陳龍梅，楊振華（上海市寶山區(qū)中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院檢驗(yàn)科，上海 201900）

類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis,RA）主要累及周圍關(guān)節(jié)，可導(dǎo)致多處周邊關(guān)節(jié)畸形[1]。因機(jī)體的免疫細(xì)胞的異常增殖以及自身凋亡動態(tài)的失衡，同時激活了異常的氧化應(yīng)激，導(dǎo)致多種信號傳導(dǎo)通路失衡，從而引起了RA 疾病的發(fā)生發(fā)展[2]。隨著大數(shù)據(jù)時代的到來，迎來了基因芯片數(shù)據(jù)的大量發(fā)展[3]，各種疾病包括RA的基因表達(dá)譜也得到了學(xué)者的重視。長鏈非編碼RNA(long non-coding RNA,lncRNA)是一類非編碼但在調(diào)控蛋白合成過程中有著不可或缺功能的RNA，它主要通過特異性地結(jié)合其他基因或蛋白質(zhì)從而起到重要的生物學(xué)作用[4]。夏燕等人[5]注意到有多條lncRNA 能夠影響RA患者，本研究擬通過從GEO（gene expression omnibus）數(shù)據(jù)庫下載并整理有關(guān)RA的生物信息分析的lncRNA 基因微陣列數(shù)據(jù)，通過分析差異表達(dá)的LncRNA，探討LncRNA 在RA 發(fā)生發(fā)展的作用，從而探索RA 新的治療靶點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 芯片數(shù)據(jù)來源 通過GEO(gene expression omnibus)數(shù)據(jù)庫，以“Rheumatoid arthritis”為關(guān)鍵詞搜索目標(biāo)，經(jīng)篩選后，采用由Xu D 等提交以GPL20115為平臺的基因芯片GSE94519，包含由3例RA患者(GSM2477389～GSM2477391) 和3例健康人(GSM2477392～GSM2477394)構(gòu)成的6例樣本，均為LncRNA表達(dá)譜數(shù)據(jù)。

1.2 RA的差異表達(dá)基因分析 應(yīng)用GEO數(shù)據(jù)庫的在線分析工具GEO2R 進(jìn)行分析，GEO2R 采用了R 語言中GEOquery 以及l(fā)imma 程序包，再以P<0.05，|logFC>1.5|為篩選條件，挑選RA的差異表達(dá)基因。

1.3 RA差異基因的功能分析 采用DAVID 在線分析工具（https://david.ncifcrf.gov/)對差異基因開展GO 功能注釋和KEGG 信號通路富集分析。GO 功能主要包括三個方面，分別是生物學(xué)過程（biological process,BP），細(xì)胞定位（cellular component,CC）和分子功能（molecular function,MF）。

1.4 RA的差異表達(dá)基因所調(diào)控蛋白互作網(wǎng)絡(luò)與關(guān)鍵基因分析 通過蛋白質(zhì)相互作用數(shù)據(jù)庫STRING11.0（https://sring-db.org/)探索RA差異基因間編碼的蛋白質(zhì)間的關(guān)系，并建立它們間蛋白質(zhì)互作網(wǎng)絡(luò)（protein protein interaction network，PPI）。并將PPI結(jié)果在Cytoscape 軟件中打開編輯，以cytoHubba模塊計(jì)算PPI 網(wǎng)絡(luò)節(jié)點(diǎn)的前10 名蛋白網(wǎng)絡(luò)中有較高連接度的hub 基因。

2 結(jié)果

2.1 RA差異基因 根據(jù)RA差異基因的篩選條件，在GSE94519 基因芯片中共有差異表達(dá)基因278個，其中上調(diào)54個，下調(diào)224個，其火山圖見圖1。按照差異倍數(shù)logFC 大小排序，前三個上調(diào)基因?yàn)槲⒐芟嗷プ饔煤瓦\(yùn)輸1（MITD1），乙酰輔酶A 羧化酶α（ACACA），損傷特異性DNA 結(jié)合蛋白1（DDB1）；前三個下調(diào)基因?yàn)樯窠?jīng)肽原（NPTN），原肌球蛋白α（TPM1），凝血因子XIII，A1 多肽（F13A1）。

圖1 RA差異基因火山圖

2.2 RA差異表達(dá)基因的GO 功能和調(diào)控通路分析 RA差異基因在DAVID6.8 中的GO 功能和KEGG 通路分析見表1。GO 功能在BP 中主要過程為血小板脫顆粒、病毒過程、氧化還原過程、GTPase 活性正調(diào)節(jié)，在CC 主要存在于胞外小體、胞漿、薄膜及細(xì)胞質(zhì)，在MF 主要發(fā)揮GTPase 活性、泛素蛋白連接酶結(jié)合、鈣黏蛋白結(jié)合參與細(xì)胞間黏附和GTP連接功能。調(diào)控的信號主要為調(diào)節(jié)氧化磷酸化以及帕金森病的信號通路。

2.3 RA差異表達(dá)基因所調(diào)控蛋白互作網(wǎng)絡(luò)與關(guān)鍵基因分析 除去孤立無關(guān)系的蛋白節(jié)點(diǎn)，以RA差異表達(dá)基因構(gòu)建蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)，互作關(guān)系的蛋白質(zhì)共251個，構(gòu)成495條復(fù)雜的PPI 網(wǎng)絡(luò)，將網(wǎng)絡(luò)在Cytoscape 軟件中進(jìn)行可視化，見圖2。通過cytohubba 插件確認(rèn)Hub 基因，結(jié)果顯示Hub基因分別為ACTB，RHOA，PPBP，B2M，MTCYB，PF4，CFL1，MT-ATP6，VCL和TPM1，數(shù)據(jù)顯示它們之間可能存在較強(qiáng)的相互作用關(guān)系。

3 討論

RA 由于其高致殘率而引起了社會的廣泛關(guān)注，但其致病機(jī)制尚不明確[6]。RA 嚴(yán)重影響著患者的生活質(zhì)量，所以進(jìn)一步尋找有助于RA 早期診斷和治療的分子靶點(diǎn)至關(guān)重要。在本研究中，我們使用了GEO2R 在線工具分析了GEO 中的芯片數(shù)據(jù)GSE94519 共包含了3例RA患者和3例健康人構(gòu)成的6例樣本。根據(jù)篩選條件得到了278個差異表達(dá)基因，通過DAVID6.8 對差異基因進(jìn)行GO 功能注釋和KEGG 信號通路分析發(fā)現(xiàn)差異基因主要參與了血小板脫顆粒、病毒過程、氧化還原過程、GTPase 活性正調(diào)節(jié)的轉(zhuǎn)導(dǎo)過程和調(diào)控氧化磷酸化和帕金森病等通路。

表1 RA差異基因的GO 功能和調(diào)控信號通路的前20個基因

運(yùn)用蛋白互作數(shù)據(jù)庫STRING11.0 以及Cytoscape 軟件分析差異基因，發(fā)現(xiàn)Hub 基因分別為ACTB，RHOA，PPBP，B2M，MT-CYB，PF4，CFL1，MT-ATP6，VCL，TPM1。β-肌動蛋白（β-actin，ACTB）是一種細(xì)胞骨架肌動蛋白，其蛋白表達(dá)與血小板聚集、凝血、纖維蛋白凝塊形成相關(guān)[7]。RHOA 蛋白是小G 蛋白超家族的亞家族成員之一，具有GTP 酶活性，其相關(guān)的信號通路在RA患者關(guān)節(jié)成纖維樣滑膜細(xì)胞(FLS)遷移、侵襲、增殖的調(diào)控作用較多地被研究[8]。原血小板堿性蛋白（Pro-Platelet basic protein，PPBP）又名趨化因子7（C-X-C motif chemokine ligand 7,CXCL7）或中性粒細(xì)胞活化肽2（neutrophil-activating peptide-2，NAP-2），為CXC 趨化因子家族的血小板衍生生長因子，能夠促進(jìn)淋巴細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞激活，誘導(dǎo)炎癥應(yīng)答，且PPBP 在RA 滑膜液中表達(dá)出現(xiàn)下調(diào)[9]。B2M 基因在人體中編碼β2 微球蛋白，RA患者的血β2 微球蛋白高于正常人群，這可能與RA的炎癥途徑有關(guān)[10]。血小板第4 因子（platlet factor 4，PF4）是由血小板α 顆粒合成的一種特異蛋白質(zhì)，可促進(jìn)滑漠細(xì)胞的增殖與局部抗體的產(chǎn)生等作用，參與RA的免疫應(yīng)答和趨化因子信號通路[11]，通過與其它細(xì)胞因子相互作用介導(dǎo)RA 發(fā)生發(fā)展中骨及軟骨的破壞。MT-ATP6是線粒體ATP 合酶亞基6 基因，它是線粒體能量合成過程中的一個關(guān)鍵酶，根據(jù)功能有學(xué)者預(yù)測認(rèn)為MT-ATP6 具有潛在的RA 致病性[12]，篩選出的Hub 基因中MT-CYB，CFL1，VCL和TPM1 目前尚未找到相關(guān)的研究，有可能是RA 潛在的早期診斷的基因靶點(diǎn)，為后續(xù)的研究打下基礎(chǔ)。

本研究是通過探索GEO數(shù)據(jù)庫中的芯片GSE94519 數(shù)據(jù)，從而得到RA的Hub 基因，從而進(jìn)一步研究RA的發(fā)病機(jī)制、功能和通路分析為RA的發(fā)生發(fā)展尋找新的作用靶點(diǎn)提供了新的思路。