李 凌，王 成，王 靜，陳小偉（.南京市六合區(qū)人民醫(yī)院檢驗科，南京500；.中國人民解放軍東部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院檢驗科，南京000）

2型糖尿?。╰ype 2 diabetes，T2DM）是一種以糖代謝障礙為主要特征的慢性炎癥性疾病，現(xiàn)已成為危害我國人類健康的主要原因，其發(fā)病機制尚不完全清楚。T2DM患者血糖長期控制不佳易誘發(fā)相關(guān)微血管并發(fā)癥（type 2 diabetes associated microvascular complications，T2DMC），是T2DM患者致殘、致死的主要原因，對患者生活質(zhì)量和生命造成極大威脅，然而目前臨床尚缺乏T2DMC 風(fēng)險預(yù)測和診斷有價值的血清學(xué)標(biāo)志物[1]。大量研究顯示，微小核糖核酸（microRNA，miRNA）在T2DM 及其相關(guān)的微血管并發(fā)癥發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮重要作用，其可通過對胰島β 細(xì)胞、微血管內(nèi)皮細(xì)胞生理病理功能進(jìn)行調(diào)節(jié)，參與細(xì)胞功能障礙和損傷[2]。肥胖導(dǎo)致的脂代謝異常是T2DM 發(fā)生發(fā)展的主要危險因素，其中，氧化低密度脂蛋白（ox-LDL）和脂蛋白a [Lp(a)]可與載脂蛋白H（β2-GPI）形成穩(wěn)定的復(fù)合物β2-GPI/ox-LDL和β2-GP Ⅰ-Lp(a)，在T2DM患者血管損傷中發(fā)揮關(guān)鍵作用[3]。此外，miRNA表達(dá)異常與脂代謝紊亂之間也存在緊密聯(lián)系。miR-152是一種胰腺發(fā)育相關(guān)的miRNA，與胰島β 細(xì)胞分化、凋亡及胰島素分泌相關(guān)[4]；同時，miR-152 在脂代謝過程中也發(fā)揮重要作用[5]。然而，miR-152 在T2DMC患者外周血中表達(dá)變化尚不清楚，且其與患者血清β2-GPI/ox-LDL和β2-GP Ⅰ-Lp(a)水平相關(guān)性及聯(lián)合檢測作為T2DMC 診斷指標(biāo)價值亦未見報道。本研究通過檢測T2DM 及T2DMC患者血清中miR-152，β2-GPI/ox-LDL和β2-GP Ⅰ-Lp(a)的水平，探討miR-152 變化特征及其聯(lián)合檢測β2-GPI/ox-LDL和β2-GP Ⅰ-Lp(a)對T2DMC的臨床診斷價值。

1 材料與方法

1.1 研究對象 選取2013年1月～2018年12月在南京市六合區(qū)人民醫(yī)院和東部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院收治的79例T2DM（男性49例，女性30例，年齡48.9± 13.4歲）及78例T2DMC（男性52例，女性26例，年齡52.1 ± 12.8歲）患者，其中T2DM 按照世界衛(wèi)生組織（WHO）制定的入選標(biāo)準(zhǔn)：空腹血糖≥7.0 mmol/L和/或餐后2 h 血糖≥11.1mmol/L和/或糖化血紅蛋白（HbA1c）≥ 6.5%；T2DM 伴相關(guān)微血管病變組（T2DMC）入選標(biāo)準(zhǔn)：患有T2DM并被診斷有糖尿病腎病或糖尿病神經(jīng)病變或糖尿病視網(wǎng)膜病變的患者。排除標(biāo)準(zhǔn)：近一個月內(nèi)使用過降糖藥物治療；近期接受手術(shù)治療患者；有嚴(yán)重肝臟疾病或慢性腎功能不全；其他內(nèi)分泌疾病患者。選取同期在上述醫(yī)院體檢中心行體檢的健康對照者78例（男性45例，女性33例，年齡50.8 ± 14.8歲）。對照組、T2DM患者組、T2DMC患者組間年齡、性別差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（均P>0.05）?；颊呒皩φ站谜婵丈懿杉崭轨o脈血3～5 ml，1 500 g離心10 min 后取血清置于-70℃冰箱留存待用。

1.2 試劑和儀器 血清RNA 提取試劑酸性水飽和酚（美國Sigma-Aldrich 公司）；分析純級別氯仿，異丙醇，無水乙醇（上?；瘜W(xué)試劑公司）；3 mol/L（pH = 5.5）醋酸鈉（美國Ambion 公司）；人工合成的miRNA 成熟體標(biāo)準(zhǔn)品（廣州銳博生物科技有限公司）；miRNA 逆轉(zhuǎn)錄PCR buffer，AMV酶，dNTP mixture，實時熒光定量PCR buffer，rTaq酶，25mmol/L MgCl2（大連TAKARA 公司）；TaqMan miRNA檢測試劑盒（美國Life technology 公司）；去除RNA 酶DEPC 水（美國Sigma-Aldrich 公司）；血生化指標(biāo)包括空腹血糖（Glu）、總膽固醇（TC）、三酰甘油（TG）檢測試劑（英國Randox 公司）；低密度脂蛋白（LDL）、高密度脂蛋白（HDL）檢測試劑（日本第一化學(xué)株式會社）。普通PCR儀，7500型實時熒光定量PCR 儀（美國Applied Biosystem 公司），酶標(biāo)儀（美國BioRad 公司），7600 全自動生化分析儀（日本HITACHI 公司）。

1.3 方法 血清RNA 提取、miRNA 逆轉(zhuǎn)錄及實時熒光定量PCR檢測、反應(yīng)體系和參數(shù)設(shè)置均按照文獻(xiàn)報道的方法進(jìn)行，通過標(biāo)準(zhǔn)曲線計算血清miRNA表達(dá)水平[6]。血清β2-GPI/ox-LDL和β2-GP Ⅰ-Lp(a)按參考文獻(xiàn)[7-8]建立的ELISA 法測定，酶標(biāo)儀檢測波長為450 nm。運用7600 全自動生化分析儀按照操作規(guī)程及試劑說明書對患者及對照血清生化指標(biāo)進(jìn)行測定。

1.4 統(tǒng)計學(xué)分析 數(shù)據(jù)分析用Graphpad 7.0 軟件和SPSS 23.0 統(tǒng)計軟件進(jìn)行。正態(tài)分布的數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，兩組間比較采用t檢驗；非正態(tài)分布的數(shù)據(jù)以中位數(shù)（四分位數(shù)間距）[M（P25,P75）]表示，兩組間比較采用非參數(shù)Mann-WhitneyU檢驗。運用ROC曲線分析評估血清miR-152，β2-GPI/ox-LDL和β2-GP Ⅰ-Lp(a) 對 于T2DM及其相關(guān)微血管病變的診斷價值，進(jìn)一步結(jié)合二元邏輯回歸分析三者聯(lián)合檢測的診斷價值。血清miRNA水平與氧化脂蛋白相關(guān)復(fù)合物、其他生化指標(biāo)的相關(guān)性用Spearman 秩相關(guān)分析。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不同組間血清miR-152，β2-GPI/ox-LDL和β2-GPI-Lp(a)表達(dá)水平分析 見表1。與健康對照組相比，miR-152，β2-GPI/ox-LDL和β2-GP Ⅰ-Lp(a)水平在T2DM 和T2DMC患者血清中上調(diào)，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P<0.01）。同時，血清miR-152 和β2-GPI/ox-LDL 在T2DMC組中水平亦高于T2DM組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.05）。

表1 不同組間血清miR-152，β2-GPI/ox-LDL和β2-GPI-Lp(a)表達(dá)水平比較[M(P25,P75)]

2.2 血清miR-152，β2-GPI/ox-LDL和β2-GPI-Lp(a)水平對T2DMC的診斷價值 見圖1。ROC曲線分析發(fā)現(xiàn)，血清miR-152，β2-GPI/ox-LDL和β2-GP Ⅰ-Lp(a)診斷T2DM組患者的ROC曲線下面積分別為0.847（95% CI：0.785～0.908），0.644（95%CI：0.558～0.730）和0.700（95% CI：0.619～0.782）；診斷T2DMC組患者曲線下面積分別為0.899（95%CI：0.847～0.950），0.785（95% CI：0.716～0.855）和0.718（95% CI：0.619～0.782）；三者聯(lián)合診斷T2DM 和T2DMC組患者曲線下面積分別為0.923（95% CI：0.882～0.964）和0.963（95% CI：0.934～0.992），其價值均高于單一指標(biāo)。同時，三者聯(lián)合檢測對于T2DM 和T2DMC組患者還具有一定的鑒別診斷價值0.677（95% CI：0.592～0.762）。

圖1 血清miR-152，β2-GPI/ox-LDL和β2-GPI-Lp(a)及三者聯(lián)合診斷ROC曲線

2.3 相關(guān)性分析 見表2。Spearman 相關(guān)分析結(jié)果顯示，在T2DM 和T2DMC組患者中，血清β2-GP1-Lp(a)與TC 和TG水平均呈正相關(guān)（r=0.215，0.203，均P<0.05），血清miR-152，β2-GPI/ox-LDL和β2-GP Ⅰ-Lp(a)組合與LDL水平呈正相關(guān)（r=0.188，P<0.05）。

表2 T2DM 和T2DMC患者血清miR-152，β2-GPI/ox-LDL和β2-GPI-Lp(a)及其聯(lián)合檢測與生化指標(biāo)相關(guān)性分析

3 討論

T2DMC 尚缺乏有價值的血清學(xué)標(biāo)志物，臨床診斷和病情監(jiān)控較為困難。大量研究顯示，miRNA在T2DM 及T2DMC 發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮重要生理病理功能，且外周血中存在豐富、穩(wěn)定表達(dá)的miRNA，是一類新型的T2DM 及其相關(guān)并發(fā)癥潛在生物標(biāo)志物[9-10]。同時，脂代謝異常作為T2DM發(fā)生的危險因素，亦與T2DMC 發(fā)生密切相關(guān)，且外周血血脂異常與miRNA 特別是循環(huán)miRNA表達(dá)異常同樣存在相關(guān)性，二者可共同作用參與T2DMC 發(fā)生發(fā)展。但目前關(guān)于外周血miRNA 及異常脂蛋白與T2DMC 關(guān)系的研究仍較少，二者聯(lián)合檢測作為T2DMC 生物標(biāo)志物的研究未見報道。本研究針對在胰島β 細(xì)胞和微血管內(nèi)皮細(xì)胞生理病理功能中發(fā)揮重要作用的miR-152，發(fā)現(xiàn)其在T2DM 及T2DMC患者血清中表達(dá)水平較對照顯著升高，且在T2DMC患者升高更為顯著，是T2DMC患者潛在的診斷標(biāo)志物。同時，與健康對照相比，β2-GPI-ox-LDL和β2-GPI-Lp(a)水平在T2DM 和T2DMC患者血清也顯著升高。miR-152聯(lián)合β2-GPI-ox-LDL和β2-GPI-Lp(a) 對于T2DMC診斷具有較高的敏感度和特異度，其診斷價值明顯優(yōu)于單一指標(biāo)檢測，可有效彌補單指標(biāo)檢測不足，三者聯(lián)合檢測是T2DMC 具有潛在應(yīng)用價值的診斷標(biāo)志物。

本研究發(fā)現(xiàn)miR-152 在T2DM 及T2DMC患者血清中表達(dá)水平較對照均顯著升高，且在T2DMC患者升高更為顯著，提示其既參與T2DM 發(fā)生發(fā)展，又與微血管內(nèi)皮損傷密切相關(guān)。研究顯示，miR-152對于胰島素分泌具有重要調(diào)節(jié)作用，高血糖患者和糖尿病大鼠胰島組織中miR-152的表達(dá)水平均明顯上調(diào)，進(jìn)一步分子機制研究發(fā)現(xiàn)miR-152 可通過抑制丙酮酸脫氫酶E1α 和葡萄糖激酶表達(dá)，導(dǎo)致胰島β 細(xì)胞內(nèi)ATP/ADP 比例降低，進(jìn)而引起β 細(xì)胞分泌能力降低、細(xì)胞功能障礙和T2DM的發(fā)生[11]。同時，經(jīng)二甲雙胍藥物治療后的T2DM患者血漿miR-152水平與治療前相比顯著降低，也進(jìn)一步證實miR-152表達(dá)與β 細(xì)胞分泌功能及胰島素水平密切相關(guān)[12]。miR-152 還被報道與T2DM 微血管并發(fā)癥的發(fā)生相關(guān)。XU 等[13]發(fā)現(xiàn)，miR-152 可通過調(diào)控同源性磷酸酶-張力蛋白（PTEN）參與糖尿病足損傷發(fā)生發(fā)展，抑制miR-152的表達(dá)可促進(jìn)糖尿病足損傷修復(fù)。ROUX 等[14]發(fā)現(xiàn)糖尿病腎病患者血漿miR-152水平較T2DM患者及健康對照明顯升高，且與血漿滲透壓呈現(xiàn)出顯著正相關(guān)，miR-152 可能通過調(diào)控SLC5A3 蛋白表達(dá)影響血漿滲透壓，進(jìn)而參與糖尿病腎病發(fā)生。此外，miR-152 還可通過調(diào)控血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）和轉(zhuǎn)化生長因子β1（TGFβ1）的表達(dá)抑制人視網(wǎng)膜內(nèi)皮細(xì)胞（human retinal endothelial cells，hRECs）和視網(wǎng)膜微血管內(nèi)皮細(xì)胞（retinal microvascular endothelial cell line，hRMECs）增殖和血管新生，導(dǎo)致糖尿病視網(wǎng)膜病變的發(fā)生[15]。

脂代謝異常是T2DM 及T2DMC 發(fā)生發(fā)展的主要危險因素[16]。本研究發(fā)現(xiàn)β2-GPI-ox-LDL和β2-GPI-Lp(a)水平在T2DM 和T2DMC患者血清顯著升高，其可能與患者高糖高脂導(dǎo)致的氧化應(yīng)激壓力有關(guān)，并在糖尿病微血管病變發(fā)生過程中發(fā)揮重要病理作用。既往研究顯示，腎病綜合征患兒和急性冠脈綜合征患者血清β2-GPI-ox-LDL和β2-GPILp(a)升高，與血管內(nèi)皮損傷相關(guān)[17-18]。本研究結(jié)果則發(fā)現(xiàn)T2DM患者β2-GPI-ox-LDL和β2-GPILp(a)升高，且在T2DMC患者升高更為顯著，也進(jìn)一步證實了二者與糖尿病微血管病變發(fā)生密切相關(guān)。本研究還發(fā)現(xiàn)，血清miR-152，β2-GPI/ox-LDL和β2-GPI-Lp(a)組合與LDL水平呈正相關(guān)，提示三者可能存在交互作用，共同參與糖尿病及其微血管病變發(fā)生。FAN 等[5]研究發(fā)現(xiàn)，miR-152 可通過調(diào)控脂肪酶表達(dá)抑制脂肪前體細(xì)胞增殖，促進(jìn)細(xì)胞分化，脂肪形成和肌內(nèi)脂肪形成；YANG 等[19]發(fā)現(xiàn)上調(diào)乳腺上皮細(xì)胞miR-152表達(dá)可顯著促進(jìn)三酰甘油形成。上述研究均提示高表達(dá)miR-152 與脂代謝異常相關(guān)。同時，脂代謝異常亦可導(dǎo)致miR-152表達(dá)上調(diào)。WU 等[20]發(fā)現(xiàn)，肥胖患者血清miR-152水平較健康對照顯著升高。本研究發(fā)現(xiàn)，miR-152聯(lián)合β2-GPI-ox-LDL和β2-GPI-Lp(a) 對于T2DMC診斷價值明顯優(yōu)于單一指標(biāo)檢測，也進(jìn)一步提示了miR-152，β2-GPI-ox-LDL和β2-GPI-Lp(a)可能相互促進(jìn)和調(diào)節(jié)，共同參與T2DM 和T2DMC的發(fā)生、發(fā)展，但其具體分子機制仍需后續(xù)深入研究。

綜上所述，T2DM 和T2DMC患者血清miR-152，β2-GPI-ox-LDL和β2-GPI-Lp(a)水平較健康對照均顯著升高，三者聯(lián)合檢測對于T2DMC 診斷具有較高的靈敏度和特異度，可有效彌補單指標(biāo)檢測不足，是T2DMC 潛在的輔助診斷標(biāo)志物，同時，miR-152，β2-GPI-ox-LDL和β2-GPI-Lp(a)可能相互促進(jìn)和調(diào)節(jié)，共同參與T2DM 和T2DMC的發(fā)生發(fā)展。