高志鑫，劉曉柳*，張菊，李樹(shù)立，趙士豪*

(1.河北經(jīng)貿(mào)大學(xué) 生物科學(xué)與工程學(xué)院，石家莊 050061；2.河北省禽肉深加工技術(shù)創(chuàng)新中心，石家莊 050061)

近20年來(lái)，我國(guó)雞肉制品生產(chǎn)和消費(fèi)呈持續(xù)且快速增長(zhǎng)的態(tài)勢(shì)，目前我國(guó)已成為世界第二大雞肉生產(chǎn)國(guó)，雞肉也成為僅次于豬肉的第二大消費(fèi)肉類。醬鹵制品是我國(guó)代表性的傳統(tǒng)禽肉制品之一，因營(yíng)養(yǎng)豐富、肉質(zhì)鮮嫰、香味醇厚的特點(diǎn)享譽(yù)海內(nèi)外。由于加工、貯存工藝的局限性，微生物成為導(dǎo)致其腐敗變質(zhì)的主要因素，有關(guān)食品防腐的研究應(yīng)運(yùn)而生。現(xiàn)有的防腐方式包括高溫蒸煮、防腐劑添加、低溫貯存、氣調(diào)包裝等[1]，其中化學(xué)防腐劑作為市面上出售并且應(yīng)用較多的食品保鮮劑，在延長(zhǎng)食品貨架期的同時(shí)，也給人類的健康帶來(lái)潛在危害[2]，開(kāi)發(fā)綠色高效的保鮮技術(shù)是肉制品乃至整個(gè)食品行業(yè)亟需解決的一大難題。

植物中含有多酚、有機(jī)酸、生物堿、多糖、黃酮等活性成分，研究表明將含有這些有效成分的植物提取物應(yīng)用到肉制品中[3]，可以達(dá)到良好的抑菌效果，還能夠提高肉制品的感官品質(zhì)[4]。以延長(zhǎng)食品保質(zhì)期、提升食品的健康性、豐富居民飲食結(jié)構(gòu)為目的，對(duì)蔬菜和中草藥抑菌性能的研究層出不窮。單恬恬等的研究表明，菱角殼提取物、芡實(shí)殼提取物、芡實(shí)肉醇提物對(duì)金黃色葡萄球菌、腐敗希瓦氏菌、假單胞菌、熱殺索絲菌、乳酸菌均有抑菌效果，將菱角殼醇提物、芡實(shí)殼醇提物及水提物應(yīng)用于冷鮮鴨肉保鮮，可延長(zhǎng)其貨架期1～2 d[5]；秘雪等的研究表明，莧菜粗提物對(duì)金黃色葡萄球菌和阪崎克羅諾腸桿菌具有抑制作用，將其作為天然抑菌劑應(yīng)用于熟豬肉中，以減少熟豬肉上金黃色葡萄球菌的菌落數(shù)量，維持豬肉顏色穩(wěn)定性，延長(zhǎng)豬肉貨架期[6]；孫琦的研究表明，當(dāng)用10.0 mg/mL的蔓越莓提取物處理金黃色葡萄球菌0.5 h后，可完全抑制108CFU/mL的金黃色葡萄球菌，穩(wěn)定維持樣品的pH值和色度[7]；徐清萍等研究了白芷、生姜等11種香辛料對(duì)乳酸菌生長(zhǎng)的抑制情況，發(fā)現(xiàn)白芷、高良姜、生姜等多數(shù)香辛料的添加會(huì)降低乳酸乳球菌LL發(fā)酵液對(duì)大腸桿菌、金黃色葡萄球菌的抑菌性[8]；鄧永飛等研究對(duì)以植物精油作為保鮮劑的機(jī)理以及提取方法[9]。但是，目前利用天然來(lái)源植物提取物延長(zhǎng)醬鹵雞肉制品貨架期的研究較少。

本研究考察了香菜、芹菜、茴香、韭菜、紫皮洋蔥、黃皮洋蔥、金銀花、辛夷、薄荷、白芷、連翹、魚(yú)腥草等對(duì)混合扒雞腐敗菌的抑制效果，篩選了具有良好抑菌作用的天然植物提取物，并將其用于扒雞的防腐保鮮研究中，為實(shí)現(xiàn)醬鹵雞肉制品中添加劑減量化，提升食品的安全性、健康性、營(yíng)養(yǎng)性奠定了基礎(chǔ)；同時(shí)也拓寬了傳統(tǒng)中草藥資源的應(yīng)用領(lǐng)域，為研究天然來(lái)源防腐劑提供了有價(jià)值的參考。

1 材料與方法

1.1 材料與設(shè)備

實(shí)驗(yàn)材料：香菜、芹菜、茴香、韭菜、紫皮洋蔥、黃皮洋蔥：均為市售新鮮材料；金銀花、辛夷、薄荷、連翹、魚(yú)腥草、白芷、當(dāng)歸。

供試菌體：從漲袋后的金鳳扒雞中分離擴(kuò)培的混合腐敗微生物。

主要試劑：LB瓊脂、HCl、NaCl、NaOH、牛肉膏、瓊脂粉、蛋白胨、揮發(fā)性鹽基氮速測(cè)盒、LB肉湯培養(yǎng)基。

主要實(shí)驗(yàn)儀器：手提式高壓蒸汽滅菌器、恒溫培養(yǎng)振蕩搖床、pH計(jì)、電熱恒溫培養(yǎng)箱、低速自動(dòng)平衡離心機(jī)、拍打式均質(zhì)機(jī)、水浴鍋、分光光度計(jì)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 培養(yǎng)基的配制

配方：牛肉膏0.5 g、蛋白胨1 g、氯化鈉0.5 g、瓊脂2 g、蒸餾水100 mL。

2.5×培養(yǎng)基：上述配方中各組分配比不變，蒸餾水添加量為40 mL。

1.2.2 腐敗菌液的制備

將未添加抑菌劑的扒雞樣品置于(30±1) ℃恒溫培養(yǎng)箱中，20 h后取出。剪開(kāi)密封包裝樣品，準(zhǔn)備盛有225 mL生理鹽水的均質(zhì)袋，將樣品剪碎后稱取25 g碎樣置于袋內(nèi)，用無(wú)菌均質(zhì)機(jī)拍打均質(zhì)1～2 min，形成樣品勻液，再用1 mL無(wú)菌移液槍吸取1∶10的樣品勻液1 mL，沿管壁緩慢注于瓷珠菌種保藏管中。上下顛倒混勻5～10次，將瓷珠菌種保藏管倒置，靜置15～20 min后，將保藏管置于-20 ℃?zhèn)溆谩Ｓ描囎尤?粒瓷珠，緩慢放入盛有10 mL 10%氯化鈉胰酪胨大豆肉湯培養(yǎng)基的試管中，置于(30±1) ℃恒溫培養(yǎng)振蕩器中培養(yǎng)20 h，獲得的腐敗菌液做后續(xù)抑菌實(shí)驗(yàn)待用。

1.2.3 天然植物提取液的制備

取新鮮、去掉黃葉后的香菜、芹菜、茴香、韭菜、紫皮洋蔥、黃皮洋蔥各300 g，洗凈后先用刀將其切碎，再放入攪碎機(jī)中攪碎，之后用濾網(wǎng)進(jìn)行過(guò)濾，各得到75 mL香菜、芹菜、茴香、韭菜、紫皮洋蔥、黃皮洋蔥浸出液，再用離心機(jī)離心(3000 r/min，10 min)，取上清液作為100%原液(濃度為4.0 g/mL)。再取香菜、芹菜、茴香、韭菜、紫皮洋蔥、黃皮洋蔥浸出液各40 mL，在水浴鍋中于40 ℃濃縮至10 mL，作為濃縮液(濃度為16.0 g/mL)。

取金銀花、辛夷、薄荷、白芷、連翹、魚(yú)腥草、當(dāng)歸各25 g用打磨機(jī)研碎后加入50 mL蒸餾水，經(jīng)多次煮制獲得水煎液，除去殘?jiān)笤賹⑺逡憾ㄈ葜?0 mL。將以上7種藥材的50 mL水煎液放到高壓滅菌鍋中于121 ℃蒸煮30 min后取出，并將50 mL的水煎液濃縮至10 mL(濃度為2.5 g/mL)，放置4 ℃冰箱中冷藏備用[10]。

1.2.4 天然植物提取液抑菌活性的研究

將已滅菌的牛肉膏培養(yǎng)基1000 mL加熱到完全融化，冷卻至50 ℃左右的平板培養(yǎng)基中注入10 mL的菌液，混合均勻，傾注平板，每皿20 mL(下層)，待其凝固。將牛津杯置于培養(yǎng)皿(每個(gè)培養(yǎng)皿3個(gè)牛津杯)加入0.06 mL香菜、芹菜、茴香、韭菜、紫皮洋蔥、黃皮洋蔥處理液和對(duì)照液(無(wú)菌水)以及50 μL藥材水煎液于牛津杯中進(jìn)行培養(yǎng)。將培養(yǎng)皿先放入4 ℃冰箱中冷藏2 h后，置于30 ℃培養(yǎng)24 h，用抑菌圈直徑評(píng)價(jià)各蔬菜處理液的抑菌效果。各實(shí)驗(yàn)均進(jìn)行3組平行實(shí)驗(yàn)，所得結(jié)果求平均值。

抑菌圈直徑(mm)=抑菌直徑(mm)-小孔直徑(6 mm)。

1.2.5 最低抑制濃度(MIC)和最小殺菌濃度(MBC)的測(cè)定

分別向滅菌的試管中加入適量的菌液以及液體培養(yǎng)基，再分別加入適量的不同濃度的各處理液，將配制好的試管置于30 ℃培養(yǎng)24 h。MIC的判定是用肉眼觀察渾濁度，處理液的濃度最低但試管內(nèi)卻澄清的濃度即為最低抑菌濃度(MIC)。

繼續(xù)培養(yǎng)至48 h后，將呈澄清狀態(tài)的試樣管菌液涂布于普通培養(yǎng)基中培養(yǎng)8～12 h，若無(wú)細(xì)菌生長(zhǎng)，說(shuō)明該質(zhì)量濃度即為該處理液的最小殺菌濃度(MBC)。

1.2.6 植物提取液對(duì)扒雞貯藏品質(zhì)的影響

采用抑菌效果較好的蔬菜、藥材最小殺菌濃度(MBC)提取液浸泡新鮮扒雞雞翅、雞爪，以無(wú)菌水浸泡組作為空白對(duì)照，各組樣品分別置于4 ℃和25 ℃下保存。在1，3，5，7，9 d分別進(jìn)行微生物和化學(xué)指標(biāo)測(cè)定，每次取3個(gè)重復(fù)，樣品感官評(píng)價(jià)指標(biāo)見(jiàn)表1。菌落總數(shù)的測(cè)定：參照GB 4789.2-2016《食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 菌落總數(shù)測(cè)定》進(jìn)行；揮發(fā)性鹽基氮(TVB-N值)的測(cè)定：參照GB 5009.228-2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中揮發(fā)性鹽基氮的測(cè)定》進(jìn)行；pH值的測(cè)定：取菌落總數(shù)測(cè)定過(guò)程中所制樣品勻液適量，用pH計(jì)測(cè)定其pH值。

表1 樣品感官評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)表Table 1 The sensory evaluation standard of samples

2 結(jié)果與分析

2.1 不同植物提取液的抑菌性能分析

2.1.1 抑菌圈直徑測(cè)定

采用牛津杯法測(cè)定各植物提取物對(duì)扒雞混合腐敗菌的抑菌活性，見(jiàn)表2。結(jié)果表明，在實(shí)驗(yàn)濃度下，香菜、芹菜、茴香、紫皮洋蔥和黃皮洋蔥處理液以及金銀花、辛夷、薄荷、魚(yú)腥草、當(dāng)歸水煎液均不能產(chǎn)生抑菌圈。具有抑菌效果的韭菜處理液、白芷水煎液、連翹水煎液的抑菌圈直徑分別為(10.3±0.1)，(7.0±0.1)，(2.0±0.1) mm?？紤]到不同植物提取液中有效成分的濃度不同，不能僅憑抑菌圈直徑大小評(píng)價(jià)其抑菌活性強(qiáng)弱，故采用抑菌效果較好的韭菜提取液和白芷水煎液進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

表2 不同植物提取液的抑菌圈直徑表Table 2 The inhibition zone diameters of various plant extracts

2.1.2 最低抑菌濃度(MIC)和最小殺菌濃度(MBC)的測(cè)定

將培養(yǎng)基、腐敗菌液分別與不同稀釋濃度的韭菜提取液、白芷水煎液混合，培養(yǎng)24 h，結(jié)果見(jiàn)表3。未添加腐敗菌液的對(duì)照組(J-0、B-0)培養(yǎng)后無(wú)菌落，說(shuō)明各提取液中沒(méi)有引入新的微生物；而僅培養(yǎng)基和腐敗菌液的對(duì)照組(C-0)菌量較大，基本可以排除培養(yǎng)基中成分抑菌的可能。此外，在實(shí)驗(yàn)濃度范圍內(nèi)，肉眼觀察渾濁度結(jié)果表明，植物提取液濃度越大，肉眼觀察到的渾濁度越低，韭菜提取液終濃度大于1.0 g/mL情況下，培養(yǎng)液清澈；而濃度降低至0.5 g/mL以下后，培養(yǎng)液開(kāi)始變渾濁，即韭菜提取液的MIC值為1.0 g/mL。取肉眼清澈的培養(yǎng)液涂布于固體培養(yǎng)基培養(yǎng)48 h后，2.0 g/mL的處理組有明顯菌落，進(jìn)一步提高至到4.0 g/mL后可達(dá)到良好的殺菌效果，故韭菜處理液的MBC值為4.0 g/mL。同理，白芷水煎液[11]的MIC值為0.25 g/mL，MBC值為0.75 g/mL。

表3 不同植物提取液MIC和MBC的測(cè)定Table 3 The determination of MIC and MBC of various plant extracts

表3 不同植物提取液MIC和MBC的測(cè)定

2.2 兩種植物提取物對(duì)扒雞保鮮作用的影響

2.2.1 兩種植物提取物對(duì)扒雞貯藏期內(nèi)感官評(píng)分變化的影響

對(duì)扒雞的感官評(píng)價(jià)主要關(guān)注其色澤、風(fēng)味、肌纖維和香氣，依照表1的標(biāo)準(zhǔn)，將6名評(píng)價(jià)者的打分取平均值后匯總至表4。結(jié)果表明，無(wú)論常溫還是低溫貯存，經(jīng)植物提取液浸泡的樣品初始感官評(píng)分均低于空白組，其原因在于兩種植物提取液的加入會(huì)對(duì)樣品的色澤和風(fēng)味產(chǎn)生一定不良影響，而影響程度以韭菜更甚。但隨著貯存時(shí)間的延長(zhǎng)，植物提取液的抑菌作用逐漸顯現(xiàn)，處理組的感官評(píng)分反超空白組。由此可見(jiàn)，韭菜提取液和白芷水煎液的添加可延緩扒雞腐敗，且白芷效果更好。此外，在低溫貯藏條件下，樣品的腐敗程度顯著低于常溫貯存狀態(tài)。

表4 貯藏期內(nèi)不同樣品的感官評(píng)價(jià)得分表Table 4 The sensory evaluation scores of various samples during storage period

2.2.2 兩種植物提取物對(duì)扒雞貯藏期內(nèi)總菌落數(shù)變化的影響

在常溫和低溫貯藏條件下，第3天空白樣品均出現(xiàn)明顯菌落，而白芷水煎液處理組僅常溫雞翅樣品出現(xiàn)1個(gè)菌落，韭菜提取液處理組菌落數(shù)介于空白組和白芷水煎液組之間。之后，隨著貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)，各組樣品的菌落數(shù)均不斷攀升，但植物提取液處理的樣品中總菌落數(shù)一直明顯低于相應(yīng)對(duì)照組?？梢?jiàn)，白芷水煎液和韭菜提取液浸泡可有效抑制微生物的生長(zhǎng)繁殖，減緩扒雞腐敗，且白芷水煎液的處理效果優(yōu)于韭菜提取液組。

表5 貯藏期內(nèi)不同時(shí)間樣品的總菌落數(shù)Table 5 The total number of colonies of various samples during storage period

2.2.3 兩種植物提取物對(duì)扒雞貯藏期內(nèi)pH變化的影響

貯藏期內(nèi)，不同處理情況下樣品的pH變化趨勢(shì)見(jiàn)圖1。

圖1 不同貯存溫度下兩種植物提取物對(duì)扒雞pH值的影響Fig.1 The effects of two kinds of plant extracts on the pH values of braised chicken at different storage temperatures

由圖1可知，隨著貯藏期的延長(zhǎng)，不同處理?xiàng)l件下樣品pH均存在上升趨勢(shì)，原因可能是腐敗微生物分解雞肉中蛋白質(zhì)為堿性含氮小分子物質(zhì)，使樣品的pH上升。但兩種植物提取物處理組的變化趨勢(shì)明顯緩于對(duì)照組，說(shuō)明白芷水煎液和韭菜提取液在抑制微生物生長(zhǎng)繁殖、減緩扒雞腐敗變質(zhì)進(jìn)程中具有一定效果。此外，白芷水煎液處理組的pH上升趨勢(shì)緩于韭菜提取液處理組，表明其保鮮效果更優(yōu)，而檢測(cè)初期pH的上升可能是由于白芷水煎液本身pH較高所致。

2.2.4 兩種植物提取物對(duì)扒雞貯藏期內(nèi)揮發(fā)性鹽基氮變化的影響

在動(dòng)物性食品腐敗的過(guò)程中，蛋白質(zhì)分解而產(chǎn)生氨以及胺類等堿性含氮物質(zhì)被稱為揮發(fā)性鹽基氮，其含量越高，表明氨基酸被破壞的越多，顯著地影響食品的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值。揮發(fā)性鹽基氮的測(cè)定所采用的樣品需除去脂肪、骨及腱，若采用雞爪，則幾乎無(wú)剩余部分，故該實(shí)驗(yàn)過(guò)程僅采用雞翅進(jìn)行。貯藏期內(nèi)不同時(shí)間樣品的總揮發(fā)性鹽基氮含量變化結(jié)果見(jiàn)圖2。

圖2 不同貯存溫度下兩種植物提取物對(duì)扒雞揮發(fā)性鹽基氮含量的影響Fig.2 The effects of two kinds of plant extracts on the volatile basic nitrogen content of braised chicken at different storage temperatures

由圖2可知，隨著貯存時(shí)間的延長(zhǎng)，不同處理組樣品揮發(fā)性鹽基氮含量均呈上升趨勢(shì)，但韭菜提取液和白芷水煎液添加組中產(chǎn)出揮發(fā)性鹽機(jī)氮含量均低于相應(yīng)對(duì)照組。常溫環(huán)境下，空白組在第9天揮發(fā)性鹽基氮達(dá)到15.6 mg/100 g，而植物提取液處理組第9天揮發(fā)性鹽基氮達(dá)到12.4 mg/100 g(韭菜處理液)和11.6 mg/100 g(白芷提取液)。低溫環(huán)境下，空白組在第3天即產(chǎn)生揮發(fā)性鹽基氮，第9天揮發(fā)性鹽基氮含量達(dá)到8.2 mg/100 g，而植物提取液處理組第5天才產(chǎn)生明顯的揮發(fā)性鹽基氮，第9天揮發(fā)性鹽基氮含量?jī)H為7.1 mg/100 g(韭菜處理液)和5.8 mg/100 g(白芷提取液)，即韭菜處理液和白芷水煎液的添加減緩與揮發(fā)性鹽基氮的產(chǎn)生，對(duì)防止扒雞腐敗、保留其營(yíng)養(yǎng)價(jià)值具有積極的作用。

3 結(jié)論

實(shí)驗(yàn)中選取的香菜、芹菜、韭菜、茴香、紫皮洋蔥和黃皮洋蔥等蔬菜提取物以及金銀花、薄荷、辛夷、魚(yú)腥草、當(dāng)歸、白芷、連翹等中草藥水煎液中，韭菜提取物、連翹水煎液和白芷水煎液具有抑菌作用，而其他植物提取物在本實(shí)驗(yàn)所能達(dá)到的最大濃度時(shí)仍不具有抑菌效果。朱明濤等研究了3種香辛料對(duì)牛肉的保鮮作用，結(jié)果表明，白芷的保鮮作用最好[12]；李莎莉的研究結(jié)果表明，韭菜6種不同極性部位及揮發(fā)油對(duì)于鮑曼不動(dòng)桿菌、肺炎鏈球菌、枯草芽孢桿菌、蘇云金桿菌、銅綠假單胞菌、金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、糞腸球菌均有明顯的抑制作用[13]；劉洋等的研究結(jié)果表明，川白芷提取液對(duì)金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、銅綠假單胞菌以及肺炎克雷伯氏菌均有不同程度的抑制效果，且隨著提取物濃度增大抑制效果增強(qiáng)[14]；王小敏等的研究結(jié)果表明，連翹果與連翹葉乙醇提取物對(duì)大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌均有抑制效果[15]。此外，亦有關(guān)于香菜、芹菜、茴香、洋蔥、金銀花、薄荷、辛夷、魚(yú)腥草等抑菌活性的研究。本研究中，其未表現(xiàn)出明顯抑菌作用的原因應(yīng)為有效成分濃度的差異及受抑制微生物種類差異所致。將抑菌效果較明顯的韭菜提取液與白芷水煎液應(yīng)用于扒雞保鮮中，可有效減緩扒雞腐敗，延長(zhǎng)產(chǎn)品的貨架期。

本文以常見(jiàn)的香草類蔬菜及中草藥為研究對(duì)象，綜合考察其抑菌能力，并將篩選到的具有抑菌作用的提取物應(yīng)用于扒雞保鮮以達(dá)到延長(zhǎng)其貨架期的目的，同時(shí)，為減少食品中化學(xué)防腐劑的添加、拓展傳統(tǒng)植物的應(yīng)用價(jià)值奠定了基礎(chǔ)。