曹聲生，朱本偉，高 翔，王劍朋，杜媛媛，周婉婷，姜進(jìn)舉，周明柱，姜 帥

(1.南京工業(yè)大學(xué) 食品與輕工學(xué)院，江蘇 南京 211800；2.青島明月海藻集團(tuán)有限公司，山東 青島 266400；3.宿遷市南京工業(yè)大學(xué)新材料研究院，江蘇 宿遷 223800)

巖藻多糖是一種天然雜多糖,是海帶(Laminariajaponica)、裙帶菜(UndariapinnatifidaSuringar)等大型褐藻門植物細(xì)胞間組織的主要成分，其結(jié)構(gòu)上是由L-巖藻糖作為主鏈骨架，并通過1,2或者1,3及1,4糖苷鍵與其他多種糖殘基(甘露糖、鼠李糖、葡萄糖醛酸和木糖等)及硫酸基結(jié)合形成[1]。研究發(fā)現(xiàn)，巖藻多糖具有多種生物活性：Silva等[2]發(fā)現(xiàn)來源于Padinagymnospora的巖藻多糖具有顯著的抗凝血活性，其結(jié)構(gòu)中的4-α-L-巖藻糖單元C3位置的硫酸酯含量對(duì)其抗凝血活性具有重要作用；Rocha等[3]研究發(fā)現(xiàn)，來源于Spatoglossumschroederi的巖藻多糖在體外實(shí)驗(yàn)中未表現(xiàn)出抗凝血活性，但是在形成血栓的動(dòng)物模型中卻表現(xiàn)出顯著的抗血栓形成作用。硫酸化的多糖例如巖藻多糖、卡拉膠等在實(shí)驗(yàn)中都表現(xiàn)出了抗病毒活性：Hayashi等[4]研究發(fā)現(xiàn)來源于Undariapinnatifida的巖藻多糖可以抑制單純皰疹病毒(HSV)的增殖，并能增強(qiáng)其免疫功能來抵御HSV病毒的侵染；Hidari等[5]研究發(fā)現(xiàn)巖藻多糖可以有效抑制登革熱Ⅱ型病毒的侵染，通過與DEN2顆粒進(jìn)行特異性地結(jié)合來達(dá)到抑制病毒與細(xì)胞合體的形成。此外，巖藻多糖還表現(xiàn)出顯著的抗腫瘤活性：Alekseyenko等[6]發(fā)現(xiàn)巖藻多糖可以有效抑制小鼠肺腺癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移；Hyun等[7]研究發(fā)現(xiàn)，利用巖藻多糖處理HCT-15結(jié)腸癌細(xì)胞后，部分細(xì)胞出現(xiàn)DNA斷裂等細(xì)胞凋亡現(xiàn)象，可有效抑制結(jié)腸癌細(xì)胞的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移。另外，巖藻多糖還具有多種免疫調(diào)節(jié)活性：Tissot等[8]研究證實(shí)巖藻多糖可以抑制正常人血清中的補(bǔ)體蛋白，以此來抑制細(xì)胞中補(bǔ)體的激活；Mizuno等[9]發(fā)現(xiàn)巖藻多糖可以刺激RAW264.7細(xì)胞產(chǎn)生腫瘤壞死因子，從而抑制細(xì)胞中白介素mRNA的表達(dá)。

綜上，巖藻多糖具有多種生物活性，受到了越來越多的來自于藥物研發(fā)、功能食品開發(fā)等領(lǐng)域研究者的重視與關(guān)注，但是有關(guān)巖藻多糖益生等活性的研究卻鮮有報(bào)道。此外，巖藻多糖存在分子量大、吸收性差、難以通過血腦屏障及吸收率低等缺點(diǎn)，其應(yīng)用受到了一定限制[10]。作為巖藻多糖的降解產(chǎn)物，巖藻寡糖(FOS)具有分子量小、水溶性和吸收性好、生物利用度高等多種巖藻多糖所不具備的優(yōu)點(diǎn)，克服了多糖在應(yīng)用過程中受到的種種限制，在功能食品開發(fā)、新型保健品開發(fā)等領(lǐng)域具有很好的應(yīng)用前景。因此，通過適當(dāng)?shù)姆椒▽r藻多糖的分子量降低，將其降解成小分子的寡糖是目前巖藻多糖及其產(chǎn)品開發(fā)亟待解決的問題。

本研究中，筆者以巖藻多糖為原料，采用酶法降解的方式制備了不同聚合度的巖藻寡糖混合物，通過電噴霧質(zhì)譜對(duì)其結(jié)構(gòu)進(jìn)行表征，并采用多種方法對(duì)降解得到的巖藻寡糖的抗氧化及益生活性進(jìn)行研究，以期為巖藻多糖資源的開發(fā)奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

巖藻多糖(來源于海帶Laminariajaponicia)，山東結(jié)晶集團(tuán)；ABTS+·、DPPH·，美國(guó)Sigma公司；透析袋(分子量100)，索萊寶公司；植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum,BIO-097551)和嗜酸乳桿菌(Lactobacillusacidophilus,BIO-099454)，中國(guó)工業(yè)微生物菌種保藏中心；巖藻多糖降解酶，實(shí)驗(yàn)室自制；無水乙醇、濃H2SO4、苯酚、水楊酸、丙酮、石油醚、NaCl、氯仿、正丁醇和抗壞血酸等化學(xué)試劑均為市售分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

Wtherm-B5型開口加熱循環(huán)浴槽、C410型防腐蝕隔膜真空泵，德國(guó)Wiggens公司；Scientz-18N型壓蓋型冷凍干燥機(jī)，寧波新芝生物科技公司；Allegra64R型高速臺(tái)式冷凍離心機(jī)，美國(guó)貝克曼公司；Ultrospec 7000型紫外可見光分光光度計(jì)，美國(guó)GE公司；LTQ XL線性離子阱質(zhì)譜分析儀，美國(guó)賽默飛公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 巖藻寡糖的酶法制備

稱取20 g巖藻多糖，溶于2 L去離子水中，加入適量巖藻多糖降解酶進(jìn)行水解反應(yīng)，反應(yīng)溫度為30 ℃，反應(yīng)48 h后，用二硝基水楊酸(DNS)法測(cè)定不同反應(yīng)時(shí)間的還原糖含量[11]，將反應(yīng)體系加熱到100 ℃來終止反應(yīng)。將反應(yīng)得到的產(chǎn)物冷凍干燥，得到巖藻寡糖粉末。

1.3.2 巖藻寡糖的電噴霧質(zhì)譜分析

取少量降解得到的寡糖，用透析袋除去里面的無機(jī)鹽等小分子雜質(zhì)，凍干后得到樣品，溶于水和乙腈1∶ 1體積比的混合液中，得到樣品液，取2 mL，用LTQ XL線性離子阱質(zhì)譜分析儀對(duì)樣品進(jìn)行負(fù)離子模式分析，條件如下：電源電壓4.5 kV，毛細(xì)管溫度275～300 ℃，管內(nèi)電壓250 V，鞘內(nèi)氣體30 AU。掃描范圍150～2 000m/z。

1.3.3 巖藻寡糖的體外抗氧化活性分析

1)ABTS+·清除能力計(jì)算。參照文獻(xiàn)[12]中的方法，將7.0 mmol/L ABTS+·溶液和2.45 mmol/L過硫酸鉀溶液等體積混合，室溫條件下避光反應(yīng)16 h，用磷酸鹽(PBS)緩沖液(pH 7.4)稀釋25倍，使其在734 nm處吸光值為0.700±0.050，即得ABTS+·工作液。取不同質(zhì)量濃度(0.2、0.4、0.6、1、2、4、8和10 mg/mL)的寡糖溶液0.2 mL，加入0.8 mL ABTS+·工作液，振搖充分混合，避光靜置15 min后，在734 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光值，每組實(shí)驗(yàn)做3個(gè)平行，以相同濃度梯度的維生素C作為對(duì)照。計(jì)算見式(1)。

(1)

式中:A1為樣品反應(yīng)后的吸光值；A2為ABTS+·工作液由等體積的PBS緩沖液代替的吸光值；A0為樣品溶液由等體積純水代替的吸光值。

2)DPPH·清除能力計(jì)算。參照文獻(xiàn)[13]中的方法，吸取1.0 mL不同濃度的巖藻寡糖溶液，加入 1.0 mL的0.2 mmol/L 的DPPH·乙醇溶液，充分混勻后在室溫下避光反應(yīng)，分別在0.5、6和12 h后測(cè)定波長(zhǎng)515 nm處的吸收值，每組實(shí)驗(yàn)做3個(gè)平行。計(jì)算見式(2)。

(2)

式中:A1′為樣品反應(yīng)后的吸光值;A2′為DPPH·溶液由等體積的無水乙醇溶液代替的吸光值;A0′為樣品溶液由等體積純水代替的吸光值。以巖藻寡糖濃度與對(duì)應(yīng)的清除率做顯性回歸方程，以此計(jì)算清除率為50%時(shí)的寡糖濃度，即為半清除濃度IC50。

3)·OH清除能力計(jì)算。按照文獻(xiàn)[14]中的方法，在4 mL離心管內(nèi)依次加入0.25 mL 9 mmol/L FeSO4溶液，0.25 mL 9 mmol/L 水楊酸-乙醇溶液，3 mL不同濃度(0.2、0.4、0.6、1、2、4、8、10 mg/mL)的寡糖溶液和0.25 mL 8.8 mmol/L H2O2溶液，充分混勻后在室溫下靜置1 h，然后在510 nm處測(cè)定吸光值，每組實(shí)驗(yàn)平行3次，以相同濃度梯度的維生素C作為對(duì)照。計(jì)算見式(3)。

(3)

式中：A1″為樣品反應(yīng)后的吸光值；A2″為不加H2O2改由等體積純水代替的吸光值；A0″為樣品溶液由等體積純水代替的吸光值。以巖藻寡糖濃度與對(duì)應(yīng)的清除率做顯性回歸方程，以此計(jì)算清除率為50%時(shí)的寡糖濃度，即為半清除濃度IC50。

1.3.4 巖藻寡糖的益生活性分析

參照文獻(xiàn)[15]中的方法，將植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum)和嗜酸乳桿菌(Lactobacillusacidophilus)分別接入MRS液體培養(yǎng)基，37 ℃(嗜酸乳桿菌需厭氧)培養(yǎng)48 h，之后經(jīng)兩次轉(zhuǎn)管復(fù)壯后備用。配制MRS液體培養(yǎng)基(不加葡萄糖)，調(diào)節(jié)pH至6.8。分別稱取50 mg的葡萄糖(glucose)和巖藻寡糖，加入菌種瓶中，每個(gè)樣品做一組平行對(duì)照(blank)。然后將配制好的液體培養(yǎng)基分裝入瓶中，分裝體積為5 mL，這樣培養(yǎng)基中碳水化合物(即糖含量)的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%。另外，用不加糖的培養(yǎng)基作為對(duì)照組。將培養(yǎng)基在121 ℃滅菌20 min，冷卻后接入200 μL復(fù)壯好的植物乳桿菌和嗜酸乳桿菌菌種，37 ℃(嗜酸乳桿菌需厭氧)培養(yǎng)，每隔2 h測(cè)一次OD值，繪制菌的生長(zhǎng)曲線。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

分析結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差(Mean ± SD)表示，采用SPSS 13.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)，每組實(shí)驗(yàn)設(shè)置3個(gè)平行實(shí)驗(yàn)。

2 結(jié)果與討論

2.1 巖藻寡糖的制備與結(jié)構(gòu)鑒定

2.1.1 巖藻多糖水解的還原糖曲線

為了監(jiān)測(cè)巖藻多糖水解過程進(jìn)行的程度，采用DNS法測(cè)定反應(yīng)體系中不同時(shí)間的還原糖含量，并以此繪制了巖藻多糖的降解曲線，結(jié)果如圖1所示。由圖1可知:在反應(yīng)的初始階段，還原糖的含量迅速上升，當(dāng)反應(yīng)時(shí)間為10 h時(shí)，反應(yīng)體系中的還原糖達(dá)到24 mg/mL；隨著反應(yīng)時(shí)間的進(jìn)一步延長(zhǎng)，反應(yīng)體系中的還原糖含量趨向于穩(wěn)定，當(dāng)反應(yīng)進(jìn)行到48 h后，測(cè)得反應(yīng)體系中的還原糖為27 mg/mL。

圖1 巖藻多糖降解過程中的還原糖曲線Fig.1 The curve of reducing sugars during the degradation procedure of fucoidan

2.1.2 巖藻寡糖的結(jié)構(gòu)鑒定

采用電噴霧質(zhì)譜對(duì)降解得到的寡糖產(chǎn)物進(jìn)行鑒定，結(jié)果如圖2所示。由圖2可知:寡糖混合物中主要包括單硫酸化([Fuc1SO3Na-Na]-、[Fuc2SO3Na-Na]-、[Fuc3SO3Na-Na]-、[Fuc4SO3Na-Na]-)、二硫酸化([Fuc2(SO3Na)2-Na]-、[Fuc4(SO3Na)2-Na]-、[Fuc5(SO3Na)2-Na]-)、三硫酸化([Fuc4(SO3Na)3-Na]-、[Fuc5(SO3Na)3-Na]-)和四硫酸化([Fuc4(SO3Na)4-Na]-、[Fuc5(SO3Na)4-Na]-)的巖藻糖及巖藻寡糖，分子量范圍為243～1 133，說明酶通過內(nèi)切模式作用于巖藻多糖底物，產(chǎn)生一系列具有不同聚合度的巖藻寡糖。

圖2 巖藻寡糖的ESI-MS分析Fig.2 ESI-MS analysis of fucoidan oligosaccharides

2.2 巖藻寡糖的體外抗氧化活性

2.2.1 巖藻寡糖的ABTS+·清除能力

ABTS+·被廣泛應(yīng)用于測(cè)定樣品的抗氧化能力。ABTS+·經(jīng)氧化形成相對(duì)穩(wěn)定的藍(lán)綠色自由基，在734 nm處有吸收峰。當(dāng)加入具有抗氧化能力的樣品時(shí)，溶液會(huì)褪色，吸光值降低。圖3為巖藻寡糖對(duì)ABTS+·的清除結(jié)果。由圖3可知：巖藻寡糖具有顯著的清除ABTS+·的能力，且清除率與濃度呈良好的劑量效應(yīng)關(guān)系。當(dāng)質(zhì)量濃度為10 mg/mL時(shí)，巖藻寡糖對(duì)ABTS+·的清除率高達(dá)98.83%，接近于維生素C對(duì)ABTS+·的清除率。

圖3 巖藻寡糖對(duì)ABTS+·的清除能力Fig.3 Scavenging ability of fucoidan oligosaccharides on ABTS+· radicals

2.2.2 巖藻寡糖的·OH清除能力

·OH是細(xì)胞中最活潑的自由基，它可引發(fā)組織細(xì)胞的病變，導(dǎo)致各種疾病發(fā)生和加速機(jī)體衰老。巖藻寡糖對(duì)于·OH清除能力如圖4所示。由圖4可知：隨著寡糖濃度的提高，·OH的清除率也隨之上升，呈現(xiàn)出一定的量效關(guān)系，IC50為6.02 mg/mL。當(dāng)巖藻寡糖質(zhì)量濃度為10 mg/mL時(shí)，巖藻寡糖對(duì)·OH的清除率高達(dá)70.49%,而巖藻多糖對(duì)于·OH的清除率與濃度的關(guān)系未呈現(xiàn)出明顯的量效關(guān)系。張加幸等[16]研究發(fā)現(xiàn)，在巖藻多糖質(zhì)量濃度達(dá)到1.0 mg/mL時(shí)，清除能力不再隨濃度增加出現(xiàn)明顯變化，達(dá)到44.69%。因此可知，巖藻寡糖對(duì)于·OH的清除能力要優(yōu)于巖藻多糖。

圖4 巖藻寡糖對(duì)·OH的清除能力Fig.4 Scavenging ability of fucoidan oligosaccharides on ·OH radicals

2.2.3 巖藻寡糖的DPPH·清除能力

DPPH·是一種穩(wěn)定的有機(jī)自由基，常用來測(cè)定樣品是否具有抗氧化活性?？疾鞄r藻寡糖的DPPH·清除能力，結(jié)果如圖5所示。由圖5可知，巖藻寡糖對(duì)DPPH·的清除率隨著時(shí)間延長(zhǎng)而增大。當(dāng)反應(yīng)時(shí)間為0.5 h、巖藻寡糖為0～10 mg/mL時(shí)，對(duì)DPPH·的清除率與寡糖濃度呈劑量關(guān)系，巖藻寡糖的IC50為6.46 mg/mL；當(dāng)巖藻寡糖的質(zhì)量濃度為10 mg/mL時(shí)，DPPH·的清除率達(dá)到81.94%。當(dāng)反應(yīng)時(shí)間為6 h、巖藻寡糖為0～10 mg/mL時(shí)，對(duì)DPPH·的清除率與寡糖濃度也呈劑量關(guān)系，IC50為3.02 mg/mL；當(dāng)反應(yīng)時(shí)間進(jìn)一步延長(zhǎng)到12 h、巖藻寡糖的質(zhì)量濃度為10 mg/mL時(shí)，IC50為2.01 mg/mL，DPPH·的清除率達(dá)到94.91%。張加幸等[16]研究發(fā)現(xiàn)，巖藻多糖在2 mg/mL的質(zhì)量濃度下，對(duì)DPPH·的清除率僅達(dá)到63.97%。因此，巖藻寡糖對(duì)DPPH·的清除能力遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于巖藻多糖對(duì)DPPH·的清除能力，其原因可能是多糖在被酶法降解的過程中產(chǎn)生的寡糖含有很多不飽和鍵。

圖5 巖藻寡糖對(duì)DPPH·自由基的清除能力Fig.5 Scavenging ability of fucoidan oligosaccharides on DPPH· radicals

2.3 巖藻寡糖的益生活性

2.3.1 巖藻寡糖對(duì)于植物乳桿菌的益生活性

筆者以植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum)為研究對(duì)象，通過繪制菌株生長(zhǎng)曲線的方法來測(cè)定巖藻寡糖的益生活性，結(jié)果如圖6所示。由圖6可知：巖藻寡糖和葡萄糖在菌株生長(zhǎng)初期就顯示出很好的促進(jìn)菌株生長(zhǎng)的能力，在菌株培養(yǎng)8 h時(shí)，菌液密度(OD600)就達(dá)到了1.36，與相同濃度的葡萄糖效果相似；但是隨著培養(yǎng)時(shí)間的進(jìn)一步延長(zhǎng)，相同濃度的巖藻寡糖促進(jìn)植物乳桿菌生長(zhǎng)的效果要優(yōu)于葡糖糖。因此，巖藻寡糖具有較好的益生活性。

圖6 巖藻寡糖對(duì)植物乳桿菌生長(zhǎng)的影響Fig.6 Effects of fucoidan oligosaccharides on Lactobacillus plantarum

2.3.2 巖藻寡糖對(duì)于嗜酸乳桿菌的益生活性

筆者以嗜酸乳桿菌(Lactobacillusacidophilus)為研究對(duì)象，考察巖藻寡糖對(duì)于嗜酸乳桿菌的促生長(zhǎng)作用，結(jié)果如圖7所示。由圖7可知：巖藻寡糖和葡萄糖在菌株生長(zhǎng)初期就顯示出很好的促進(jìn)菌株生長(zhǎng)的能力；與葡萄糖為對(duì)照的結(jié)果相比，在菌株生長(zhǎng)初期，巖藻寡糖對(duì)于菌株的生長(zhǎng)并未表現(xiàn)出明顯的促進(jìn)作用，但是隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，巖藻寡糖開始表現(xiàn)出了促生長(zhǎng)作用，菌株生長(zhǎng)的速度明顯加快且高于對(duì)照的結(jié)果，最終菌液密度(OD600)達(dá)到了1.43。

圖7 巖藻寡糖對(duì)嗜酸乳桿菌生長(zhǎng)的影響Fig.7 Effects of fucoidan oligosaccharides on Lactobacillus acidophilus

目前尚無有關(guān)巖藻多糖的益生活性的報(bào)道，因此無法與之進(jìn)行比較，但有研究報(bào)道海洋寡糖如瓊膠寡糖、殼寡糖等均具有顯著的促進(jìn)有益菌的生長(zhǎng)和增殖作用，例如胡斌[17]發(fā)現(xiàn)1%添加量的新瓊寡糖可以促進(jìn)嗜酸乳桿菌(Lactobacillusacidophilus)的生長(zhǎng)，并且可以縮短菌株的適應(yīng)期。同樣地，巖藻寡糖可以縮短植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum)的適應(yīng)期，其具體機(jī)制有待于進(jìn)一步驗(yàn)證和分析。

3 結(jié)論

筆者以巖藻多糖為原料，利用酶法制備了不同聚合度的巖藻寡糖，并系統(tǒng)研究了其體外抗氧化活性和益生活性，研究結(jié)果表明巖藻寡糖具有較好的自由基清除能力，能夠顯著促進(jìn)兩種腸道有益菌的生長(zhǎng)，具有進(jìn)一步開發(fā)為新型益生元的應(yīng)用潛力。以上研究結(jié)論將有助于進(jìn)一步豐富對(duì)巖藻寡糖結(jié)構(gòu)和活性的認(rèn)識(shí)，并為海洋藻類多糖資源的深加工應(yīng)用奠定理論基礎(chǔ)。