劉玉榮，曹雅菲，雒洋洋，高 怡，劉景源，劉君星

(1.佳木斯大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院，黑龍江 佳木斯 154007；2.佳木斯大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，黑龍江 佳木斯 154007)

丁香(FlosCaryophylli)系桃金娘科蕃櫻桃屬植物丁香(Eugenia Caryophyllata Thunb.)的干燥花蕾,又稱公丁香。實驗結(jié)果表明丁香精油具有良好的抗氧化活性和抑菌[1～3]。目前國內(nèi)外對丁香的研究與應(yīng)用主要集中在食品的抗氧化抑菌、化妝品和醫(yī)藥衛(wèi)生方面[4～7]。自科學(xué)家們開始對精油的研究，精油的各種功效逐漸顯露，但是精油對皮膚美白的作用研究的時間并不久[8]。隨著提取工藝的不斷提升，各種提取方法之間的對比，我們可以得到含抗氧化物質(zhì)更多的精油[9]。植物精油作為一種天然的酪氨酸酶抑制劑，具有顯著的促透皮吸收能力和酪氨酸酶抑制活性，而且具有獨特的芳香氣味，應(yīng)用前景廣闊[10]。本實驗基于黑色素細(xì)胞評價體系探索了丁香精油對黑色素細(xì)胞活力的影響、抗氧化損傷作用及對其生成黑色素的抑制作用，為進(jìn)一步擴(kuò)大丁香精油在食品、藥品和化妝品等領(lǐng)域的應(yīng)用提供數(shù)據(jù)支撐。

1 實驗材料

主要試劑及儀器：丁香精油(北京華邁科生物技術(shù)有限責(zé)任公司);人造黑素(Sigma公司);左旋多巴(成都普瑞法科技開發(fā)有限公司);總SOD檢測試劑盒(上海碧云天生物技術(shù)有限公司);活性氧檢測試劑盒(上海碧云天生物技術(shù)有限公司);BCA總蛋白定量測試盒(上海碧云天生物技術(shù)有限公司);普通倒置顯微鏡(日本Olympus公司)。

2 實驗方法

2.1 丁香精油對黑色素細(xì)胞的毒性

MTT 法檢測細(xì)胞活性: 當(dāng)細(xì)胞排列較緊密、80%左右融合后制作細(xì)胞密度為1×105個/mL的細(xì)胞懸液，每孔 200μL接種于 96孔細(xì)胞培養(yǎng)板。培養(yǎng)24h細(xì)胞貼壁后吸出原培養(yǎng)液，實驗組加入濃度分別為10.45mg/mL、2.09mg/mL、0.418mg/mL、0.084mg/mL、0.017mg/mL、0.003mg/mL丁香精油的培養(yǎng)基稀釋液，每種濃度的藥物設(shè)置6個復(fù)孔，另設(shè)一組對照組和空白組，加入等量的不含藥物的培養(yǎng)液。繼續(xù)培養(yǎng) 24h、48h后，取出培養(yǎng)板，吸出培養(yǎng)液，每孔加入100 μL培養(yǎng)基和20μL的MTS，37℃條件下繼續(xù)孵育1 h。放入酶標(biāo)儀中,在 450nm波長下測定各孔吸光值，記錄數(shù)據(jù)，進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。

2.2 抗氧化損傷

2.2.1 細(xì)胞內(nèi)sod活性測定

取適量細(xì)胞接種于6孔板，第二天細(xì)胞貼壁后加入常規(guī)培養(yǎng)液或上述最佳作用濃度的藥物共同處理48h后，按試劑盒說明書通過多功能酶標(biāo)儀測定。

2.2.2 細(xì)胞內(nèi)ros測定

取適量細(xì)胞接種于96孔板，第二天細(xì)胞貼壁后加入常規(guī)培養(yǎng)液或上述最佳作用濃度的藥物共同處理48h后，按試劑盒說明書通過多功能酶標(biāo)儀測定。

2.3 丁香精油對黑色素生成的影響

2.3.1 細(xì)胞內(nèi)黑色素含量的測定: 取對數(shù)生長期細(xì)胞，用胰酶消化，制成1.2×105個/mL，按每孔2mL接種于 6 孔培養(yǎng)板， CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)24h。加藥后繼續(xù)培養(yǎng) 48h，用PBS(pH7.4)洗2次，每孔加100μL細(xì)胞裂解液，冰上裂解30min，12000r/min離心15min，棄上清，沉淀物中加150μL含10% DMSO 1mol/L的NaOH溶液，80℃恒溫水浴保溫30min。酶標(biāo)儀405nm測定吸光度值，以人造黑素為黑色素標(biāo)準(zhǔn)品設(shè)置的標(biāo)準(zhǔn)曲線計算黑色素含量。黑色素抑制率=加藥組黑色素含量/對照組黑色素含量×100%。

2.3.2 細(xì)胞內(nèi)酪氨酸酶活性測定: 采用多巴氧化法，取對數(shù)生長期細(xì)胞，用胰酶消化，制成1.2×105個/ mL，按每孔2mL接種于6孔培養(yǎng)板，CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng) 24h。加藥后繼續(xù)培養(yǎng)48h，去上清液，用PBS(pH7.4)洗2次每孔加100μL細(xì)胞裂解液，冰上裂解30min，12000r/min離心15min，取上清90μL，加入0.1% L-多巴溶液10μL，37℃反應(yīng)30min，測定490nm吸光度值。酪氨酸酶相對活性=加藥組OD值/對照組OD值×100%。

2.4 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 21.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行分析處理，數(shù)據(jù)以均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用單因素方差分析，P<0.05為差異具有顯著性。

3 結(jié)果

3.1 不同濃度丁香精油對黑色素細(xì)胞活力的影響

因10.45mg/mL組精油濃度較大沉淀于板底，影響吸光度，不計入在內(nèi)。與空白組(0mg/mL) 比較，2.09mg/mL、0.418mg/mL、0.084mg/mL組的細(xì)胞活力顯著減弱(P<0.05或P<0.01)，且抑制率與藥物濃度正相關(guān)。由此選擇0.084mg/mL作用48h為后續(xù)實驗的作用劑量。見圖1。

3.2 不同濃度丁香精油對黑色素細(xì)胞內(nèi)T-SOD、ROS的影響

與對照組相比，加藥組各組細(xì)胞內(nèi)T-SOD活力均有不同程度的增加，當(dāng)精油濃度>0.418mg/mL以后SOD逐漸下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。陽性對照組ROS顯著升高，加藥組細(xì)胞ROS有不同程度的下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見圖2～3。

3.3 不同濃度丁香精油對黑色素細(xì)胞黑色素含量、酪氨酸酶活性的影響

各組黑色素含量下降明顯，精油濃度與抑制率成正比，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，且有明顯差異(P<0.01)。各組酪氨酸酶活力均有不同程度下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)且有明顯差異(P<0.01)。見圖4。

圖1 不同濃度丁香精油對黑色素細(xì)胞的抑制率

圖2 丁香精油對黑色素細(xì)胞內(nèi)T-SOD的影響

圖3 丁香精油對黑色素細(xì)胞內(nèi)ROS的影響

圖4 丁香精油對黑色素細(xì)胞黑色素含量、酪氨酸酶活性的影響

4 討論

丁香精油具有消炎、止痛、抗病毒、抗癌、抗氧化等藥理活性，同時具有很強的抑菌活性，是優(yōu)良的天然食品防腐劑來源[11]。所以近些年來丁香精油在食品保鮮，抗菌等方面有很多研究。因皮膚對脂溶性物質(zhì)滲透較高，所以精油有較高的透皮吸收率[12]。而且傳統(tǒng)的皮膚美白劑，可能會導(dǎo)致皮膚過敏、腐蝕等危害，因此從天然植物中提取功效成分延緩皮膚衰老，已成為目前護(hù)膚產(chǎn)品開發(fā)的主要趨勢，產(chǎn)品也深受消費者喜愛[13,14]。皮膚黑化、雀斑、褐斑和老年斑的出現(xiàn),都與體內(nèi)酪氨酸酶和過氧化氫酶的活性增高密切相關(guān)[15]。皮膚美白劑的美白機理主要在于抑制新的黑色素生成，加速已有黑色素的分解。皮膚美白機理主要是：(1)抑制有關(guān)黑色素生成的相關(guān)酶。與黑色素生成主要相關(guān)的是以下三種酶：酪氨酸酶(TYR)、5，6-二羥基吲哚羧酸氧化酶(TRP-1)、多巴色素異構(gòu)酶(TRP-2)，因此研究藥物的美白功效可以研究通過其對這三種酶的抑制能力。(2)抑制黑色素細(xì)胞增殖。(3)抑制黑色素轉(zhuǎn)移。(4)抑制黑色素合成相關(guān)基因的表達(dá)。(5)黑色素的分解與代謝[16]。

本文驗證了丁香精油的抗氧化活性并研究了丁香精油對對小鼠表皮黑色素細(xì)胞內(nèi)黑色素生成的影響及酪氨酸酶活性的抑制作用，但關(guān)于丁香精油抑制黑色素生成的作用機制尚未探索，希望在之后的實驗中能明確與黑色素生成密切相關(guān)的酶的mRNA、DNA表達(dá)水平，使得丁香精油的皮膚美白作用機制研究更加完善。隨著精油提取工藝、成分分析及護(hù)膚品制作工藝的提升，了解更多含香組分或其它可用于化妝品領(lǐng)域的天然成分，調(diào)配與化妝品香水等產(chǎn)品中，相信丁香精油在皮膚美白等領(lǐng)域的應(yīng)用會更加廣泛。