李靜　郭成博　李正華　白卉

摘 要：最佳授粉時(shí)期的判定是山楊定向育種工程實(shí)施的關(guān)鍵技術(shù)環(huán)節(jié)，可以指導(dǎo)山楊授粉雜交，提高育種效率。本研究以在山楊優(yōu)良種源中選取的優(yōu)良單株為實(shí)驗(yàn)材料，采用柱頭形態(tài)學(xué)觀察，結(jié)合聯(lián)苯胺-過(guò)氧化氫試劑法對(duì)其可授性進(jìn)行研究，同時(shí)對(duì)不同長(zhǎng)度、直徑的雌花枝做保留不同葉芽和花芽數(shù)量處理、觀測(cè)，分析其花序長(zhǎng)度、千粒質(zhì)量等指標(biāo)，探討花枝質(zhì)量對(duì)花芽發(fā)育的影響。研究結(jié)果顯示，在溫室水培環(huán)境下，山楊雌蕊可授期持續(xù)3 d左右，雌蕊柱頭外部形態(tài)特征與可授時(shí)期有一定相關(guān)性，花序松散伸長(zhǎng)，柱頭能夠全部探出芽鱗，開(kāi)裂角度約180°，呈紅色且柱頭分泌出大量晶瑩透亮的黏液，聯(lián)苯胺-過(guò)氧化氫染色出現(xiàn)大量氣泡，柱頭為深藍(lán)色時(shí)是山楊最佳的授粉時(shí)期。柱頭完全露出，濕潤(rùn)且分泌大量黏液的形態(tài)特征可以作為山楊雌蕊進(jìn)入最佳可授期的標(biāo)志信號(hào)，用來(lái)指導(dǎo)山楊雜交育種授粉。底端直徑2 cm左右、長(zhǎng)度2 m的花枝保留2～3個(gè)花序，保留1對(duì)頂端葉芽時(shí)最有利于花芽和種子發(fā)育。

關(guān)鍵詞：山楊;最佳授粉時(shí)期;可授性

中圖分類號(hào)：S792.11;S722.3?? 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A? 文章編號(hào)：1006-8023（2021）02-0011-07

Study on Stigma Receptivity and Effects of Female Flowering Branches

Quality on Flower Bud Development of Populus davidiana

LI Jing， GUO Chengbo， LI Zhenghua*， BAI Hui*

（Heilongjiang Forestry Institute， Harbin 150081， China）

Abstract：The determination of the optimum pollination period was the key technology in the implementation of Populus davidiana directive breeding project， which can guide the hybrid pollination of populus davidiana and improve the breeding efficiency. Choosing Populus davidiana single plants selected from superior provenances as the research object， the stigma receptivity and optimal pollination period of Populus davidiana were studied by testing benzidine-H2O2 method and morphological observations. At the same time， female flowering branches with different lengths and diameters were treated with different leaf buds and flower bud number to observe and analyze inflorescence length， 1 000-grain weight and other indexes， to explore the influence of female flowering branches quality on flower bud development. The results showed that under a greenhouse condition， the stigma of the optimal receptivity stage of Populus davidiana was 3 d. The external morphological characteristics of the pistil stigma had a certain correlation with the receptive period. The optimal pollination period of Populus davidiana was when the inflorescence was loose and elongated， the stigma could all protrude out of bud scales， the cracking angle was about 180° and the stigma was red and secreated a lot of crystal clear mucus， benzidine-H2O2 staining appeared a lot of bubbles， and the stigma changed to deep blue. The morphological characteristics of stigma fully exposed， moist and secreting a lot of mucus could be used as a signal of the optimal pollination period of Populus davidiana， which could be used to guide the cross breeding and pollination of Populus davidiana. There was the best for flower bud and seed development that flower shoot retain 2 to 3 inflorescences and retain the only one pair leaf bud at the top with the bottom diameter was 2 cm and length was 2 m.

Keywords：Populus davidiana; optimal pollination period; stigma receptivity

收稿日期：2020-11-04

基金項(xiàng)目：黑龍江省森工總局青年基金項(xiàng)目 （sgzjQ2016002）;國(guó)家林業(yè)和草原局林業(yè)科技發(fā)展項(xiàng)目（KJZXZF2019005）;黑龍江省省屬科研院所基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)專項(xiàng)（2012-04）

第一作者簡(jiǎn)介：李靜，碩士，助理研究員。研究方向?yàn)闂顦?shù)倍性育種。E-mail： muerliji@163.com

通信作者：白卉，博士，研究員。研究方向?yàn)榱帜具z傳育種。E-mail： baihui1979@163.com

并列通信作者：李正華，碩士，副研究員。研究方向?yàn)榧?xì)胞生物學(xué)。E-mail： 115491310@qq.com

引文格式：李靜，郭成博，李正華，等. 山楊柱頭可授性及雌花枝質(zhì)量對(duì)花芽發(fā)育影響[J].森林工程，2021，37（2）：11-17.

LI J， GUO C B， LI Z H， et al. Study on stigma receptivity and effects of female flowering branches quality on flower bud development of Populus davidiana[J]. Forest Engineering，2021，37（2）：11-17.

0 引言

山楊（Populus davidiana ）屬于白楊派樹(shù)種，用途廣泛，適生范圍廣，主要分布于：20～55° N，100～135° E，垂直分布海拔為200～3 500 m，東北、華北、西北、華中乃至西南的眾多省區(qū)，全國(guó) 23 個(gè)省區(qū)分布的山楊總面積可達(dá)200萬(wàn)hm2以上。其材質(zhì)潔白、輕軟富彈性，結(jié)構(gòu)、紋理和纖維素含量等指標(biāo)較其他楊樹(shù)樹(shù)種優(yōu)勢(shì)明顯，造紙時(shí)不加填充料，工藝簡(jiǎn)單[1]，成品紙張品質(zhì)極佳。但天然山楊林心腐嚴(yán)重，未經(jīng)選育的山楊植株生長(zhǎng)緩慢[2]。因此，山楊優(yōu)良品種的選育對(duì)適生區(qū)人工林營(yíng)建和高品質(zhì)木材生產(chǎn)均具有重要意義[3]。傳統(tǒng)的選優(yōu)、雜交等育種方式難以滿足現(xiàn)階段山楊遺傳改良需求，多倍體育種能最大幅度綜合雜種優(yōu)勢(shì)和倍性優(yōu)勢(shì)，發(fā)揮其在林木遺傳改良作用，這是山楊良種培育行之有效的捷徑[4-6]。

植物雌蕊柱頭的可授期代表柱頭發(fā)育的一個(gè)階段，并不僅僅局限于特定的時(shí)間點(diǎn)，短則幾小時(shí)，長(zhǎng)則十幾天。植物最佳授粉時(shí)間的準(zhǔn)確判定是保證雜交成功的關(guān)鍵因素之一。通過(guò)植物柱頭可授性的研究，明確雌蕊柱頭的最佳授粉時(shí)期，不僅可以減少授粉工作量，而且還可以大大提高雜交的成功率。在育種工作方面已有通過(guò)可授期研究提高雜交效率的報(bào)道[7]。雌蕊柱頭可授性的檢測(cè)方法很多，其中定期授粉觀察花粉萌發(fā)較準(zhǔn)確，可靠程度高，但需要的時(shí)間相對(duì)較長(zhǎng)。當(dāng)植物雌蕊柱頭具有可授性時(shí)，柱頭表面往往伴隨著高度的酶活性，目前已發(fā)現(xiàn)一些酶和蛋白的存在與柱頭可授性的獲得，與喪失變化相一致，基于柱頭酶活性鑒定而建立的聯(lián)苯胺-過(guò)氧化氫法應(yīng)運(yùn)而生，現(xiàn)已廣泛應(yīng)用于楊樹(shù)、油棕、木槿和風(fēng)箱果等多種植物柱頭可授期和最佳授粉期檢測(cè)[8-10]。雌蕊柱頭可授期以及最佳授粉時(shí)期的明確可以減少工作量，精準(zhǔn)指導(dǎo)雜交，提高育種效率和雜交成功率，進(jìn)而提高綜合雜交和多倍體優(yōu)勢(shì)的誘變育種中突變體獲得比率，構(gòu)建高質(zhì)量、大基數(shù)的品種選育群體，成功實(shí)現(xiàn)纖維用材林的育種目標(biāo)，是山楊定向育種工程實(shí)施的關(guān)鍵技術(shù)環(huán)節(jié)。大多數(shù)生殖期山楊優(yōu)良種源的株高較高使得取材不便，為了更好地利用優(yōu)良資源，本研究對(duì)不同規(guī)格雌花枝做不同處理后對(duì)花芽長(zhǎng)度、千粒質(zhì)量等進(jìn)行觀測(cè)分析，探討花枝質(zhì)量對(duì)花芽發(fā)育的影響。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

本研究使用的山楊植株取于牡丹江林口縣青山林場(chǎng)內(nèi)山楊優(yōu)良種質(zhì)資源保存林。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 花枝的采集

2月下旬選擇雌雄株優(yōu)樹(shù)，采集樹(shù)冠中上部、向陽(yáng)面和花芽發(fā)育飽滿的枝條，花枝直徑為0.5、1、1.5 cm，長(zhǎng)度為1、1.5、2 m，采集的花枝用塑料膜包裹嚴(yán)密，在-5～3 ℃低溫中貯藏備用。

1.2.2 花枝質(zhì)量對(duì)花芽發(fā)育影響正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

為探討花枝質(zhì)量對(duì)花芽發(fā)育影響，以花枝長(zhǎng)度、花枝下端直徑、葉芽保留數(shù)量和花芽保留數(shù)量為因素，做了四因素三水平正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)（L934），統(tǒng)計(jì)授粉期花芽長(zhǎng)度和千粒質(zhì)量衡量花芽發(fā)育質(zhì)量以及種子質(zhì)量，每組實(shí)驗(yàn)3次重復(fù)，見(jiàn)表1。

1.2.3 雌花枝的培養(yǎng)

低溫貯藏的雌花枝水培前需預(yù)處理，將長(zhǎng)勢(shì)差、過(guò)密和徒長(zhǎng)無(wú)花芽的枝條修剪掉，2～3 d換一次水。溫室水培時(shí)溫度保持在白天20～25 ℃，夜晚10～15 ℃。

用于可授性試驗(yàn)的花枝根據(jù)最利于花芽發(fā)育的組合進(jìn)行處理。

1.2.4 雄花枝的培養(yǎng)和花粉的采集

水培前需與雌花枝一樣整枝，具體做法和水培條件參照1.2.3。雄花枝比雌花枝提早一周水培，水培后勤觀察，及時(shí)收粉，用硫酸紙做成漏斗，輕抖小枝，動(dòng)作輕柔將花粉收集到玻璃小瓶中，在瓶中加入變色硅膠干燥劑，4 ℃冰箱低溫冷藏備用。

1.2.5 雌蕊的觀測(cè)

3月中旬，將雌花枝置于溫室內(nèi)水培，從水培第2天開(kāi)始，每隔6 h采集雌蕊中上部柱頭，用鑷子取下，隨取隨測(cè)，每次檢測(cè)5朵花，試驗(yàn)重復(fù)3次。

雌蕊柱頭外部形態(tài)變化用體式顯微鏡（SMZ-140n2gg）觀察并拍照記錄。

可授性檢測(cè)采用李艷華等[11]和王君等[12]的聯(lián)苯胺-過(guò)氧化氫法。反應(yīng)液現(xiàn)配現(xiàn)用，在體視顯微鏡下觀察氣泡產(chǎn)生情況以及柱頭變色情況，若柱頭周圍變?yōu)樗{(lán)色并有氣泡產(chǎn)生，則記為柱頭具有可授性，若柱頭周圍變?yōu)樯钏{(lán)色并迅速產(chǎn)生大量氣泡，則記為柱頭為最佳可授期。

1.3 數(shù)據(jù)處理與分析

本試驗(yàn)數(shù)據(jù)用Excel 10.0進(jìn)行表格統(tǒng)計(jì)記錄，用SPSS 19.0進(jìn)行方差分析和多重比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 花枝質(zhì)量對(duì)花芽和種子發(fā)育影響

正交試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2。

利用正交設(shè)計(jì)對(duì)試驗(yàn)結(jié)果均值進(jìn)行直觀分析，結(jié)果見(jiàn)表3。極差R反映了影響因素對(duì)花序長(zhǎng)度的影響，R值越大，影響越顯著。由表3可知，該試驗(yàn)水平內(nèi)各因素水平的變化對(duì)花序長(zhǎng)度的影響由大到小依次為：花枝下端直徑、花枝長(zhǎng)度、葉芽保留數(shù)量、花芽保留數(shù)量。

每一因素水平下的均值反映了影響因素各水平對(duì)花序長(zhǎng)度的影響情況，均值越大，反應(yīng)水平越好。從表 3可以看出，4個(gè)影響因素的最佳組合并沒(méi)有在正交表中出現(xiàn)，用SPSS軟件對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行方差分析及多重比較，結(jié)果表明各因素的影響由大到小依次為：花枝下端直徑、花枝長(zhǎng)度、葉芽保留數(shù)量、花芽保留數(shù)量，該結(jié)果與極差分析相一致（表4）。經(jīng)多重比較可知，花序長(zhǎng)度在A3水平，即花枝長(zhǎng)度為2 m時(shí)最長(zhǎng)，與其他2個(gè)水平的差異顯著;花枝下端直徑B3水平，即1.5 cm最佳;葉芽保留數(shù)量C3水平，即僅頂端保留1對(duì)最佳;花芽保留數(shù)量D3水平最好，即保留2～3個(gè)最好，但水平2和水平3之間差異不顯著。根據(jù)各水平的多重比較，得出影響花序長(zhǎng)度的最佳組合：A3B3C3D3，即花枝長(zhǎng)度為2 m，花枝下端直徑為1.5 cm，葉芽保留數(shù)量為僅頂端保留1對(duì)，花芽保留數(shù)量為2～3。

從表3可知4個(gè)影響因子對(duì)千粒質(zhì)量的直觀分析結(jié)果表明，各因素水平的變化對(duì)千粒質(zhì)量的影響由大到小依次為：花枝長(zhǎng)度、花枝下端直徑、花芽保留數(shù)量、葉芽保留數(shù)量。方差分析及多重比較結(jié)果見(jiàn)表5。SPSS分析結(jié)果與直觀分析結(jié)果一致。經(jīng)多重比較可知，千粒質(zhì)量在A3水平，即花枝長(zhǎng)度為2 m時(shí)最大，且與其他兩個(gè)水平的差異顯著;花枝下端直徑B3水平，即1.5 cm最佳;葉芽保留數(shù)量C3水平，即僅頂端保留1對(duì)最佳，但水平2和水平3之間差異不顯著;花芽保留數(shù)量D3水平最好，即保留2～3個(gè)最好，且水平2和水平3之間差異不顯著。根據(jù)各水平的多重比較，得出影響千粒質(zhì)量的最佳組合：A3B3C3D3，即花枝長(zhǎng)度為2 m，花枝下端直徑為1.5 cm，葉芽保留數(shù)量為僅頂端保留1對(duì)，花芽保留數(shù)量為2～3個(gè)。不同長(zhǎng)度、直徑的雌花枝保留葉芽和花芽數(shù)量的不同能夠影響了花序長(zhǎng)度、千粒質(zhì)量等指標(biāo)。

2.2 雌蕊柱頭可授性及最佳授粉期判定

山楊雌蕊柱頭可授性和最佳授粉期的判定是提高雜交效率、保證雜交質(zhì)量的有效途徑。相關(guān)研究以證明聯(lián)苯胺-過(guò)氧化氫法是檢測(cè)楊樹(shù)可授性的有效方式[13-16]。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，山楊在溫室水培條件下雌蕊可授期持續(xù)3 d左右，雌蕊柱頭形態(tài)特征與可授性和最佳可授時(shí)期存在一定程度相關(guān)性。從表6可以看出，水培至186 h，花序緊密，柱頭緊密連接、未展開(kāi)，且光滑無(wú)黏液附著，顏色呈淺紅色，經(jīng)試劑反應(yīng)液測(cè)試未產(chǎn)生氣泡，顏色無(wú)變化，此階段雌蕊為非可授期;水培至192 h，花序伸長(zhǎng)微露柱頭，柱頭裂開(kāi)角度小于30°，表面分泌有少量黏液，顏色呈紅色，經(jīng)試劑反應(yīng)液測(cè)試仍未產(chǎn)生氣泡，顏色無(wú)變化。水培至204 h，花序繼續(xù)伸長(zhǎng)露出柱頭，柱頭開(kāi)裂角度大于60°，表面均勻分布著一層黏液，柱頭顏色仍為紅色，經(jīng)試劑反應(yīng)液測(cè)試產(chǎn)生少量氣泡，柱頭顯色為藍(lán)色，標(biāo)志著山楊雌蕊柱頭具有可授性，雌花進(jìn)入可授期。水培至216 h，花序松散，柱頭完全露出，柱頭開(kāi)裂角度加大至180°，此時(shí)肉眼即可觀測(cè)到雌花柱頭瑩潤(rùn)透亮，伴有大量黏液分泌，放入反應(yīng)液檢測(cè)時(shí)柱頭迅速產(chǎn)生大量氣泡，柱頭染色變?yōu)樯钏{(lán)色，此時(shí)可授性最強(qiáng)，進(jìn)入最佳授粉期。繼續(xù)溫室水培至276 h，花序伸長(zhǎng)至最長(zhǎng)，柱頭顏色變暗淡呈紅褐色，干燥無(wú)黏液并有萎蔫的趨勢(shì)，經(jīng)試劑反應(yīng)液測(cè)試不再有氣泡產(chǎn)生，此階段雌花序已經(jīng)失去活力，不再具可授性。如圖1和圖2所示。

3 結(jié)論與討論

不同長(zhǎng)度、直徑的雌花枝保留葉芽和花芽數(shù)量的不同直接影響了花序長(zhǎng)度、千粒質(zhì)量等指標(biāo)。通過(guò)這2個(gè)指標(biāo)初步探究了花枝質(zhì)量對(duì)花芽發(fā)育的影響，長(zhǎng)度越長(zhǎng)、底端直徑越粗的花枝，保留2～3個(gè)花序，頂端保留1對(duì)葉芽時(shí)最有利于花芽和種子發(fā)育。在試驗(yàn)過(guò)程中保留全部花芽的枝條，花芽發(fā)育到一定階段就停止生長(zhǎng)進(jìn)而萎蔫脫落，花序量大并沒(méi)有實(shí)現(xiàn)種子量大，而且結(jié)出的部分種子干癟，活力差。育種實(shí)踐中花序長(zhǎng)度達(dá)到一定程度代表著花序發(fā)育情況好，更有利于結(jié)種，而千粒質(zhì)量大的種子發(fā)育一般情況下也比質(zhì)量小的更有優(yōu)勢(shì)。僅保留1對(duì)頂端葉芽滿足植物蒸騰拉力，維持養(yǎng)分運(yùn)輸，又不過(guò)多消耗養(yǎng)分利于水培枝條發(fā)育與試驗(yàn)結(jié)果吻合。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，長(zhǎng)度2 m、底端直徑2 cm的花枝，保留2～3個(gè)花序和1對(duì)頂端葉芽時(shí)最有利于花芽和種子發(fā)育。但考慮到野外取樣時(shí)長(zhǎng)度太長(zhǎng)不便于運(yùn)輸，可結(jié)合實(shí)際情況考慮花枝縮短長(zhǎng)度至1.5 m。

雌蕊柱頭是雌蕊頂端接受花粉的部位，其表面形態(tài)和生理特征影響著花粉的粘附[17-20]，山楊柱頭依靠分泌出的一定數(shù)量的黏液來(lái)獲取空氣中飛揚(yáng)的花粉完成自然授粉過(guò)程，屬于風(fēng)媒授粉，這是自然演化的結(jié)果[21]。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，山楊雌蕊柱頭可授性與柱頭發(fā)育及其形態(tài)變化具有密切聯(lián)系，通過(guò)對(duì)柱頭形態(tài)的觀測(cè)對(duì)其可授性進(jìn)行估測(cè)具有可行性，當(dāng)花序松散，柱頭完全露出，晶瑩透亮、濕潤(rùn)、均勻分布有大量黏液的形態(tài)特征可以作為山楊雌蕊進(jìn)入可授期的標(biāo)志信號(hào)，更簡(jiǎn)便快捷的指導(dǎo)山楊授粉，而聯(lián)苯胺-過(guò)氧化氫試劑柱頭染色深藍(lán)色，迅速出現(xiàn)大量氣泡的時(shí)期為山楊最佳的授粉時(shí)期，可以更加精準(zhǔn)指導(dǎo)雜交，提高育種效率和雜交成功率。

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