王文地，鄭玉婷，于冰莉，崔 潔，侯俊玲，3*，王文全，，3*

(1.北京中醫(yī)藥大學中藥學院，北京 102488；2.中國醫(yī)學科學院 北京協(xié)和醫(yī)學院 藥用植物研究所，北京 100193；3.中藥材規(guī)范化生產(chǎn)教育部工程研究中心，北京 102488)

慢性前列腺炎(CP)在成年男性中的患病率接近50%[1]，臨床表現(xiàn)為盆腔或生殖器疼痛、下尿路刺激和梗阻癥狀、精子質(zhì)量降低等[2-5]。國內(nèi)外研究者已建立的CP模型有微生物致病模型、化學刺激模型、免疫誘導模型、激素誘導模型和老齡動物自發(fā)模型等[6]。其中化學刺激模型操作方便，在國內(nèi)外研究中使用廣泛。

1 儀器與材料

1.1儀器 3K15型臺式離心機(德國Sigma公司)；FA2004N型電子分析天平(北京賽多利斯科學儀器有限公司)；120型全自動生化儀(日本東芝公司)；TEK-Ⅱ mini型血細胞分析儀(江西特康公司)；Multiskan FC型酶標儀(上海賽默飛世爾儀器有限公司)。

1.2試藥 角叉菜膠(批號1202A053)，北京索萊寶科技有限公司；消痔靈注射液(批號18103006，規(guī)格：10 mL∶0.4 g)，吉林省集安益盛藥業(yè)股份有限公司；注射用青霉素鈉(批號180601)，華北制藥集團動物保健品有限責任公司；氯化鈉注射液(批號SD19091407，規(guī)格：500 mL∶4.5 g)，山東華魯制藥有限公司；尿素氮、肌酐和葡萄糖(批號分別為20190701、20190901、20190901)，均購自北京北檢新創(chuàng)源生物技術(shù)有限公司。試劑盒：前列腺特異性抗原(PSA)，前列腺素E-2(PGE-2)，γ干擾素(IFN-γ)，白細胞介素6(IL-6)，腫瘤壞死因子α(TNF-α)(批號分別為20190609-30702A、20190609-30581B、ml064291、ml064292、ml002859)，均購自上海酶聯(lián)生物科技有限公司。中性甲醛溶液(批號20181212)，北京益利精細化學品有限公司；水合氯醛(批號20181017)，天津市福晨化學試劑廠。

1.3動物 SPF級雄性SD大鼠40只，體質(zhì)量為280～320 g，由斯貝福(北京)生物技術(shù)有限公司提供，許可證編號：SCXK(京)2019-0010。大鼠飼養(yǎng)在(22±2) ℃、相對濕度為55%±5%的層流氣流室中，每12 h交替明暗，標準飲食飲水，于常規(guī)條件下適用性飼養(yǎng)1周后用于實驗。

2 方法

2.12種造模方法穩(wěn)定性比較實驗 將24只SD雄性大鼠適用性飼養(yǎng)1周后隨機分為3組，分別為假手術(shù)組、角叉菜膠組和消痔靈組，每組8只，分籠喂養(yǎng)。在造模手術(shù)當天腹腔注射100 g·L-1的水合氯醛3 mL·kg-1，待大鼠麻醉后于下腹縱向開約1 cm切口，暴露膀胱背側(cè)前列腺及精液囊。假手術(shù)組大鼠立即縫合肌肉皮膚；角叉菜膠組大鼠給予10 g·L-1角叉菜膠生理鹽水，按照每只每側(cè)0.05 mL注入兩側(cè)精液囊內(nèi)，縫合肌肉皮膚；消痔靈組大鼠給予消痔靈注射液，按照每只每側(cè)0.06 mL注入大鼠前列腺兩背側(cè)葉，縫合肌肉皮膚。術(shù)后各組大鼠按照劑量25萬u·kg-1肌肉注射青霉素，每日1次，連續(xù)3 d。所有大鼠造模術(shù)后連續(xù)常規(guī)飼養(yǎng)7周，每周測量體質(zhì)量并記錄。在術(shù)后第1、3、5周禁食12 h后眼眶采血，術(shù)后第7周禁食12 h后腹主動脈取血，處死大鼠，仔細采集前列腺、腎、睪丸、脾和胸腺。計算各臟器指數(shù)，臟器指數(shù)=臟器質(zhì)量÷體質(zhì)量×100%。所有血樣靜置2 h后以4 000 r·min-1離心10 min，收集血清，于-80 ℃儲存，根據(jù)PSA、PGE-2的Elisa試劑盒說明書檢測各組大鼠血清中各指標的含量。

2.2角叉菜膠致大鼠CP模型評價實驗 將16只SD雄性大鼠適用性飼養(yǎng)1周后隨機分為假手術(shù)組和角叉菜膠組，每組8只，分籠飼養(yǎng)。角叉菜膠組與2.1項下角叉菜膠組造模方法一致。在術(shù)后第1、3周禁食12 h后眼眶采血，術(shù)后第5周禁食12 h后腹主動脈取血，處死大鼠并采集前列腺及腎，計算臟器指數(shù)。采集的全血樣本，用三分類血細胞分析儀檢測各組大鼠全血中白細胞計數(shù)(WBC)。血清根據(jù)PSA、IL-6、TNF-α和IFN-γ的Elisa試劑盒說明書檢測各組大鼠血清中各指標含量，并用全自動生化儀檢測血清中CREA、UREA和GLU的含量。

3 結(jié)果

3.12種造模方法維持時間比較 本文對角叉菜膠組和消痔靈組模型進行了比較研究，以PSA和PGE-2為指標，對比造模后各時間點的指標水平，見表1。

當機體發(fā)生炎癥時，炎性因子PGE-2表達升高，促進血管擴張，使毛細血管的通透性增大，引起疼痛等癥狀。同時，由于生理屏障被破壞，PSA大量進入血液循環(huán)中[15-16]。由表1可知，角叉菜膠組血清PSA及PGE-2水平造模后第1、3、5周均顯著高于假手術(shù)組，造模后第7周，PSA及PGE-2水平與假手術(shù)組比較差異無統(tǒng)計學意義，角叉菜膠組造模完成后1周即可顯現(xiàn)血清炎癥現(xiàn)象，第7周血清炎癥恢復正常，該模型維持時間至少4周。

表1 2種模型的檢測指標比較Tab.1 Comparison of detection indexes between the 2 models

消痔靈組血清PSA及PGE-2水平在造模術(shù)后第1周與假手術(shù)組比較差異無統(tǒng)計學意義，在造模后第3周PSA及PGE-2水平與假手術(shù)組比較顯著升高，在造模后第5周血清PSA水平仍顯著高于假手術(shù)組，而血清PGE-2水平與假手術(shù)組比較差異無統(tǒng)計學意義，PSA及PGE-2水平在造模術(shù)后第7周與假手術(shù)組比較差異均無統(tǒng)計學意義，表明消痔靈組造模完成3周后造模成功，第5周起血清炎癥情況逐漸恢復，該模型至少能維持2周。

造模手術(shù)后第7周臟器指數(shù)檢測結(jié)果顯示，角叉菜膠組和消痔靈組的前列腺指數(shù)均顯著高于假手術(shù)組(P<0.05)，對各組腎、睪丸、脾和胸腺指數(shù)進行分析，2組與假手術(shù)組比較差異均無統(tǒng)計學意義，表明2種造模方法對前列腺指數(shù)有顯著升高的作用，維持時間較長，但對其他臟器影響均較小，且角叉菜膠組模型成模時間更早，維持時間更長。

3.2角叉菜膠致大鼠CP模型評價

3.2.1相關(guān)炎癥因子考察 根據(jù)前期實驗中角叉菜膠誘導模型維持時間結(jié)果及對前列腺炎治療藥物相關(guān)研究中灌胃時間的綜合考慮，取造模后第5周的大鼠，檢測其他相關(guān)炎癥因子，見表2。TNF-α和IFN-γ是促炎性細胞因子，均由活化T細胞產(chǎn)生，前者刺激白細胞合成白細胞介素1 (IL-1)、IL-6和白細胞介素8 (IL-8)等細胞因子，促進炎癥反應；后者促進免疫細胞的增殖和活化[17]。WBC常用來間接反映炎癥的嚴重程度，在炎癥反應過程中，白細胞分泌釋放IL-6，促進T細胞的增殖[18-19]。

表2 角叉菜膠誘導模型相關(guān)炎癥因子檢測結(jié)果Tab.2 Results of the inflammation related indexes of carrageenan-induction model

由表2可知，角叉菜膠組WBC結(jié)果顯著高于假手術(shù)組(P<0.05)，血清中炎癥相關(guān)因子PSA、IL-6、TNF-α和IFN-γ水平均顯著提高。對前列腺指數(shù)進行檢測，角叉菜膠組大鼠前列腺指數(shù)高于假手術(shù)組，表明該模型能引起相關(guān)炎癥因子表達量升高，且能維持到造模后第5周。角叉菜膠組腎指數(shù)與假手術(shù)組比較差異無統(tǒng)計學意義。

3.2.2腎功能影響檢測 對造模后不同時期的各組大鼠血清中腎功能指標進行檢測，分析造模對大鼠腎功能的影響趨勢，見表3。由表3可知，造模后第1周，角叉菜膠組血清CREA及GLU水平與假手術(shù)組比較差異無統(tǒng)計學意義，UREA水平較假手術(shù)組顯著升高(P<0.05)；造模后第3周，角叉菜膠組大鼠CREA水平與假手術(shù)組比較差異無統(tǒng)計學意義，UREA水平顯著高于假手術(shù)組，GLU水平顯著低于假手術(shù)組；造模后第5周，角叉菜膠組大鼠3個腎功能因子水平與假手術(shù)組比較差異均無統(tǒng)計學意義，表明該模型造模后對大鼠血清中CREA水平無影響，在造模后第1、3周UREA均升高，在造模后第5周，該影響恢復至正常水平；對于GLU水平，角叉菜膠組在造模后第3周顯著低于假手術(shù)組，造模后第5周差異恢復。

表3 角叉菜膠誘導模型腎功能影響檢測結(jié)果Tab.3 Results of renal function of carrageenan-induction model

4 討論

CP作為一種慢性病，病程纏綿，治療周期長，該疾病帶來的疼痛和經(jīng)濟負擔對患者的心理狀態(tài)和生活質(zhì)量產(chǎn)生極大影響[20-22]。研究CP動物模型作為進行相關(guān)治療研發(fā)的基礎(chǔ)，具有重要的社會和經(jīng)濟價值[23]。

本實驗對化學刺激模型中常用的2種致炎劑誘導模型的穩(wěn)定性進行了對比。與假手術(shù)組比較，角叉菜膠組從造模后第1周起PSA與PGE-2水平顯著提高(P<0.05)，造模后第7周恢復至假手術(shù)組水平(P>0.05)。與假手術(shù)組比較，消痔靈組從造模后第3周開始PSA與PGE-2水平顯著提高(P<0.05)，其中PSA在第7周恢復至假手術(shù)組水平(P>0.05)，PGE-2在造模后第5周與假手術(shù)組比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。考慮到消痔靈與角叉菜膠注射液質(zhì)地不同，吸收程度和在組織內(nèi)作用快慢存在差異，消痔靈誘導該模型成模時間較角叉菜膠晚，維持時間短，因此認為角叉菜膠造大鼠CP模型更優(yōu)。

造模后第7周取材各臟器，角叉菜膠組和消痔靈組前列腺指數(shù)均顯著高于假手術(shù)組(P<0.05)，其他臟器指數(shù)兩模型組與假手術(shù)組比較差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。對兩模型組前列腺指數(shù)在第7周未降低至假手術(shù)組水平，考慮可能是由于炎癥導致前列腺組織纖維化難以在短時間內(nèi)恢復。其他各臟器指數(shù)在造模后第7周時與假手術(shù)組比較差異無統(tǒng)計學意義，考慮是否在造模期間產(chǎn)生差異，第7周時恢復的可能。本文結(jié)合臨床上CP與慢性腎臟病間出現(xiàn)的特點[24-25]，考慮到腎臟作為多種藥物或其代謝產(chǎn)物濾過、重吸收和排泄的場所[26]，在藥物篩選中腎毒性多作為重點考慮的研究對象，設(shè)計實驗對角叉菜膠誘導的大鼠CP模型中各時間點的腎功能指標進行監(jiān)測[27]。結(jié)果表明，造?？缮哐錟REA(P<0.05)，降低GLU(P<0.05)，但在造模后第5周檢測該影響消失，且腎指數(shù)也與假手術(shù)組比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。本實驗認為，灌胃第4周可作為藥物篩選和藥物腎毒性考察的綜合考量點。

本實驗可為CP與慢性腎臟病結(jié)合的臨床病理綜合征的模型研究奠定基礎(chǔ)，并對基于動物模型的藥物腎毒性考察中給藥周期的確定提供理論依據(jù)。