趙子碩，李 紅，苗祚庥，張金榮*，崔 巍，駱其君，嚴小軍

1寧波大學(xué)海洋學(xué)院；2寧波大學(xué)醫(yī)學(xué)院，寧波315211

羊棲菜(Sargassumfusiforme)，別名鹿角菜、海菜芽，屬褐藻綱、馬尾藻科、馬尾藻屬，是暖溫帶褐藻，廣泛分布于我國沿海島礁。羊棲菜是我國重要經(jīng)濟褐藻，主產(chǎn)于浙江省溫州蒼南縣和洞頭縣[1]。羊棲菜富含褐藻多糖、巖藻黃素、褐藻多酚、甘露醇、微量元素等多種活性物質(zhì)。藥理研究表明，羊棲菜具有降血脂、降血糖、抗血栓、增進免疫力、延緩衰老等多種藥理活性[2]。目前，羊棲菜主要以淡干品出口日本，作為保健食品長期和廣泛食用[2]。

巖藻黃素是一種海洋來源的類胡蘿卜素，廣泛存在于褐藻、硅藻、金藻和定鞭藻等海洋藻類中[3]。褐藻中，巖藻黃素和葉綠素共同組成高效捕光復(fù)合物，有利于海藻適應(yīng)水環(huán)境中弱光條件的光合作用[3]。巖藻黃素具有保護肝臟、抗腫瘤[4]、抗氧化[5]、抗瘧[6]、抗炎[7]、降血脂、減肥[8]、預(yù)防糖尿病[9]、抗老年癡呆[10]和保護視力[11]等多種藥理活性。巖藻黃素化學(xué)結(jié)構(gòu)中包含共軛多烯骨架、連二烯基、酯基等多種官能團，導(dǎo)致巖藻黃素化學(xué)性質(zhì)不穩(wěn)定，極易被氧化[5]。據(jù)報道，遇熱、接受光照、遇酸或堿均可使巖藻黃素發(fā)生各種降解反應(yīng)，造成巖藻黃素穩(wěn)定性受到很大程度的影響，致使巖藻黃素很難儲存。

羊棲菜是我國重要的經(jīng)濟褐藻，也是巖藻黃素的重要來源[12]。本研究以新鮮羊棲菜為原料，分別采用三種不同干燥方式(自然陰干、低溫烘干和冷凍干燥)對其進行干燥，采用高效液相色譜分析所得干藻中巖藻黃素的含量，考察不同干燥方式對巖藻黃素穩(wěn)定性的影響，確定最優(yōu)的干燥方式。將凍干所得羊棲菜研磨成粉，等量裝入鋁箔袋，真空處理，分別在四個不同溫度條件下(-20、4、25、30 ℃)存儲，定期測定其中所含巖藻黃素含量，考察不同存儲溫度對巖藻黃素穩(wěn)定性的影響，確定最優(yōu)的存儲溫度。本研究考察不同干燥方式、不同存儲溫度對羊棲菜中巖藻黃素穩(wěn)定性的影響，明確最優(yōu)干燥方式和存儲溫度，將為羊棲菜作為保健食品原料，進一步的研究和應(yīng)用，提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

2016年3月20日于溫州鰲江沿海采集新鮮羊棲菜，采集后將整株羊棲菜立刻置于-20 ℃冰箱內(nèi)低溫避光保存，由寧波大學(xué)駱其君教授鑒定為馬尾藻屬羊棲菜Sargassumfusiforme；巖藻黃素對照品(純度≥95%，Sigma-Aldrich公司)；乙腈(色譜純，上海安譜實驗科技股份有限公司)；其它試劑均為分析純。

1.2 主要儀器

儀器：恒溫鼓風干燥箱CT-C-1(南京騰飛干燥設(shè)備有限公司)；冷凍干燥機SCIENTZ-100F型(寧波新芝生物科技股份有限公司)；高效液相色譜儀Waters 2695 Alliance 高效液相色譜系統(tǒng)(沃特世科技(上海)有限公司，美國；含四元溶劑系統(tǒng)、在線脫氣機和自動進樣器)，PDA檢測器系統(tǒng)Waters 2998(沃特世科技(上海)有限公司，美國)；C18色譜柱(XBridgeTM，4.6×150 mm，3.5 μm，沃特世科技(上海)有限公司，美國)；電熱鼓風干燥箱DHG-9070A(上海一恒科技有限公司)。

1.3 羊棲菜干燥曲線的繪制

取適量新鮮羊棲菜，純水洗凈，去除雜質(zhì)與表面水分，備用。

分別采用自然陰干法和低溫烘干法2種方法對同一批次的羊棲菜進行干燥，每隔一段時間取樣測定羊棲菜的含水率，其含水率按照藥典方法測定[13]，以干燥時間為橫坐標，含水率為縱坐標繪制曲線。

冷凍干燥法為封閉、連續(xù)的單元操作，為保證儀器正常使用，采用實驗經(jīng)驗設(shè)定為：將羊棲菜放置于-20 ℃條件下冷凍24 h，取出平鋪于冷凍干燥機內(nèi)(溫度-50 ℃；真空度：100 Pa)干燥48 h。

1.4 羊棲菜干燥方法

取適量新鮮羊棲菜，純水洗凈后，去除雜質(zhì)與表面水分，備用。根據(jù)干燥曲線結(jié)果，采用不同干燥方法的操作步驟如下。

1.4.1 自然陰干法

取100.00 g純水洗凈的羊棲菜，平鋪于紙上，置于室溫避光處自然陰干72 h。

1.4.2 低溫烘干法

取100.00 g純水洗凈的羊棲菜，平鋪于恒溫鼓風干燥箱內(nèi)，35 ℃鼓風干燥24 h。

1.4.3 冷凍干燥法

取100.00 g純水洗凈的羊棲菜，-20 ℃下冷凍24 h，取出平鋪于冷凍干燥機內(nèi)(溫度-50 ℃；真空度：100 Pa)干燥48 h，實驗條件由前期預(yù)實驗所得。

1.5 水分的測定

按2015年版《中國藥典》第一部[13]附錄IXH 水分測定法之“烘干法”(第二法)測定。分別取三種不同方法干燥的羊棲菜干品約2 g，精密稱定后依法操作。

1.6 巖藻黃素的含量測定

1.6.1 對照品溶液的制備

稱取巖藻黃素對照品適量，精密稱定，置于容量瓶中，加入甲醇溶解定容，并稀釋配制巖藻黃素濃度分別為27.0、13.5、6.75、3.375、1.687 5、0.843 8、0.421 9、0.210 9、0.105 5 μg/mL的對照品溶液。

1.6.2 供試品溶液的制備

參考Airanthi等[14]的有機溶劑提取法。分別稱取不同方法干燥的羊棲菜干品約1.0 g，精密稱定，置25 mL具塞錐形瓶中，加入甲醇10 mL，室溫條件避光提取24 h；濾過，濾渣再同樣提取兩次。合并三次濾液，濾液轉(zhuǎn)移至50 mL量瓶中，加甲醇定容，搖勻。

1.6.3 HPLC測定方法

參照任丹丹等[15]的高效液相色譜(HPLC)測定方法并稍作修改。色譜條件：色譜柱：XBridgeTM，C18色譜柱，粒徑3.5 μm，4.6 mm×150 mm；流動相：乙腈-水(73∶27)；柱溫：25 ℃；流速0.8 mL/min；檢測波長450 nm；進樣量15 μL。

1.6.4 線性關(guān)系考察

分別精密量取不同濃度的巖藻黃素對照品溶液，按照1.6.3項下方法進行測定。以溶液濃度(X)對色譜峰面積(Y)進行線性回歸。

1.7 不同干燥方法對羊棲菜中巖藻黃素含量的影響

分別采用自然陰干法和低溫烘干法2種方法對同一批次的羊棲菜進行干燥，與1.3項同時取樣，測定羊棲菜的巖藻黃素含量，其含量測定按照1.6項下方法測定，以干燥時間為橫坐標，巖藻黃素含量為縱坐標繪制曲線。

冷凍干燥法為封閉、連續(xù)的單元操作，為保證儀器正常使用，在干燥過程中未進行巖藻黃素含量的測定。

其中C為巖藻黃素的含量(μg/g)；WFx為羊棲菜中巖藻黃素的質(zhì)量(μg)，WDW為羊棲菜干藻的質(zhì)量(g)，即為羊棲菜去除所含水分后，固形物重量。

其中L為羊棲菜中巖藻黃素的保留率；Wx為干燥羊棲菜中巖藻黃素的實測含量(μg/g)，Wm為新鮮羊棲菜折算成干藻中巖藻黃素的理論含量(μg/g)。

1.8 不同儲存溫度對羊棲菜中巖藻黃素含量的影響

1.8.1 羊棲菜樣品在不同溫度下儲存

羊棲菜凍干樣品，加入液氮，進行研磨得到細粉，混勻。分別稱取細粉約10.0 g，置于雙鋁密封袋內(nèi)，真空包裝，制得28袋樣品。分別取7袋樣品置于-20、4、25 、30 ℃條件下儲存。

1.8.2 羊棲菜樣品中巖藻黃素含量的測定

定期取樣，取樣時間分別為存儲第4、8、12、16、20、24、28周。每包樣品取樣三次作為平行樣，按照1.6.2項下進行供試品溶液的制備，按照1.6.3項下進行羊棲菜中巖藻黃素的含量測定。

其中K為羊棲菜中巖藻黃素的降解率；W0為第0周冷凍羊棲菜中巖藻黃素的含量(μg/g)，W為實測羊棲菜中巖藻黃素的含量(μg/g)。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同干燥方法對羊棲菜干燥曲線的影響

由圖1可知，將羊棲菜置于35 ℃鼓風干燥，干燥速率大，干燥時間較短。當干燥時間達到20 h，羊棲菜的含水量低于10%。而將羊棲菜置于室溫陰涼處，其中含水量降低較慢，當干燥時間達到69 h，羊棲菜含水量接近11%。因此，低溫烘干干燥速率明顯高于自然陰干。羊棲菜分別低溫烘干20 h和自然陰干69 h后，隨著干燥時間的延長，含水量無明顯變化。

圖1 不同干燥方法的干燥特征曲線(A：低溫烘干法；B：自然陰干法)Fig.1 Drying characteristic curves of different drying methods (A:low-temperature drying method;B:air-dried in the shade at room temperature)

2.2 不同干燥方法對羊棲菜水分含量的影響

不同方法干燥后羊棲菜的含水量如表1所示。3種干燥方法干燥后羊棲菜中水分含量差異較大。其中，自然陰干羊棲菜水分含量最高，低溫烘干次之，冷凍干燥羊棲菜水分含量最低,因此，冷凍干燥更利于長期保存羊棲菜。根據(jù)文獻報道，冷凍干燥在低溫、真空條件下進行，通過升華去除水分，賦予產(chǎn)品許多特殊的性能。冷凍干燥具有以下主要優(yōu)點：脫水徹底，有利于產(chǎn)品長期保存；物料物理結(jié)構(gòu)和分子結(jié)構(gòu)變化較小，很大限度地保存物料的色、香、味；低溫干燥，特別適合于熱敏物質(zhì)[16]。

2.3 羊棲菜中巖藻黃素的含量測定

2.3.1 巖藻黃素標準曲線的繪制

分別精密量取不同濃度的巖藻黃素對照品溶液，按照1.6.3項下進行測定，以溶液濃度(X)對色譜峰面積(Y)進行線性回歸，建立巖藻黃素標準曲線見圖2。結(jié)果表明，色譜峰面積與巖藻黃素質(zhì)量濃度在0.105 5～27.0 μg/mL范圍內(nèi)呈線性關(guān)系，其線性回歸方程為：Y=221 239X-34 488(Y表示峰面積，X表示巖藻黃素濃度)，R2=0.999 6，可用于羊棲菜中巖藻黃素的含量測定。

表1 不同干燥方法對羊棲菜中水分含量的影響

圖2 巖藻黃素標準曲線Fig.2 Standard curve of fucoxanthin

羊棲菜中巖藻黃素的含量(μg/g)為：

其中W為含量(μg/g)，S為色譜峰面積，m為樣品質(zhì)量(g)

2.3.2 羊棲菜中巖藻黃素的鑒定

按照1.6.3項下測定巖藻黃素對照品所得HPLC色譜圖(圖3)中，巖藻黃素出峰時間在16.152 min，UV全波長掃描發(fā)現(xiàn)其在449.8 nm處有最大吸收。

圖3 HPLC色譜圖(A：巖藻黃素對照品；B：冷凍干燥羊棲菜)Fig.3 HPLC chromatograms (A:fucoxanthin standard;B:S.fusiforme treated with vacuum freeze drying method)

圖4 UV光譜圖(A：巖藻黃素對照品；B：冷凍干燥羊棲菜)Fig.4 Ultraviolet-visible absorption spectra (A:fucoxanthin standard;B:S.fusiforme treated with vacuum freeze drying method)

由圖3和圖4可知，按照1.6.3項下測定冷凍干燥羊棲菜所得HPLC色譜圖中，出峰時間在16.102 min，其在449.8 nm處有紫外最大吸收，與巖藻黃素對照品基本一致，因此，鑒定其為巖藻黃素。因此，HPLC技術(shù)可用于巖藻黃素的含量測定。

2.4 不同干燥方法對羊棲菜中巖藻黃素含量的影響

采用低溫烘干法和自然陰干法對羊棲菜進行干燥，不同干燥方法對羊棲菜中巖藻黃素含量的影響見圖5。由結(jié)果可知，隨著干燥過程推進，羊棲菜中巖藻黃素的含量逐步降低。采用低溫烘干羊棲菜，干燥6 h，其所含巖藻黃素含量由738.6 μg/gDW降低至268.7 μg/gDW。采用自然陰干羊棲菜，干燥6 h，其所含巖藻黃素含量由738.6 μg/gDW降低至635.2 μg/gDW。說明巖藻黃素為熱敏物質(zhì)，隨著干燥溫度的升高，加劇其降解。另外，低溫烘干和自然陰干過程中，隨著干燥時間的延長，巖藻黃素的降解均愈加明顯。說明巖藻黃素為易氧化物質(zhì)，長時間暴露于空氣(氧氣)中，不利于其保留。結(jié)合圖1，羊棲菜分別低溫烘干20 h和自然陰干69 h后，隨著干燥時間的延長，其中的含水量無明顯變化，但其中巖藻黃素含量仍繼續(xù)下降。表明傳統(tǒng)的干燥方式(如自然陰干和低溫烘干)均不利于羊棲菜中巖藻黃素的保存。

圖5 不同干燥方法對羊棲菜中巖藻黃素含量的影響(A：低溫烘干法；B：自然陰干法)Fig.5 Effect of different drying methods on the content of fucoxanthin in S.fusiforme (A:low-temperature drying method;B:air-dried in the shade at room temperature)

三種不同干燥方法對羊棲菜中巖藻黃素含量的影響，結(jié)果見表2。冷凍干燥羊棲菜中巖藻黃素含量最高(699.2 ± 25.1 μg/g)，遠遠高于自然陰干羊棲菜(67.1 ± 4.6 μg/g)和低溫烘干羊棲菜中巖藻黃素含量(32.6 ± 2.3 μg/g)。

由圖5和表2可知，冷凍干燥羊棲菜中巖藻黃素的保留率高達94.7%，遠遠高于自然陰干羊棲菜(9.0%)和低溫烘干羊棲菜中巖藻黃素的保留率(4.4%)。

表2 不同干燥方法對羊棲菜中巖藻黃素含量的影響

注:DW表示為干重。

Note:DW was dry weight.

根據(jù)文獻報道，冷凍干燥在低溫、真空條件下進行干燥，通過升華去除水分，因此可有效抑制熱敏性物質(zhì)發(fā)生生物、物理和化學(xué)變化，有利于物料中的活性物質(zhì)保存[16]。巖藻黃素化學(xué)結(jié)構(gòu)中包含共軛多烯骨架、連二烯基、酯基等多種官能團，導(dǎo)致巖藻黃素化學(xué)性質(zhì)不穩(wěn)定，極易被氧化[5]。據(jù)報道，遇熱、接受光照、遇酸或堿均可使巖藻黃素發(fā)生各種降解反應(yīng)，造成巖藻黃素穩(wěn)定性受到很大程度的影響。本研究結(jié)果進一步驗證冷凍干燥可將羊棲菜中巖藻黃素得到有效保留，冷凍干燥為最佳干燥方法。

2.5 不同存儲溫度和存儲時間對羊棲菜中巖藻黃素含量的影響

不同存儲溫度和不同存儲時間對冷凍干燥羊棲菜中巖藻黃素含量的影響如圖6所示。由圖6(A)可知，存儲溫度是影響羊棲菜中巖藻黃素含量的重要因素。不同存儲溫度對羊棲菜中巖藻黃素含量的影響有顯著差異(P<0.05)，隨著存儲溫度的升高，巖藻黃素的降解率明顯增高。存儲第4周，低溫(-20 ℃)存儲羊棲菜中巖藻黃素的降解率最低，為17.98%，其次為4 ℃存儲羊棲菜，25 ℃存儲羊棲菜次之，30 ℃存儲羊棲菜降解率最大，為71.59%。在第8、12、16、20、24、28周，也發(fā)現(xiàn)同樣規(guī)律，羊棲菜中巖藻黃素的降解率隨著存儲溫度的升高而加劇。

本研究發(fā)現(xiàn)，-20 ℃與4 ℃存儲樣品，巖藻黃素的降解率也有著明顯的差距。第4周的檢測中，巖藻黃素的降解率已經(jīng)相差30.60%；第8周的檢測中差距進一步增大為34.66%；在第28周的檢測中差距為34.87%，達到了降解率的最大差值。然而25 ℃與30 ℃存儲樣品，巖藻黃素的降解率均很高，差距不明顯。第4周的檢測，羊棲菜中巖藻黃素的降解率差距僅為0.22%；第8周的檢測中差距達到了最大值，為5.64%。在第28周的檢測中差距為1.76%。說明25 ℃與30 ℃存儲羊棲菜，存儲第四周，其中所含巖藻黃素大部分已經(jīng)發(fā)生降解。綜上所述，建議采用-20 ℃存儲羊棲菜。

圖6 不同存儲溫度和存儲時間對羊棲菜中巖藻黃素含量的影響 (n =3,A:不同存儲溫度,B:不同存儲時間)Fig.6 Effect of different storage temperatures and stored time on the degradation rate of fucoxanthin in S.fusiforme (n =3,A:different storage temperatures,B:different stored time)

由圖6(B)可知，存儲時間也是影響羊棲菜中巖藻黃素含量的重要因素。延長存儲時間對羊棲菜中巖藻黃素含量的影響有顯著差異(P<0.05)，隨著存儲時間的延長，巖藻黃素的降解率也出現(xiàn)逐步增大。低溫(-20 ℃)存儲羊棲菜，存儲第4周，其中巖藻黃素降解率最低，為17.98%，接下來依次為第8、12、16、20、24周,第28周時，羊棲菜中巖藻黃素降解率最大，為41.36%。在4、25、30 ℃，也發(fā)現(xiàn)同樣規(guī)律，羊棲菜中巖藻黃素的降解率隨著存儲時間的延長而加快降解。

3 結(jié)論

本文首次考察不同干燥方法，不同存儲溫度和存儲時間對羊棲菜中巖藻黃素含量的影響。巖藻黃素化學(xué)結(jié)構(gòu)中包含共軛多烯骨架、連二烯基、酯基等多種官能團，導(dǎo)致巖藻黃素化學(xué)性質(zhì)不穩(wěn)定，遇熱、接受光照、遇酸或堿均可使巖藻黃素發(fā)生各種降解反應(yīng)，致使巖藻黃素很難儲存[15]。2014年，Zhao等[17]提出巖藻黃素遇熱、空氣或光均易發(fā)生降解，生成一系列降解產(chǎn)物。研究發(fā)現(xiàn)，巖藻黃素的降解反應(yīng)屬于溫度依賴型。隨著存儲溫度的提高，促進了巖藻黃素主要通過氧化反應(yīng)和異構(gòu)化作用，產(chǎn)生了13-順式和13′-順式結(jié)構(gòu)，產(chǎn)生降解反應(yīng)。光照會引起巖藻黃素發(fā)生異構(gòu)化，誘導(dǎo)巖藻黃素由13-順式和13′-順式轉(zhuǎn)變?yōu)槿词?，進一步再變?yōu)?′-順式結(jié)構(gòu)，從而發(fā)生降解。巖藻黃素遇到空氣中的氧氣，主要發(fā)生氧化降解。本研究結(jié)果驗證了此假說，三種不同方式干燥的羊棲菜所含巖藻黃素含量有顯著差異。冷凍干燥法最適合羊棲菜的干燥，所得羊棲菜含水量低，巖藻黃素含量高。

據(jù)Ahmed等[18]研究報道，氧氣也是造成雨生紅球藻中蝦青素發(fā)生降解的重要因素。因此，本研究以凍干羊棲菜為研究對象，采用獨立、真空、避光包裝(真空雙鋁包裝)，考察了不同存儲溫度對羊棲菜中巖藻黃素含量的影響。所設(shè)計的四個不同的溫度(-20、4、25、30 ℃)均為生活中所常見的、容易達到的。-20 ℃和4 ℃為普通冷庫和冷藏的常見溫度，設(shè)備常見，便于實施；25 ℃和30 ℃為內(nèi)陸和沿海地區(qū)常見溫度。為避免光照對巖藻黃素造成影響，采用鋁箔袋包裝；為排除氧氣對巖藻黃素產(chǎn)生降解，采用真空包裝。本研究結(jié)果表明存儲溫度是影響羊棲菜中巖藻黃素穩(wěn)定性的重要因素。隨著存儲溫度的升高，巖藻黃素的降解率明顯增高，此結(jié)論也與Huang等[19]研究結(jié)論相一致。存儲羊棲菜的最佳溫度為-20 ℃。

本研究考察了富含巖藻黃素的羊棲菜的最佳干燥方法和儲存條件，為提高羊棲菜的資源化利用，合理的干燥和儲存提供了科學(xué)依據(jù)。