韓月　李占君　李夢媛　楊逢建

摘 要：為研究油樺中三萜類化合物的提取工藝，以油樺樹皮為原料，采用超聲法提取三萜類化合物，建立油樺中三萜類化合物的高效液相色譜測定方法。應(yīng)用單因素實驗和響應(yīng)面法考察不同超聲因素對油樺中三萜類化合物總提取率的影響。最后得到的最佳條件為：超聲功率380 W，提取時間42 min，提取溫度63 ℃。油樺三萜類化合物的總提取率為280.72%，與理論推測值281.54%±0.55%一致。結(jié)果表明，超聲法提取三萜類化合物工藝合理可靠，提取率高。

關(guān)鍵詞：油樺;三萜類化合物;高效液相色譜法;超聲提取;響應(yīng)面優(yōu)化

中圖分類號：TQ654.2;TS205.4?? 文獻標(biāo)識碼：A? 文章編號：1006-8023（2021）02-0079-07

Optimization of the Extraction Process of Triterpenoids

from Betula ovalifolia by Response Surface

HAN Yue1， LI Zhanjun2， LI Mengyuan1， YANG Fengjian1*

（1.Key Laboratory of Forest Plant Ecology， Ministry of Education， Northeast Forestry University， Harbin 150040， China;

2.Yichun Branch of Heilongjiang Academy of Forestry， Yichun 153000， China）

Abstract：In order to study the extraction process of triterpenoids in Betula ovalifolia， the Betula ovalifolia bark was used as raw material to extract triterpenoids by ultrasonic method， and a high performance liquid chromatography method for the determination of triterpenoids in Betula ovalifolia was established. Single factor experiment and response surface method were used to investigate the effect of different ultrasonic factors on the total extraction yield of triterpenoids in Betula ovalifolia. The best condition obtained in the end was： ultrasonic power was 380 W， extraction time was 42 min， extraction temperature was 63 ℃. The total extraction yield of triterpenoids from Betula ovalifolia was 280.72%， which was consistent with the theoretically estimated value of 281.54% ± 0.55%. The results showed that the ultrasonic extraction of triterpenoids was reasonable and reliable， and the extraction rate was high.

Keywords：Betula ovalifolia; triterpenoids; high performance liquid chromatography; ultrasonic extraction; RSM

收稿日期：2020-11-09

基金項目：黑龍江省林業(yè)科技項目（Hljlykj2018-1）

第一作者簡介：韓月，碩士研究生。研究方向為植物資源學(xué)。E-mail： 1515538905@qq.com

通信作者：楊逢建，博士，教授。研究方向為植物資源學(xué)。E-mail： yangfj@nefu.edu.cn

引文格式：韓月，李占君，李夢媛，等. 響應(yīng)面優(yōu)化油樺中三萜類化合物提取工藝[J].森林工程，2021，37（1）：79-85.

HAN Y， LI Z J， LI M Y， et al. Optimization of the extraction process of triterpenoids from Betula ovalifolia by response surface[J]. Forest Engineering，2021，37（1）：79-85.

0 緒論

油樺（Betula ovalifolia）是樺木科樺木屬的一種灌木，分布于中國東北部地區(qū)[1]。近年來，從天然植物中提取和分離活性物質(zhì)用于臨床藥物的研究和開發(fā)已成為人們關(guān)注的熱點。研究發(fā)現(xiàn)，樺樹皮中含有大量的三萜類化合物，功效應(yīng)用廣[2-4]。其中白樺脂酸、白樺脂醇和羽扇豆醇等為樺樹皮中的天然活性成分。三萜類化合物具有抗腫瘤、抗炎和抗病毒的作用。特別是針對艾滋病具有良好的生物學(xué)抗性，在藥物研發(fā)中有很高的利用價值[5-8]。

目前對樺木屬植物的研究主要集中在白樺樹皮中三萜類化合物的提取分離、結(jié)構(gòu)鑒定等方面[9-12]。而對油樺的研究大多集中在植被覆蓋、群落生態(tài)以及林下經(jīng)濟等方面，其活性物質(zhì)的提取以及含量的測定未見報道[13-15]。

超聲提取具有操作簡單、超聲水浴可同時做多個樣品、實驗效率高、超聲波震動作用能使物質(zhì)充分溶出、提取率高等特點，使其成為提取植物中天然活性成分的常用方式[16-17]。小興安嶺植物資源眾多，油樺分布廣泛，其中的天然活性成分具有很大的藥用價值和發(fā)展前景。本實驗以乙酸乙酯為提取溶劑，超聲輔助提取，利用單因素實驗和響應(yīng)面法對油樺中三萜類化合物的提取工藝進行優(yōu)化，為油樺中三萜類化合物的開發(fā)利用提供參考。

1 材料與儀器

1.1 材料與試劑

油樺樹皮于2020年6月在黑龍江省小興安嶺采集。實驗用品：白樺脂酸、白樺脂醇、羽扇豆醇標(biāo)準(zhǔn)品（上海源葉生物科技有限公司）、實驗用超純水（實驗室自制）、乙酸乙酯（天津富宇精細化工有限公司）、色譜乙酸（天津科密歐化學(xué)試劑有限公司）、色譜級乙腈（SK公司）、色譜級甲醇（SK公司）等藥品均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

高效液相色譜儀（型號：1260，美國安捷倫公司）;電子分析天平（型號：UH620H，日本SHIMADZU島津）;醫(yī)用離心機（型號：H1650，長沙市高新技術(shù)產(chǎn)業(yè)開發(fā)區(qū)湘儀離心機器有限公司）;數(shù)控超聲波清洗機（型號：JP-100ST，深圳市潔盟清洗設(shè)備有限公司）等。

2 實驗方法

2.1 供試品溶液的制備

將油樺樹皮置60 ℃鼓風(fēng)干燥箱干燥，粉碎機破碎，過篩，收集起來備用。取油樺樹皮粉末0.5 g，倒入25 mL容量瓶中，加入提取溶劑乙酸乙酯10 mL，超聲處理30 min;制備完畢，將提取混合溶液放置室溫冷卻，定容搖勻。用移液槍吸取提取液5 mL，移入10 mL離心管，高速（10 000 r/min）離心10 min，取上清液即為待測溶液。

2.2 液相色譜條件

Diamonsil-C18色譜柱（4.6 mm×250 mm×5 μm）。白樺脂酸、白樺脂醇檢測條件：

流動相A為乙腈（含0.1 %乙酸），流動相B為水（含0.1 %乙酸），梯度洗脫，洗脫程序見表1[18];柱溫為30 ℃;檢測波長為210 nm;進樣量為10 μL。羽扇豆醇檢測條件：以100%甲醇為流動相;流速為1.2 mL/min;柱溫為25 ℃;檢測波長為210 nm;進樣量為10 μL[19]。

2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

將白樺脂酸、白樺脂醇、羽扇豆醇3種標(biāo)準(zhǔn)品分別溶于無水乙醇，0.45 μm有機膜過濾，得到質(zhì)量濃度為1 mg/mL的母液，用無水乙醇將白樺脂酸、白樺脂醇、羽扇豆醇的母液依次稀釋質(zhì)量濃度為31.25、62.5、125、250、500、1 000 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)品溶液。用液相色譜確定標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的出峰時間，以質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，以峰面積為縱坐標(biāo)進行回歸分析。得到：白樺脂酸回歸方程為y=7 360.9x-5.947 3（R2=0.999 6），線性范圍為31.25～1 000 μg/mL;白樺脂醇回歸方程為 y=7 597.8x+29.983（R2=0.999 5），線性范圍為31.25～1 000 μg/mL;羽扇豆醇回歸方程為y=3 018.8x+11.911（R2=0.999 8），線性范圍為31.25～1 000 μg/mL。對照品及樣品色譜圖如圖1和圖2所示。

2.4 總提取率的測定

將供試品溶液測得的峰面積代入標(biāo)準(zhǔn)曲線中，分別計算出油樺樹皮中所含白樺脂酸、白樺脂醇和羽扇豆醇3種有效物質(zhì)的提取率，計算公式為：

Y0 = （M1 / M2） × 100%。? （1）

式中：Y0為有效物質(zhì)得率，%;M1為有效物質(zhì)提取所得質(zhì)量的算術(shù)平均值，g;M2為未經(jīng)提取處理前油樺樹皮粉末質(zhì)量，g。

Y1 =（ Ma / Mb））× 100%。?? （2）

式中：Y1為有效物質(zhì)含有率，%;Ma為有效物質(zhì)完全充分提取所得質(zhì)量的算術(shù)平均值，g;Mb為未經(jīng)提取處理前油樺樹皮粉末質(zhì)量，g。

Y2 = （Y0 / Y1 ）× 100%。?? （3）

式中：Y2為有效物質(zhì)提取率，%;Y0為有效物質(zhì)得率，%;Y1為有效物質(zhì)含有率，%。

Y總 = y1 +y2 +y3。???????? （4）

式中：Y總為總提取率，%;y1為白樺脂酸提取率，%; y2為白樺脂醇提取率，%; y3為羽扇豆醇提取率，%。

2.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與處理

實驗操作過程中，數(shù)據(jù)的統(tǒng)計與處理用 Origin Pro 9.0和Design Expert 10。

2.6 單因素實驗

2.6.1 不同功率對總提取率的影響

具體操作為：稱取干燥過的樹皮粉末0.5 g，固定水浴溫度30 ℃，液料比15∶1 mL/g，時間30 min，研究功率為200、300、400、500、600 W條件下對總提取率的影響。

2.6.2 不同液料比對總提取率的影響

稱取干燥后的樹皮粉末0.5 g。固定條件：功率400 W，水浴溫度30 ℃，時間30 min，考查液料比為5∶1、10∶1、15∶1、20∶1、25∶1 mL/g對總提取率的影響。

2.6.3 不同提取時間對總提取率的影響

稱取干燥樹皮粉末0.5 g，固定功率400 W，水浴溫度30 ℃，液料比20∶1 mL/g，分別研究10、20、30、40、50 min條件下對總提取率的影響。

2.6.4 不同提取溫度對總提取率的影響

稱取干燥樹皮粉末0.5 g，固定功率400 W，液料比20∶1 mL/g，時間40 min，探討溫度30、40、50、60、70 ℃對總提取率的影響。

2.7 響應(yīng)面法優(yōu)化提取工藝

根據(jù)單因素實驗結(jié)果，選取對總提取率影響程度較高的因素：超聲功率、超聲時間、水浴溫度作為自變量，采用三因素三水平設(shè)計Box-Behnken Design實驗，實驗因素與水平見表2。

3 結(jié)果與分析

3.1 單因素實驗結(jié)果分析

3.1.1 不同提取功率對總提取率的影響

隨著功率的增加，總提取率先升高后降低（圖3），當(dāng)超聲功率達到400 W時，總提取率達到最大值;功率在400 W后，總提取率開始下降。主要原因在于超聲的空化作用和直進流作用在400 W時達到了飽和狀態(tài)，使溶質(zhì)充分溶解，所以超聲功率為400 W。

3.1.2 不同液料比對總提取率的影響

液料比不斷增大，總提取率逐漸上升，當(dāng)液料比達到20∶1 mL/g時，總提取率最高（圖4），表明溶質(zhì)的滲出率高，在溶劑中的溶解度達到了動態(tài)平衡。進一步增加溶劑的用量，總提取率下降。由于溶劑的增多致使三萜類化合物的含量下降，液料比以20∶1 mL/g進行下一步的實驗。

3.1.3 不同提取時間對總提取率的影響

隨著超聲時間的延長，總提取率逐漸升高，延長時間，溶質(zhì)溶解的較好，但40 min之后總提取率趨于穩(wěn)定甚至略有下降（圖5）。當(dāng)油樺中的三萜類有效成分在溶劑擴散過程中達到平衡時，總提取率隨提取時間的延長無明顯變化，因此選用提取時間為40 min進行下一步的優(yōu)化設(shè)計。

3.1.4 不同提取溫度對總提取率的影響

在40～60 ℃，隨著提取溫度的增加，總提取率逐漸增大（圖6）。在60 ℃時達到了較好的提取效果，其原因是溫度高、介質(zhì)溶出速率高、滲透速度快、溶解度大，提高了總提取率。但是過高的溫度，易使溶劑揮發(fā)和破壞物質(zhì)本身的結(jié)構(gòu)，影響提取率。因此最佳提取溫度為60 ℃。

3.2 響應(yīng)面優(yōu)化實驗結(jié)果

3.2.1 模型的建立及顯著性檢驗

按照表2的實驗設(shè)計，進行Box-Behnken響應(yīng)面設(shè)計，根據(jù)表3實驗數(shù)據(jù)進行多元回歸擬合，得到的回歸方程為：

Y（%）=+280.08-5.36A+4.26B+3.41C-1.35AB-0.17AC+3.51BC-12.61A2-14.95B2-7.51C2。

根據(jù)表4方差分析結(jié)果來看，該擬合優(yōu)化模型F=80.72，P< 0.01，表明該擬合優(yōu)化模型差異極顯著，而失擬項中F=3.80，P=0.115 2>0.05，表示差異不顯著，模型擬合度良好。且A、B、C各因素之間互不干擾。該實驗設(shè)計能較好地反映提取功率、提取時間和提取溫度對總提取率的顯著影響。模型中的單一因素功率（A）、時間（B）、溫度（C）和二次項中的A2、B2、C2，以及組合性因素中的BC的P值均小于0.01，表明對油樺三萜類化合物總提取率有極顯著影響;組合性因素AB、AC的P值均大于0.05，影響不顯著，說明交互作用弱。根據(jù)F值的大小，判斷各超聲因素對總提取率影響的強弱為：A>B>C，3者共同影響三萜類化合物的總提取率。

擬合優(yōu)化模型的綜合決定系數(shù)和校正決定系數(shù)分別為R2 = 0.990 5和AdjR2 = 0.978 2（表5）。表明回歸模型具有較高的擬合度，模型和方程可以用來推斷實驗結(jié)果，該模型可用于優(yōu)化油樺中三萜類化合物的提取工藝。

3.2.2 響應(yīng)面優(yōu)化傘狀圖

響應(yīng)面底部的投影是一個等高線圖，等高線圖的形狀反映了這2個因素之間的相互作用。圖7底部的投影為圓形，表明功率A和時間B的交互作用不顯著，圖8底部的投影為圓形，表示功率A和溫度C之間的相互作用不顯著，圖9底部的投影為橢圓形，表示時間B和溫度C的交互作用強，即時間和溫度的交互作用對油樺中三萜類化合物的提取率影響顯著，這與響應(yīng)面優(yōu)化的模型方程方差分析結(jié)果相符。

3.2.3 最優(yōu)工藝條件的驗證與對比實驗

通過回歸模型分析，確定最佳實驗條件為：超聲功率377.59 W，提取時間41.84 min，提取溫度62.72 ℃。在此條件下，三萜類化合物的總提取率達到281.54%。考慮到實際情況的可操作性，調(diào)整

參數(shù)為：超聲功率380 W，提取時間42 min，提取溫度63 ℃。進行3次重復(fù)實驗驗證，得到的總提取率值為280.72%，與理論值281.54% ± 0.55%接近，表明優(yōu)化的條件可靠，具有實際應(yīng)用價值。

4 結(jié)論

本實驗以乙酸乙酯為溶劑，采用超聲提取，利用高效液相色譜法檢測三萜類化合物含量。通過單因素實驗確定了三萜類化合物的提取條件，采用響應(yīng)面法建立了油樺中三萜類化合物總提取率的回歸模型。根據(jù)擬合優(yōu)化模型，各超聲因素對總提取率的影響由大到小順序為：功率（A）、時間（B）、溫度（C）。獲得的最佳提取條件為：超聲功率380 W，提取時間42 min，提取溫度63 ℃，總提取率為280.72%。這與曾慧慧等[20]研究的超聲提取海南眼樹蓮中三萜類化合物獲得的工藝條件基本相符，與理論預(yù)測值281.54%±0.55%偏差不大，實驗結(jié)果較好。該工藝條件可為油樺中三萜類化合物的進一步開發(fā)利用提供依據(jù)。

【參考文獻】

[1]中國科學(xué)院中國植物志編輯委員會.中國植物志[M].北京： 科學(xué)出版社， 2004.

Editorial Board of Chinese Flora， Chinese Academy of Sciences. Flora of China[M]. Beijing： Science Press， 2004.

[2]陸靜， 王敏， 徐鳳玲， 等. 樺樹皮中白樺脂酸和白樺脂醇的提取與含量測定[J]. 科技視界， 2015，5（30）： 48-49.

LU J， WANG M， XU F L， et al. Extraction and determination of betulinic acid and betulin alcohol in birch bark[J]. Science & Technology Vision， 2015， 5（30）： 48-49.

[3]杜國華， 王宏旭， 閆征， 等. 靈芝三萜化合物的抗腫瘤靶點預(yù)測與活性驗證[J]. 中國中藥雜志， 2017， 42（3）： 517-522.

DU G H， WANG H X， YAN Z， et al. Anti-tumor target prediction and activity verification of Ganoderma lucidum triterpenoids[J]. China Journal of Chinese Materia Medica， 2017， 42（3）： 517-522.

[4]PREZ GUTIRREZ R M. Anti-inflammatory effect of birsonimadiol from seeds of Byrsonima crassifolia[J]. Food Science and Biotechnology， 2016， 25（2）： 561-566.

[5]范炳芝， 王一鑫， 廉霄甜， 等. 三萜類化合物抗病毒的構(gòu)效關(guān)系及其作用機制研究進展[J]. 化工學(xué)報， 2020， 71（9）： 4071-4101.

FAN B Z， WANG Y X， LIAN X T， et al. Structure-activity relationships and mechanisms of triterpenoids against virus[J]. CIESC Journal， 2020， 71（9）： 4071-4101.

[6]楊亞蘭， 任佳麗， 張慧. 食用菌中萜類物質(zhì)及其生物活性研究進展[J]. 食品工業(yè)科技， 2019， 40（1）： 305-310.

YANG Y L， REN J L， ZHANG H. Research progress of terpenoids and bioactivities in edible mushroom[J]. Science and Technology of Food Industry， 2019， 40（1）： 305-310.

[7]肖蘇龍， 王晗， 王琪， 等. 基于五環(huán)三萜先導(dǎo)結(jié)構(gòu)的抗病毒抑制劑研究進展[J]. 中國科學(xué)（化學(xué)）， 2015， 45（9）： 865-883.

XIAO S L， WANG H， WANG Q， et al. Recent progresses on pentacyclic triterpene-based antiviral agents[J]. Scientia Sinica Chimica， 2015， 45（9）： 865-883.

[8]張建紅， 劉琬菁， 羅紅梅. 藥用植物萜類化合物活性研究進展[J]. 世界科學(xué)技術(shù)-中醫(yī)藥現(xiàn)代化， 2018， 20（3）： 419-430.

ZHANG J H， LIU W J， LUO H M. Advances in activities of terpenoids in medicinal plants[J]. World Science and Technology-Modernization of Traditional Chinese Medicine， 2018， 20（3）： 419-430.

[9]孫燕， 葛斐林， 薛春苗， 等. 天然產(chǎn)物中五環(huán)三萜類化合物檢測方法的研究進展[J]. 中國現(xiàn)代中藥， 2019， 21（4）： 552-558.

SUN Y， GE F L， XUE C M， et al. Advances in determination method of pentacyclic triterpenoids in natural products[J]. Modern Chinese Medicine， 2019， 21（4）： 552-558.

[10]樊蓉蓉， 張文輝， 何婷， 等. 黃龍山白樺樺木醇與樺木酸含量研究[J]. 西北植物學(xué)報， 2015， 35（9）： 1837-1845.

FAN R R， ZHANG W H， HE T， et al. Contents of betulin and betulinic acid of Betula platyphylla in Huanglong mountain[J]. Acta Botanica Boreali-Occidentalia Sinica， 2015， 35（9）： 1837-1845.

[11]周亞敏， 林麗美， 夏伯候. 白樺脂酸制備方法和藥理活性研究進展[J]. 天然產(chǎn)物研究與開發(fā)， 2016， 28（6）： 978-985.

ZHOU Y M， LIN L M， XIA B H. Review on preparation technology and pharmacological activity of betulinic acid[J]. Natural Product Research and Development， 2016， 28（6）： 978-985.

[12]劉美紅， 李帥嵐， 張蓮， 等. 女貞屬植物的化學(xué)成分和藥理活性研究進展[J]. 中草藥， 2020， 51（12）： 3337-3348.

LIU M H， LI S L， ZHANG L， et al. Review on research progress of chemical constituents and pharmacological activities of Ligustrum[J]. Chinese Traditional and Herbal Drugs， 2020， 51（12）： 3337-3348.

[13]劉超， 卜兆君， 馬進澤， 等. 哈泥泥炭地落葉和常綠兩類灌木對氮磷輸入增加響應(yīng)的對比[J]. 生態(tài)學(xué)雜志， 2015， 34（10）： 2711-2719.

LIU C， BU Z J， MA J Z， et al. Comparative study on the response of deciduous and evergreen shrubs to nitrogen and phosphorus input in Hani Peatland of Changbai Mountains[J]. Chinese Journal of Ecology， 2015， 34（10）： 2711-2719.

[14]FONSECA F C S， REIS L C B， DOS SANTOS J D G， et al. Betulinic acid from Zizyphus joazeiro bark using focused microwave-assisted extraction and response surface methodology[J]. Pharmacognosy Magazine， 2017， 13（50）： 226-229.

[15]POPOV S A， SHEREMET O P， KORNAUKHOVA L M， et al. An approach to effective green extraction of triterpenoids from outer birch bark using ethyl acetate with extractant recycle[J]. Industrial Crops and Products， 2017， 102： 122-132.

[16]李占君，高金輝，郭興，等.紫蘇籽油超聲提取工藝及其理化性質(zhì)的研究[J].森林工程，2019，35（4） ： 76-81.

LI Z J， GAO J H， GUO X， et al. Research on the ultrasonic extraction process and physicochemical properties of Perilla seed oil[J]. Forest Engineering， 2019， 35（4）：76-81.

[17]李占君，劉運偉，馬珂，等.響應(yīng)面優(yōu)化紫蘇籽油超聲提取工藝研究[J].森林工程，2020，36（2） ： 67 -72.

LI Z J， LIU Y W， MA K， et a. Research on ultrasonic extraction technology of Perilla seed[J]. Forest Engineering， 2020， 36（2）：67-72.

[18]王遂， 趙慧， 楊傳平， 等. 四倍體樺樹樹皮中三萜化合物的測定與評價[J]. 北京林業(yè)大學(xué)學(xué)報， 2015， 37（9）： 53-61.

WANG S， ZHAO H， YANG C P， et al. Analysis and evaluation of triterpenoids in tetraploid birch （Betula）[J]. Journal of Beijing Forestry University， 2015， 37（9）： 53-61.

[19]LERMA-TORRES J M， NAVARRO-OCAA A， CALDERN-SANTOYO M， et al. Preparative scale extraction of mangiferin and lupeol from mango （Mangifera indica L.） leaves and bark by different extraction methods[J]. Journal of Food Science and Technology， 2019， 56（10）： 4625-4631.

[20]曾慧慧， 樊自強， 楊莉， 等.響應(yīng)面法優(yōu)化海南眼樹蓮中三萜類化合物的提取工藝[J]. 熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)， 2020， 40（9）：94-104.

ZENG H H， FAN Z Q， YANG L， et al. Optimization of extraction of triterpenoids from Dischidia chinensis in Hainan by response surface methodology[J]. Journal of Tropical Agriculture， 2020， 40（9）： 94-104.