王 琪，柳朝陽，張鵬霞，紀(jì)洪兵，殷佳輝，趙德陽，岳 淵，張 濤

(1.佳木斯大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，黑龍江 佳木斯 154007；2.佳木斯市傳染病醫(yī)院,黑龍江 佳木斯 154007；3.佳木斯大學(xué)附屬第一醫(yī)院,黑龍江 佳木斯 154003)

間充質(zhì)干細(xì)胞(MSCs)具有可塑性及自我更新和分化能力，目前對間充質(zhì)干細(xì)胞研究較多的是骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，但骨髓獲取具有創(chuàng)傷性，經(jīng)進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)MSCs具有多種不同來源，幾乎可以在所有的組織中找到，臍帶是一種容易獲得的組織資源，取材簡便沒有創(chuàng)傷性，易于擴(kuò)增與分離培養(yǎng)[1]。長期保存也具有穩(wěn)定性，在炎癥組織損傷和某些癌癥疾病中作為組織再生的主要基質(zhì)[2]。經(jīng)證實(shí)，間充質(zhì)干細(xì)胞可分泌大量具有免疫抑制作用的生物活性因子，這為異基因間充質(zhì)干細(xì)胞的治療提供了理論基礎(chǔ)[3]。本研究對臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞進(jìn)行分離培養(yǎng)及鑒定，并通過對小鼠腹腔注射脂多糖造急性肝損傷模型，隨后腹腔注射MSCs對急性肝損傷小鼠進(jìn)行治療，從而對臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞修復(fù)肝功能的能力進(jìn)行全面研究。

1 材料和方法

1.1 材料

試驗(yàn)動(dòng)物為6周齡雄性小鼠(北京華阜康生物有限公司)。臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)所用的試驗(yàn)動(dòng)物由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所昌平試驗(yàn)基地提供，取3月胎齡的流產(chǎn)胎牛，選取臍帶組織放置于含雙抗的無菌PBS磷酸鹽緩沖液中待用。

1.2 主要試劑

DMEM/F12 基礎(chǔ)培養(yǎng)基，自制PBS，胎牛血清和山羊血清均購自美國Gibco公司，雙抗(青霉素、鏈霉素)均購買于北京中杉金橋。一抗購自北京博奧森公司，F(xiàn)ITC標(biāo)記兔抗小鼠，購自北京康為試劑公司。Trizol試劑購買于Invitrogen(Carlsbad，CA，USA)。

1.3 方法

1.3.1 全培

DMEM/F12基礎(chǔ)培養(yǎng)基(按說明書配置)，胎牛血清10ng/mL，bFGF10ng/mL，EGF10ng/mL，1%丙酮酸那，1%非必須氨基酸，1%青鏈霉素(雙抗)，混勻后除菌(濾膜)放冰箱待用。

1.3.2 臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的分離培養(yǎng)

組織貼壁法培養(yǎng)胎牛臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞75%乙醇噴灑流產(chǎn)胎牛胎盤消毒，無菌條件下用高壓滅菌后的眼科鑷子和眼科剪將胎盤解剖選取臍帶組織，放入到含1%雙抗的無菌預(yù)冷PBS中,隨后轉(zhuǎn)移至紫外照射15min的無菌超凈工作臺(tái)上，將血管和其他組織剔除干凈，于PBS中反復(fù)漂洗8～10遍去除血細(xì)胞。將臍帶剪為2mm×2mm左右的組織塊, 均勻的貼在培養(yǎng)皿底面, 加入1mL的胎牛血清保持臍帶組織濕潤與貼壁, 將培養(yǎng)皿轉(zhuǎn)移至37℃、5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中, 放置1h后，加入3mL全培，靜止3d后每隔兩天換液一次，當(dāng)細(xì)胞爬滿皿底2/3即消化傳代。

1.3.3 免疫熒光堅(jiān)鑒定間充質(zhì)干細(xì)胞

取第5代純化后的臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞接種到六孔板中，PBS沖洗兩遍后用4%多聚甲醛固定，經(jīng)TritonX-100通透山羊血清封閉后加入一抗，4℃冰箱避光孵育過夜，次日取出六孔板加入FITC標(biāo)記二抗，表面標(biāo)記物為VIM、NES、CD44、CD70、CD90和CD105。PBS洗滌,激光共聚焦顯微鏡拍照。

1.3.4 動(dòng)物模型制備

準(zhǔn)備54只小鼠分為3組，每組18只小鼠隨機(jī)分為細(xì)胞移植組，對照組和損傷組，對小鼠進(jìn)行適應(yīng)性飼養(yǎng)15d。腹腔注射途徑給小鼠注射10mg/kg礦物油(對照組)和10mg/kg脂多糖(損傷組和細(xì)胞移植組)。隨后給細(xì)胞移植組小鼠腹腔注射4.6×106/皿臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞，選取時(shí)間節(jié)點(diǎn)為6h，24h，48h處理小鼠。

1.3.5 小鼠血清學(xué)和肝組織分析

抽取小鼠全血，低速離心機(jī)離心小鼠血液取上層血清，通過血清學(xué)檢測對小鼠酶水平進(jìn)行分析，分別檢測肝功能生化指標(biāo)ALT、AST、ALP、GGT。通過蘇木精 - 伊紅(HE)染色法評估肝損傷與細(xì)胞修復(fù)作用。

2 結(jié)果

2.1 組織塊貼壁法MSCs的形態(tài)學(xué)觀察

通過顯微鏡觀察臍帶組織塊貼壁法,在第3天組織塊周圍游離出細(xì)胞見圖1A,在分離培養(yǎng)的第10天組織塊周圍爬滿細(xì)胞, 細(xì)胞形態(tài)多為梭形或長梭形，見圖1B ,當(dāng)細(xì)胞貼壁率達(dá)到80%時(shí)可以消化傳代，傳代后細(xì)胞為梭形或長梭形,見圖1C～1F。

A 、B分別為為P0第3天和第10天C、D、E、F為P1～P4

2.2 免疫熒光鑒定

通過免疫熒光法檢測臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞表面標(biāo)志物VIM，NES、CD44、CD73和CD105，見圖2，結(jié)果顯示均為陽性表達(dá)，證明分離培養(yǎng)出的細(xì)胞確實(shí)是MSCs，可用于下一步小鼠損傷后的細(xì)胞移植治療實(shí)驗(yàn)。

(A、D、G、J為綠色熒光(FITC)胞質(zhì)染色； B、E、H、K 為 DAPI胞核染色； C、F、I、L為FITC與DAPI的疊加圖)

2.3 小鼠蘇木精 - 伊紅(HE)染色法評估和血清學(xué)檢測

2.3.1 細(xì)胞移植后小鼠肝臟切片的免疫組織化學(xué)分析：細(xì)胞移植后48h，做小鼠肝臟切片，用10%福爾馬林固定并用石蠟包埋，做肝臟的組織學(xué)分析，用蘇木精-伊紅(HE)染色評估，見圖3。

A為LPS注射48h肝組織切片；B為細(xì)胞移植后48h肝組織切片

2.3.2 注射LPS后48h，小鼠表現(xiàn)出嚴(yán)重的肝損傷。與未受傷的小鼠(對照組)相比，LPS腹腔注射發(fā)生肝損傷的小鼠(損傷組)對比，ALT、AST、ALP、GGT增加，急性時(shí)相反應(yīng)蛋白CRP升高。隨后將臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞腹腔注射到急性肝損傷模型小鼠體內(nèi)，細(xì)胞移植后48h ALT、AST、顯著降低，ALP、GGT水平降低，CRP下降，證明臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞對急性肝損傷小鼠有治療能力。

3 討論

肝臟暴露于許多因素下，例如藥物、病毒，這些因素可能會(huì)導(dǎo)致肝臟病變包括慢性肝炎和肝硬化，肝硬化已成為常見病[4]。在大多數(shù)情況下，這些疾病會(huì)導(dǎo)致肝細(xì)胞癌，最后導(dǎo)致器官衰竭，出現(xiàn)慢性炎癥，纖維化，并且不再具有任何再生能力,肝癌的死亡率居腫瘤第二位[5]。迄今為止，唯一有效的治療方法是肝移植，但由于供體數(shù)量有限和器官排斥，因此不能被廣泛應(yīng)用。另一種治療肝衰竭的方法是干細(xì)胞。治療肝損傷的主要干細(xì)胞是間充質(zhì)干細(xì)胞(MSCs)，可以從不同來源獲得，例如骨髓[6]、臍帶血[7]、羊水[8]、頭皮組織[9]、胎盤[10]和脂肪組織[11,12]。經(jīng)統(tǒng)計(jì)每年因肝臟疾病死亡的患者被低估，病毒性肝炎和肝膽癌引起的與肝臟有關(guān)的發(fā)病率和死亡率增加，臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞移植后可以改善肝臟功能，這一點(diǎn)已經(jīng)通過肝臟組織切片及血清學(xué)檢測數(shù)值的變化得到證實(shí)。證明臍帶間存在干細(xì)胞移植可能在肝病動(dòng)物模型和肝病治療的臨床環(huán)境中具有廣泛的治療功效，對建立干細(xì)胞移植具有重要意義。