張妍妍，馮宇飛，肖洪彬

(黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)，哈爾濱 150040)

類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(RA)是一種自身免疫性疾病，可發(fā)生于任何年齡段，影響患者的關(guān)節(jié)和運(yùn)動系統(tǒng)，且常累及腎臟、心臟和呼吸系統(tǒng)，具有較高的致殘率[1]。流行病學(xué)研究表明，我國RA的發(fā)病率為0.42%[2]，該病不僅降低了患者的生活質(zhì)量，而且給患者家庭和社會帶來了極大的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。

迄今為止，RA的確切病因尚未完全闡明，目前的治療主要以藥物和手術(shù)為主，配以適當(dāng)?shù)睦懑?。中醫(yī)藥治療RA經(jīng)驗(yàn)豐富、療效獨(dú)特，且安全性高[3-4]。伸筋草別名過山龍，根部及全草皆可入藥，其性溫、味辛、苦，具有消腫、除風(fēng)濕、祛風(fēng)散寒、舒筋活絡(luò)之功效，臨床主治風(fēng)寒濕痹導(dǎo)致的關(guān)節(jié)酸痛，效果令人滿意[5-6]。本課題組前期研究結(jié)果表明，伸筋草總生物堿可通過降低RA大鼠脾臟淋巴細(xì)胞的增殖和炎性浸潤而發(fā)揮治療作用。本研究采用免疫印跡(Western Blot)法、酶聯(lián)免疫吸附(Elisa)法探討伸筋草總生物堿對弗氏佐劑所致RA大鼠滑膜組織白細(xì)胞介素-1受體相關(guān)激酶(IRAK1)/腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子-6(TRAF6)/核轉(zhuǎn)錄因子-κB(NF-κB)信號通路的影響。

1 儀器與材料

1.1儀器 1658033型電泳儀，美國Bio-rad公司；Tanon 4800 Multi型凝膠電泳成像分析系統(tǒng)，北京原平皓生物技術(shù)有限公司；DB066型足趾容積測量儀，北京智鼠多寶生物科技有限責(zé)任公司；AP-HX型恒溫箱，東莞市愛佩試驗(yàn)設(shè)備有限公司；EPOCH型酶標(biāo)儀，BioTek公司；TGL16M型低溫離心機(jī)，長沙湘智離心機(jī)儀器有限公司。

1.2試藥 伸筋草藥材(批號170110)，哈藥集團(tuán)世一堂中藥飲片有限責(zé)任公司；伸筋草總生物堿提取物，實(shí)驗(yàn)室自制；乙酸(國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)；水合氯醛(天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司)；甲氨蝶呤(HPLC級，批號100138-201804)，上海銘博生物科技有限公司；牛Ⅱ型膠原(批號150342)，Chondrex公司；弗氏佐劑(批號1002036152)，Sigma公司；大鼠γ干擾素(IFN-γ，批號K1052-100)和白細(xì)胞介素-1β(IL-1β，批號K4796-100)Elisa 試劑盒，均購自Biovision公司；兔抗大鼠IRAK1、TRAF6和NF-κB p65一抗，Abcam公司；Trizol(批號135306)，Ambion公司。

1.3動物 清潔級雄性Wistar大鼠，6～7月齡，體質(zhì)量為(230±25) g，由黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)GLP實(shí)驗(yàn)動物中心提供，實(shí)驗(yàn)動物許可證號：SCXK(吉)-2018-0007。實(shí)驗(yàn)環(huán)境控制在每12 h明暗自動切換，自動換氣，溫度為(25±2) ℃，相對濕度在45%～75%范圍內(nèi)。

2 方法

2.1伸筋草總生物堿溶液的制備 取伸筋草藥材粗粉，加2 ml·L-1的鹽酸滲漉提取，將滲漉液分別調(diào)節(jié)pH值至4、7進(jìn)行梯度沉淀，過濾后，濾液上001×7陽離子交換樹脂柱，先用水洗至中性，再用50 mL·L-1的氨水洗脫，洗脫液減壓回收、烘干，即得伸筋草總生物堿提取物。取上述伸筋草總生物堿提取物，加適量生理鹽水配制成質(zhì)量濃度為0.2 mg·mL-1的伸筋草總生物堿溶液。

2.2大鼠RA模型的制備 將牛Ⅱ型膠原用0.1 mol·L-1的乙酸溶解，配制成質(zhì)量濃度為2 mg·mL-1的牛Ⅱ型膠原乙酸溶液，按照1∶1的比例加入弗氏佐劑配制成弗氏完全佐劑的乳劑，備用。用100 g·L-1的水合氯醛以3 mL·kg-1腹腔注射麻醉大鼠，仰位固定。3個(gè)定點(diǎn)部位(右后足趾、尾部、背部)注射弗氏完全佐劑的乳劑，注射劑量為0.05 mL·部位-1·次-1[7]。首次皮下注射10 d后，重復(fù)注射1次，劑量和注射部位與第1次相同，以激發(fā)大鼠免疫反應(yīng)[8]。第2次注射弗氏佐劑后于第3 天觀察實(shí)驗(yàn)動物耳緣、后趾和尾部腫脹情況，以出現(xiàn)顯著的炎性結(jié)節(jié)、表皮紅腫為大鼠RA造模成功，未造模成功的大鼠被剔除。

2.3分組及給藥 模型復(fù)制前，采用足趾容積測量儀測定每只大鼠右后踝關(guān)節(jié)體積作為基線V0。將造模成功的40只Wistar大鼠隨機(jī)分為模型組、陽性對照組和伸筋草高、低劑量組，每組10只，另加入10只大鼠按照2.2項(xiàng)下造模方法每次注射等體積生理鹽水，作為正常組。分組后次日各組大鼠開始灌胃給藥，給藥前采用足趾容積測量儀測定每只大鼠右后踝關(guān)節(jié)體積V1。陽性對照組每日給予甲氨蝶呤溶液0.5 mg·kg-1(以甲氨蝶呤計(jì))，伸筋草高、低劑量組每日給予伸筋草總生物堿溶液8、4 mg·kg-1(以伸筋草總生物堿提取物計(jì))，正常組和模型組大鼠每日同一時(shí)間給予等體積的生理鹽水，連續(xù)給藥3周。

2.4取材及檢測 各組大鼠末次給藥后次日給予100 g·L-1水合氯醛麻醉(3 mL·kg-1)，用足趾容積測量儀測定各組大鼠右后踝關(guān)節(jié)體積V2，計(jì)算出大鼠踝關(guān)節(jié)腫脹程度D=(V2-V0)÷V0×100%。毛細(xì)管眼底眶靜脈叢穿刺取血1 mL后，脫頸處死，取右后踝關(guān)節(jié)，鈍性剝離踝關(guān)節(jié)滑膜組織，低溫保存。靜脈血靜置15 min，在低溫離心機(jī)中以3 000 r·min-1離心10 min后，取上層血清，用Elisa法測定IL-1β和IFN-γ水平。取出低溫保存的大鼠滑膜組織，粉碎后在液氮中研磨，加入細(xì)胞裂解液低溫靜置30 min，在低溫離心機(jī)中以10 000 r·min-1離心10 min，收集上清液，進(jìn)行SDS-PAGE電泳，蛋白上樣量為50 μg，電轉(zhuǎn)到PVDF膜，用TBST漂洗后加入50 g·L-1的脫脂奶粉，密封避光孵育2 h，反復(fù)漂洗3次，分別加入一抗(IRAK1、TRAF6、NF-κB p65的1∶500稀釋液)4 ℃恒溫溫育過夜。于次日反復(fù)漂洗3次后，加入二抗稀釋液，TBST漂洗3次后，將PVDF膜置于ECL顯色液中曝光，采用凝膠電泳成像自動分析系統(tǒng)對灰度值進(jìn)行定量分析。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1伸筋草總生物堿對RA大鼠踝關(guān)節(jié)腫脹程度變化的影響 結(jié)果見表1。由表1可知，與正常組比較，模型組、陽性對照組和伸筋草高、低劑量組給藥前大鼠踝關(guān)節(jié)腫脹極為明顯(P<0.05)。與模型組比較，伸筋草高、低劑量組和陽性對照組給藥3周后大鼠踝關(guān)節(jié)腫脹程度均有不同程度的緩解(P<0.05)。

表1 伸筋草總生物堿對RA大鼠踝關(guān)節(jié)腫脹程度變化的影響Tab.1 Effect of Lycopodium clavatum alkaloids on the degree of ankle swelling in RA rats

3.2伸筋草總生物堿對RA大鼠IRAK1、TRAF6、NF-κB p65蛋白表達(dá)的影響 結(jié)果見圖1和表2。由圖1和表2可知，與正常組比較，模型組IRAK1、TRAF6和NF-κB p65的蛋白表達(dá)均明顯升高(P<0.05)；與模型組比較，伸筋草高、低劑量組IRAK1、TRAF6和NF-κB p65蛋白表達(dá)顯著降低(P<0.05)，且呈一定的量效關(guān)系。

圖1 Western Blot電泳圖Fig.1 Western Blot electrophoretogram

表2 伸筋草總生物堿對RA大鼠IRAK1、TRAF6和NF-κB p65蛋白表達(dá)的影響Tab.2 Effect of Lycopodium clavatum alkaloids on the protein expression of IRAK1，TRAF6 and NF-κB p65 proteins in RA rats

3.3伸筋草總生物堿對RA大鼠血清中IL-1β和IFN-γ水平的影響 結(jié)果見表3。由表3可知，與正常組相比，模型組大鼠血清中IL-1β和IFN-γ水平顯著升高(P<0.05)；與模型組相比，伸筋草高劑量組大鼠血清中IL-1β和IFN-γ水平顯著下降(P<0.05)，伸筋草低劑量組IL-1β水平顯著降低(P<0.05)，IFN-γ水平雖有下降的趨勢，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

表3 伸筋草總生物堿對RA大鼠血清中IL-1β、IFN-γ水平的影響Tab.3 Effect of Lycopodium clavatum alkaloids on serum levels of IL-1β and IFN-γ in RA rats

4 討論

皮下注射弗氏佐劑是經(jīng)典的RA大鼠造模方法，該方法成模率高，模型復(fù)制穩(wěn)定，持續(xù)時(shí)間長，且與人類RA的發(fā)病特點(diǎn)相似，廣泛用于基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)研究[9]。本研究首先通過容積排水法驗(yàn)證了伸筋草總生物堿具有明確的降低弗氏佐劑誘導(dǎo)的RA大鼠踝關(guān)節(jié)腫脹的作用，實(shí)驗(yàn)結(jié)果為后續(xù)的機(jī)制研究奠定了藥效學(xué)基礎(chǔ)。

NF-κB的活化會激活免疫反應(yīng)，促進(jìn)下游如IL-1β、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)等炎性因子的釋放[10-11]。NF-κB p65是最早發(fā)現(xiàn)的NF-κB家族成員之一，其蛋白表達(dá)與RA滑膜組織的病變密切相關(guān)。IRAK1是NF-κB信號通路中的接頭分子，可介導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)炎性發(fā)生的信號通路[12]。研究表明，通過抑制IRAK1可明顯降低白細(xì)胞介素-6 (IL-6)、IL-1β等炎性因子的釋放，進(jìn)而防止過度的炎性反應(yīng)[13-14]。TRAF6是一種連接酶，活化后會形成具有特異性受體功能的短鏈蛋白，可同時(shí)與IRAK1、NF-κB分子相結(jié)合[15]，將三者連接起來，啟動細(xì)胞內(nèi)炎性反應(yīng)的信號[16]。因此，TRAF6的表達(dá)可間接反映NF-κB信號通路的活躍程度[17]。本研究結(jié)果表明，伸筋草總生物堿可通過抑制IRAK1、TRAF6、NF-κB p65的蛋白表達(dá)來降低IRAK1/TRAF6/NF-κB信號通路的活躍程度。

IL-1β是NF-κB信號通路中下游重要的炎性因子，與RA的發(fā)病密切相關(guān)[18]，同時(shí)，IL-1β又可反向激活NF-κB，通過正反饋?zhàn)饔么龠M(jìn)更多的炎性因子產(chǎn)生[19]，進(jìn)而造成惡性循環(huán)。IFN-γ是由輔助性T1細(xì)胞(Th1)分泌的細(xì)胞因子，不僅可以激活巨噬細(xì)胞和自然殺傷細(xì)胞并提高抗原遞呈能力，還能抑制輔助性T2細(xì)胞(Th2)分泌抗炎因子來加強(qiáng)RA的自身免疫炎性反應(yīng)[20]。Elisa實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，伸筋草總生物堿可有效降低血清中IL-1β和IFN-γ水平。

綜上所述，伸筋草總生物堿可降低RA大鼠踝關(guān)節(jié)的腫脹，其作用機(jī)制與抑制IRAK1/TRAF6/NF-κB信號通路及其下游炎性因子的分泌密切相關(guān)。