張 妍，李 瑤，趙亞妮，許 璐，袁佳妮，安軍明，王四旺*

(1.陜西中醫(yī)藥大學(xué)針灸推拿學(xué)院，咸陽 712046；2.西北大學(xué)生命科學(xué)與醫(yī)學(xué)部，西安 710069；3.空軍軍醫(yī)大學(xué)藥學(xué)系中藥與天然藥物學(xué)教研室，西安 710032；4.西安市中醫(yī)醫(yī)院針灸科，西安 710021)

高尿酸血癥是機(jī)體內(nèi)嘌呤代謝紊亂引發(fā)的一種代謝性疾病，以尿酸(UA)升高為主要特征。UA水平升高主要有生成過多和(或)排泄不足2種途徑[1-2]。芒果苷又名芒果素、知母寧，是芒果葉中的主要活性成分，可從百合科植物知母中提取[3-4]。梔子苷是從梔子中提取得到的主要有效成分，具有促進(jìn)膽汁和胰腺分泌、改善肝臟和胃腸功能、增強(qiáng)機(jī)體抗病能力等功效[5-6]。山柰酚屬于黃酮類化合物，主要來源于姜科植物山柰的根和莖，具有抗菌、抗炎、抗氧化和抗腫瘤等藥理作用[7-8]。芒果苷、山柰酚和梔子苷均可降低高尿酸血癥動物模型UA水平[9-12]。本研究采用酵母聯(lián)合腺嘌呤飼料喂養(yǎng)的造模方法，旨在對比觀察不同劑量的芒果苷、山柰酚和梔子苷對高尿酸血癥小鼠的降UA作用和對血清黃嘌呤氧化酶(XOD)的影響，同時(shí)測定給藥2周后小鼠血清肌酐(Cr)、尿素氮(BUN)水平以及胸腺、脾臟和腎臟指數(shù)，以評判對小鼠腎功能及免疫器官的影響，HE染色觀察對腎臟組織的病理變化。

1 儀器與材料

1.1儀器 RT-9600型半自動生化分析儀(深圳雷杜生命科學(xué)股份有限公司)；電子分析天平(德國賽多利斯天平公司)；Biofuge Primo R型多用途臺式高速離心機(jī)(德國Heraeus公司)；SpectraMax 190型酶標(biāo)儀(美國Molecular Devices公司)；XK96-A型快速混勻器(姜堰市新康醫(yī)療器械有限公司)。

1.2試藥 芒果苷(質(zhì)量分?jǐn)?shù)>98.08%，批號SH181018-2)，陜西桑禾生物科技有限公司；山柰酚(質(zhì)量分?jǐn)?shù)>98.23%，批號HK20180610)，陜西慧科植物開發(fā)有限公司；梔子苷(質(zhì)量分?jǐn)?shù)>99.5%，批號DNYF1904065)，西安岳達(dá)生物科技有限公司；酵母粉，英國OXOID公司；腺嘌呤，北京索萊寶科技有限公司；UA、BUN測定試劑盒，上海榮盛生物藥業(yè)有限公司；Cr、XOD測定試劑盒，南京建成生物工程研究所。

1.3動物 SPF級雄性昆明種小鼠120只，體質(zhì)量為28～32 g，購自空軍軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物研究中心(動物許可證號：SCXK(軍)2012-0007)；正常攝食飲水，保持在25 ℃，相對濕度40%，12 h光照黑暗周期循環(huán)，適用性飼養(yǎng)1周后用于實(shí)驗(yàn)；所需飼料和舒克貝塔SPF級精選刨花墊料，均購于江蘇省協(xié)同醫(yī)藥生物工程有限責(zé)任公司。

2 方法

2.1高嘌呤飼料的制備 將酵母粉和腺嘌呤拌入粉碎的顆粒飼料中，混勻，重壓成型。酵母粉在飼料中的含量為10%，腺嘌呤在飼料中的含量為0.1%[13-15]。

2.2高尿酸血癥模型的建立、分組及給藥 將120只雄性昆明種小鼠適用性飼養(yǎng)1周后，隨機(jī)分組：空白組，模型組，別嘌醇組(20 mg·kg-1)，芒果苷低、中、高劑量組(7.5、15、30 mg·kg-1)，山柰酚低、中、高劑量組(7.5、15、30 mg·kg-1)，梔子苷低、中、高劑量組(7.5、15、30 mg· kg-1)，每組各10只。模型組及各給藥組給予高嘌呤飼料，空白組給予普通飼料，各組均灌胃給藥，空白組與模型組均給予等體積生理鹽水，每日給藥1次，連續(xù)給藥14 d，記錄小鼠的攝食飲水情況及實(shí)驗(yàn)前后的體質(zhì)量。

2.3小鼠血清相關(guān)指標(biāo)的測定 末次給藥后，小鼠禁食不禁水24 h，各組小鼠摘眼球取血，室溫靜置2 h，在4 ℃條件下以3 500 r·min-1離心15 min，吸取上層血清。按照試劑盒說明書分別檢測小鼠血清中UA、BUN、Cr含量及XOD活性。

2.4小鼠胸腺、腎臟和脾臟指數(shù)的測定 取血后采用斷頸法處死小鼠，快速分離小鼠胸腺、脾臟及雙側(cè)腎臟，稱定質(zhì)量，計(jì)算臟器指數(shù)。胸腺指數(shù)=胸腺質(zhì)量÷小鼠禁食后體質(zhì)量×100%；脾臟指數(shù)=脾臟質(zhì)量÷小鼠禁食后體質(zhì)量×100%；腎臟指數(shù)=腎臟質(zhì)量÷小鼠禁食后體質(zhì)量×100%[16-17]。

2.5腎臟組織的病理學(xué)觀察 稱定腎臟質(zhì)量后，用100 g·L-1甲醛固定腎臟組織，常規(guī)石蠟包埋并制片，HE染色，光鏡下觀察腎臟組織的病理學(xué)變化。

3 結(jié)果

3.1不同劑量芒果苷、山柰酚和梔子苷對高尿酸血癥小鼠一般情況的影響 實(shí)驗(yàn)期間，與空白組比較，模型組及別嘌醇組小鼠出現(xiàn)食欲不振、飲水增多、體質(zhì)量增長緩慢、精神萎靡等癥狀，芒果苷、山柰酚和梔子苷各劑量組小鼠攝食飲水及體質(zhì)量增長情況良好。

3.2不同劑量芒果苷、山柰酚和梔子苷對高尿酸血癥小鼠血清中UA、Cr和BUN含量的影響 見表1。由表1可知，與空白組相比，模型組小鼠血清中UA和Cr含量顯著升高(P<0.01)，BUN含量有升高趨勢但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；與模型組比較，芒果苷、山柰酚和梔子苷各劑量組及別嘌醇組血清UA含量均明顯下降(P<0.05)，別嘌醇組血清Cr和BUN含量顯著升高(P<0.01)。

表1 芒果苷、山柰酚和梔子苷對高尿酸血癥小鼠血清中UA、Cr和BUN含量的影響Tab.1 Effects of different doses of mangiferin，kaempferol and gardenin on blood UA，Cr and BUN in hyperuricemia mice

3.3芒果苷、山柰酚和梔子苷各劑量組對高尿酸血癥小鼠血清中XOD活性的影響 見表2。由表2可知，與空白組比較，模型組小鼠血清中XOD活性顯著升高(P<0.01)；與模型組比較，芒果苷高劑量組，山柰酚低、中、高劑量組，梔子苷中、高劑量組以及別嘌醇組血清XOD活性明顯降低(P<0.05)。

表2 芒果苷、山柰酚和梔子苷各劑量組對高尿酸血癥小鼠血清中XOD活性的影響Tab.2 Effects of different doses of mangiferin,kaempferol and gardenin on xanthine oxidase activity in hyperuricemia mice

3.4芒果苷、山柰酚和梔子苷對高尿酸血癥小鼠胸腺、脾臟和腎臟指數(shù)的影響 見表3。由表3可知，與空白組相比，模型組小鼠胸腺、脾臟和腎臟指數(shù)差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；與模型組比較，別嘌醇組脾臟、腎臟指數(shù)明顯增大(P<0.01或P<0.05)。

表3 芒果苷、山柰酚和梔子苷各劑量組對高尿酸血癥小鼠胸腺、脾臟和腎臟指數(shù)的影響Tab.3 Effects of different doses of mangiferin，kaempferol and gardenin on thymus，spleen and renal index in hyperuricemia mice

3.5芒果苷、山柰酚和梔子苷對小鼠腎臟組織病理學(xué)的影響 見圖1。由圖1可知，與空白組相比，模型組腎小管擴(kuò)張，上皮細(xì)胞空泡變性，部分細(xì)胞紅染，管腔內(nèi)可見少量黃褐色尿酸鹽結(jié)晶。別嘌醇組腎小球囊壁層收縮，結(jié)構(gòu)不完整，腎小管擴(kuò)張明顯。芒果苷、山柰酚和梔子苷各劑量組較模型組均有所改善，腎小管內(nèi)無尿酸鹽結(jié)晶。

圖1 小鼠腎臟組織的病理學(xué)變化(×200)A.空白組；B.模型組；C.別嘌醇組；D.芒果苷低劑量組；E.芒果苷中劑量組；F.芒果苷高劑量組；G.山柰酚低劑量組；H.山柰酚中劑量組；I.山柰酚高劑量組；J.梔子苷低劑量組；K.梔子苷中劑量組；L.梔子苷高劑量組。Fig.1 Histopathological changes of kidney tissue (×200)A.blank group；B.model group；C.allopurinol group；D.mangiferin low dose group；E.mangiferin middle dose group；F.mangiferin high dose group；G.kaempferol low dose group；H.kaempferol middle dose group；I.kaempferol high dose group；J.gardenin low dose group；K.gardenin middle dose group；L.gardenin high dose group.

4 討論

高尿酸血癥是痛風(fēng)的生化基礎(chǔ)，也是代謝紊亂綜合征、心血管疾病和慢性腎臟疾病等獨(dú)立危險(xiǎn)因素[18-19]。過量的UA在體內(nèi)長期蓄積，會導(dǎo)致尿酸鹽結(jié)晶析出，沉積在腎及關(guān)節(jié)等部位，引起痛風(fēng)及腎臟疾病，因此維持UA在正常水平對預(yù)防痛風(fēng)及其他疾病具有重要的臨床意義。

研究結(jié)果顯示，模型組UA含量及XOD活性較空白組顯著增加，提示造模成功。本實(shí)驗(yàn)造模方法在相關(guān)文獻(xiàn)[20，13-15]及預(yù)實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，結(jié)合臨床高尿酸血癥病人因長期攝入高嘌呤飲食而形成UA持續(xù)升高的狀態(tài)，將酵母和腺嘌呤按照一定比例混入飼料中喂養(yǎng)小鼠。腺嘌呤屬于高嘌呤物質(zhì)，而酵母富含蛋白質(zhì)、核苷酸、B族維生素和酶等多種物質(zhì)，可在機(jī)體內(nèi)水解合成包含嘌呤堿類、嘧啶堿類等含氮有機(jī)堿、磷酸等尿酸的前體物質(zhì)，當(dāng)機(jī)體攝入大量的酵母膏及腺嘌呤時(shí)，便會干擾機(jī)體正常的嘌呤代謝，致使XOD活性增強(qiáng)，機(jī)體生成過多的UA[21]。芒果苷、山柰酚和梔子苷各劑量組及別嘌醇組均能顯著降低UA水平，其中山柰酚的降UA作用最佳。XOD是參與體內(nèi)嘌呤類化合物代謝的關(guān)鍵酶，廣泛存在于人體中，主要分布于肝臟中，隨著機(jī)體高嘌呤飲食攝入的增多，其活性逐漸升高，從而使肝細(xì)胞膜的通透性增加，導(dǎo)致細(xì)胞中XOD進(jìn)入血液循環(huán)，活性升高[22-23]。次黃嘌呤在XOD的催化下生成黃嘌呤，黃嘌呤進(jìn)一步經(jīng)XOD的氧化而轉(zhuǎn)化生成UA，因此，抑制XOD活性是治療高尿酸血癥的重要靶點(diǎn)。芒果苷高劑量組和山柰酚低、中、高劑量組及梔子苷中、高劑量組以及別嘌醇組血清XOD活性顯著下降，表明芒果苷、山柰酚和梔子苷可通過抑制血清XOD活性來降低UA水平，山柰酚對血清XOD活性的抑制最明顯，這可能與山柰酚競爭性抑制XOD活性有關(guān)[24]。

血清Cr和BUN是評判腎功能的重要指標(biāo)，模型組小鼠血清Cr顯著升高，提示該模型對腎臟有一定的損傷，可能是由于尿酸鹽沉積于腎臟引發(fā)的，芒果苷、山柰酚和梔子苷各劑量組較模型組血清Cr均有所下降，表明芒果苷、山柰酚和梔子苷對腎臟有一定的保護(hù)作用。但別嘌醇組小鼠血清Cr和BUN明顯升高，且遠(yuǎn)超于模型組，表明別嘌醇具有一定的腎毒性。

臟器指數(shù)結(jié)果表明，模型組小鼠胸腺、脾臟和腎臟指數(shù)與空白組比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但脾臟與腎臟指數(shù)有增大趨勢，別嘌醇組脾臟、腎臟指數(shù)明顯增大，提示脾臟、腎臟出現(xiàn)病變，而芒果苷、山柰酚和梔子苷各劑量組臟器指數(shù)基本正常。同時(shí)腎臟病理結(jié)果顯示，模型組小鼠腎小管擴(kuò)張，細(xì)胞紅染，可見少量黃褐色尿酸鹽沉積，芒果苷、山柰酚和梔子苷各劑量組較模型組均有所改善，但別嘌醇組腎小球囊壁層收縮，結(jié)構(gòu)不完整，腎小管擴(kuò)張明顯，表明別嘌醇組腎臟損害嚴(yán)重。

綜上所述，芒果苷、山柰酚和梔子苷均可通過抑制XOD活性對酵母聯(lián)合腺嘌呤飼料喂養(yǎng)的高尿酸血癥模型小鼠具有降UA作用，毒性和不良反應(yīng)小，對腎臟有一定的保護(hù)作用，其中山柰酚降UA效果最佳，可作為具有潛力的天然降UA藥物進(jìn)一步研究。