(jìn)而產(chǎn)生干擾使透射光和散射光強(qiáng)度也發(fā)生改變，使檢測(cè)結(jié)果出現(xiàn)偏差或無法測(cè)出；③重度脂肪血包裹血漿中凝血因子，使血凝試劑不能與血漿凝血因子充分反應(yīng)，只能檢測(cè)大部脂肪的吸光度，影響檢測(cè)結(jié)果。也有文獻(xiàn)報(bào)道[11-12]中度脂肪血對(duì)凝血結(jié)果影響不大，與本研究不一致，原因可能與脂肪血濃度不同以及實(shí)驗(yàn)所用儀器、試劑、條件不一致有關(guān)。中、重度脂肪血標(biāo)本是凝血檢測(cè)中的棘手問題，因此找到一些消除脂血標(biāo)本的方法，確保結(jié)果準(zhǔn)確十分重要。

傳統(tǒng)的消除脂肪血干擾的方法有生理鹽水稀釋法、脂質(zhì)清除劑法、乙醚萃取法、聚乙二醇法等，這些方法均有明顯的消脂效果，但操作復(fù)雜，并且這些物質(zhì)本身屬于被檢測(cè)物質(zhì)之外的物質(zhì)，會(huì)產(chǎn)生一定的基質(zhì)效應(yīng)，不適合在所有臨床檢驗(yàn)中推廣[13]。高速離心法是目前被認(rèn)可的消除脂肪血最有效的方法，操作簡(jiǎn)單，效果顯著，且已經(jīng)在多數(shù)醫(yī)院普遍使用[14]，而血漿稀釋法消脂的研究較少，本實(shí)驗(yàn)采用正常血漿標(biāo)本作為稀釋液，對(duì)不同濃度脂肪血中各指標(biāo)進(jìn)行不同倍數(shù)的稀釋處理得出，中度脂肪血中PT，APTT的最佳稀釋倍數(shù)為2倍，F(xiàn)IB，DD的最佳稀釋倍數(shù)為3倍，重度脂肪血中各指標(biāo)的最佳稀釋倍數(shù)為5倍。本文在用血漿稀釋法和高速離心法消除脂肪血標(biāo)本的效果對(duì)比研究中發(fā)現(xiàn)，兩種方法與處理前檢測(cè)結(jié)果比較PT，APTT，F(xiàn)IB 和DD檢測(cè)結(jié)果有明顯的區(qū)別，但這兩種方法之間各凝血項(xiàng)目檢測(cè)結(jié)果無明顯區(qū)別，說明兩種方法消除脂肪血效果都很顯著，是臨床實(shí)踐中兩種不錯(cuò)的消脂方法。

良好的精密度是保證結(jié)果準(zhǔn)確性的重要條件，也是檢測(cè)系統(tǒng)的基礎(chǔ)評(píng)價(jià)指標(biāo)[15-16]。本研究依據(jù)CLSI 系列指南用血漿稀釋法對(duì)CP2000 全自動(dòng)血液凝固分析儀進(jìn)行性能驗(yàn)證，中、重度脂肪血各指標(biāo)低值和高值的批內(nèi)精密度（0.38%～3.57%）和批間精密度（1.43%～7.14%）均低于制造商要求范圍[17]，CP2000 血凝儀具有良好的檢測(cè)線性。本實(shí)驗(yàn)創(chuàng)新性的采用正常血漿代替血凝專用稀釋液預(yù)處理脂肪血標(biāo)本，進(jìn)行血凝儀精密度和線性的驗(yàn)證，結(jié)果也證實(shí)此驗(yàn)證方法可行、效果較好。

綜上所述，中、重度脂血標(biāo)本會(huì)對(duì)血凝結(jié)果產(chǎn)生干擾，血漿稀釋法與高速離心法在消除脂肪血標(biāo)本中效果顯著，但血漿稀釋法操作更簡(jiǎn)單、成本低廉，而且避免了其他物質(zhì)稀釋帶來的基質(zhì)效應(yīng)，適用于多數(shù)凝血分析儀，能夠滿足臨床檢驗(yàn)的要求，在消除脂肪血標(biāo)本中有巨大的潛能，有望成為消除脂肪血方法的主流。