趙 磊，張曉寧，馮聚玲，肖忠盛，劉 泳，龍 泓，陳向恒，唐衛(wèi)平

南華大學(xué)附屬第一醫(yī)院1胃腸外科，3肝膽外科，湖南 衡陽(yáng)421001；2南華大學(xué)衡陽(yáng)醫(yī)學(xué)院轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)研究室，湖南 衡陽(yáng)421001

膽固醇是細(xì)胞膜保持穩(wěn)態(tài)必不可少的組成。細(xì)胞膜膽固醇蓄積和缺乏均可引起細(xì)胞功能障礙。膽固醇毒性是胰島脂毒性的重要組成［1］。膽固醇蓄積導(dǎo)致β細(xì)胞功能障礙，是2型糖尿病發(fā)生的重要原因［2］。研究發(fā)現(xiàn)抑制小鼠膽固醇酯化導(dǎo)致細(xì)胞膽固醇酯減少，抑制胰腺癌的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移［3］。膽固醇平衡最重要的調(diào)節(jié)途徑是膽固醇逆向轉(zhuǎn)運(yùn)（RCT）［4］。RCT的本質(zhì)是由機(jī)體細(xì)胞過(guò)量的膽固醇通過(guò)血液輸送到肝臟和小腸。控制RCT 最重要的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白是ATP 結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)體A1（ABCA1）［5］。研究證實(shí)ABCA1在β細(xì)胞膽固醇穩(wěn)態(tài)的重要作用。糖毒性、脂毒性是肥胖合并2型糖尿病的主要特征［6］。糖尿病小鼠的巨噬細(xì)胞ABCA1表達(dá)下調(diào)，高糖抑制細(xì)胞膽固醇流出［7］。高糖通過(guò)p38 MAPK信號(hào)級(jí)聯(lián)反應(yīng)抑制ABCA1啟動(dòng)子活性，下調(diào)平滑肌細(xì)胞ABCA1表達(dá)，加速動(dòng)脈粥樣硬化形成［8］。高糖及高脂通過(guò)減少ABCA1和ABCG1調(diào)控的膽固醇流出促進(jìn)動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)展［9］。

胰高血糖素樣肽-1（GLP-1）受體激動(dòng)劑是一類具有良好降糖效果的腸促胰島素類似物［10］。艾塞那肽是第一個(gè)應(yīng)用于臨床治療糖尿病的腸促胰島素激動(dòng)劑［11］。艾塞那肽通過(guò)激動(dòng)GLP-1受體以葡萄糖濃度依賴的方式增強(qiáng)胰島素分泌［12］。艾塞那肽可明顯改善胰島功能，但其胰腺安全性存在爭(zhēng)議?；诎请呐c胰腺炎癥及腫瘤之間相關(guān)性的研究結(jié)果存在不一致，甚至相互矛盾［13-16］。有研究顯示GLP-1可改善膽固醇毒性所致的胰腺細(xì)胞凋亡［17］。但艾塞那肽對(duì)糖脂毒性狀態(tài)下機(jī)體胰腺組織膽固醇流出有無(wú)影響目前沒(méi)有報(bào)道。本研究利用肥胖糖尿病大鼠模型研究艾塞那肽對(duì)大鼠胰腺組織ABCA1表達(dá)及膽固醇代謝的影響。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SD（Sprague-Dawley）大鼠48只（湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司）空腹血糖測(cè)定1周，其結(jié)果（均值）作為正常參考值，然后隨機(jī)選取24只為實(shí)驗(yàn)組大鼠，行高脂高糖喂養(yǎng)8周后，腹腔注射鏈脲佐菌素（STZ，35 mg/kg）1次。造模成功標(biāo)準(zhǔn)：在注射鏈脲佐菌素后第3天取大鼠尾靜脈血液，分別測(cè)隨機(jī)血糖3次，平均值大于16.7 mmol/L，大鼠出現(xiàn)體質(zhì)量下降，飲水及進(jìn)食增多。排除血糖不達(dá)標(biāo)及注射后死亡的動(dòng)物6只，18只糖尿病大鼠造模成功。

1.2 主要試劑與設(shè)備

ABCA1抗體購(gòu)自英國(guó)Abcam公司，艾塞那肽粉末購(gòu)自中國(guó)吉爾公司，麗春紅、蘇木素（Sigma），鏈脲菌素（MP Biomedicals），低溫離心機(jī)（Eppendorf），電泳儀（Bio-Rad），ECL Plus 超敏發(fā)光液（Thermo pierce），PVDF 膜（Millipore），ELISA 檢測(cè)試劑盒（R & D Systems）。

1.3 分組方案及處理

SD雄性大鼠48只，6周齡，體質(zhì)量180～250 g（其中隨機(jī)選取24只大鼠造模為肥胖糖尿病大鼠，排除血糖不達(dá)標(biāo)及死亡6只）共分為4組，A：正常大鼠注射生理鹽水組，B：正常大鼠注射艾塞那肽組，C：肥胖糖尿病大鼠注射生理鹽水組，D：肥胖糖尿病大鼠艾塞那肽組，A、B組各12只，C、D組各9只。給藥第10周末所有的大鼠用10%水合氯醛按每100 g體質(zhì)量0.3 mL腹腔注射麻醉。剪開胸腔，暴露心臟，經(jīng)左心室灌注0.9%PBS緩沖液約300 mL，直到大鼠肝臟顏色變淺，完整剪取胰腺組織分為2 份，1 份剪碎保存于-80 ℃冰箱保存用于Western blot，1份多聚甲醛固定用于油紅O染色。

1.4 指標(biāo)監(jiān)測(cè)

肥胖糖尿病大鼠造模成功后，B組和D組以艾塞那肽每次5 μg/kg分別于早8∶00晚18∶00各皮下注射1次，注射1 h后進(jìn)食，每周稱量大鼠質(zhì)量1次，根據(jù)體質(zhì)量調(diào)整注射劑量。每周取尾靜脈血，使用快速血糖儀檢測(cè)血糖。給藥后第10周處死大鼠，大鼠心臟采血后3000 r/min離心10 min后分離血清，檢測(cè)血清甘油三酯（TG）、血清總膽固醇（TC）、谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）、胰島素敏感指數(shù)（ISI）＝ln[1/（FBG×FINS）]，胰島素抵抗指數(shù)（IRI）＝（FBG×FINS）/22.5。

1.5 蛋白質(zhì)免疫印跡

使每個(gè)樣品總蛋白上50～100 μg 計(jì)算各個(gè)樣品所需取樣量。配10%分離膠，加入TEMED后立即搖勻即可灌膠。灌膠后，用異丙醇封膠。配5%的濃縮膠,加入TEMED后立即搖勻即可灌膠。將剩余空間灌滿濃縮膠然后將梳子插入濃縮膠中。根據(jù)蛋白定量的結(jié)果，第1孔點(diǎn)入maker，其它每空上樣10 μL已變性蛋白，開始電泳。切膠ABCA1（254 000），β-actin（42 000）。轉(zhuǎn)膜300 mA，ABCA1約150 min，β-actin 約1 h。轉(zhuǎn)膜完畢后，用麗春紅染膜，檢測(cè)蛋白轉(zhuǎn)膜的效率。

1.6 Real-time PCR

提取細(xì)胞總RNA，Trizol提取細(xì)胞總RNA，RNA的瓊脂糖凝膠電泳，電泳槽用3%的雙蒸水（滅菌DEPC處理水配制）處理0.5 h；配制1%變性瓊脂糖凝膠，0.2 g瓊脂糖，20 mL無(wú)菌DEPC處理水，加熱至瓊脂糖溶解，冷至60 ℃，加入0.5 μLEB（10 mg/mL），混勻后倒膠；取2 μL提取的RNA，按1∶5的比例與loading buffer premix混勻，170 V恒壓電泳，溴酚藍(lán)前沿遷移至凝膠總長(zhǎng)2/3處停止電泳；凝膠成像系統(tǒng)下觀察。以細(xì)胞總mRNA為模板，逆轉(zhuǎn)錄cDNA，在NCBI上搜索目的基因的序列，運(yùn)用primer5軟件設(shè)計(jì)引物，由上海生工合成引物。Rat-ABCA1-F：5'-GGTGGTGTTCTTCCTCGTTAC-3，Rat-ABCA1-R：5'-TCCTCGTCCTCGTCATTCAA-3。

1.7 油紅O染色

取出爬片，PBS洗3次。10%甲醛室溫、搖床固定10 min，棄甲醛。60%異丙醇潤(rùn)洗1次。加入油紅O工作液（儲(chǔ)備液和蒸餾水3∶2稀釋），室溫、搖床染色30 min。甘油封片、鏡下觀察。

1.8 組織膽固醇含量測(cè)定

將待測(cè)組織放入裂解液，混勻，靜置10 min，離心5 min，取上清用于酶學(xué)測(cè)定。將5 mmol/L膽固醇標(biāo)準(zhǔn)品用無(wú)水乙醇稀釋為2500、1250、625、312.5、156、78、39 μmol/L。通常稀釋4個(gè)點(diǎn)即可。注意設(shè)置零濃度空白對(duì)照管。取190 μL工作液加入微板，在各工作液中，分別加入10 μL（5～10 μL）空白對(duì)照溶液(無(wú)水乙醇或蒸餾水均可)、標(biāo)準(zhǔn)品、待測(cè)樣品。測(cè)定各管A550nm值，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線并計(jì)算濃度。

1.9 HE 染色

切片脫蠟，水化后切片放入蘇木精水溶液染色，用自來(lái)水沖洗切片，然后分別入75%和85%酒精各脫水2 min，入0.5%的伊紅染色液染色1 min；脫水透明，將切片平放，用鑷子夾取少量中性樹膠放置于切片上，顯微鏡下觀察拍照。

1.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用GraphPad Prism 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行分析，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，兩組之間比較采用雙向重復(fù)測(cè)量ANOVA 比較，組內(nèi)比較采用配對(duì)t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 艾塞那肽對(duì)肥胖糖尿病大鼠血糖、體質(zhì)量的影響

圖1 各組大鼠血糖、體質(zhì)量Fig.1 Changes of body weight and blood glucose in rats in each group. *P＜0.05 vs before exenatide or saline injection in each group.

4組大鼠注射艾塞那肽或生理鹽水后，定期檢測(cè)血糖，共10周，結(jié)果如圖1所示，正常SD大鼠注射生理鹽水組及正常SD大鼠注射艾塞那肽組，血糖穩(wěn)定。肥胖糖尿病大鼠注射生理鹽水組血糖逐步升高。而肥胖糖尿病大鼠注射艾塞那肽，血糖水平隨時(shí)間的推移逐漸下降。大鼠注射艾塞那肽或生理鹽水后，動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)體質(zhì)量，結(jié)果如圖1所示，正常SD大鼠注射生理鹽水組，體質(zhì)量逐漸上升，肥胖糖尿病大鼠注射生理鹽水組體質(zhì)量下降。而肥胖糖尿病大鼠注射艾塞那肽，體質(zhì)量下降程度較前者更為明顯。

2.2 各組大鼠胰腺組織ABCA1 mRNA、蛋白表達(dá)

為研究艾塞那肽對(duì)胰腺組織ABCA1表達(dá)的影響，我們檢測(cè)各組大鼠胰腺組織中ABCA1 的mRNA、蛋白，結(jié)果如圖2所示，與正常組相比，肥胖糖尿病大鼠的ABCA1表達(dá)明顯下降。肥胖糖尿病大鼠的胰島組織中，注射艾塞那肽比注射生理鹽水組可明顯提高ABCA1表達(dá)。

2.3 艾塞那肽對(duì)大鼠胰腺組織脂質(zhì)沉積的影響

結(jié)果如圖3所示，與SD大鼠組相比，肥胖糖尿病大鼠的胰腺組織脂質(zhì)沉積明顯增加。肥胖糖尿病大鼠注射艾塞那肽后，胰腺組織脂質(zhì)沉積明顯下降。

2.4 艾塞那肽對(duì)大鼠胰腺組織膽固醇含量的影響

結(jié)果如圖4所示，相比于正常組大鼠胰腺，肥胖糖尿病大鼠的胰腺組織膽固醇含量明顯增多。肥胖糖尿病大鼠注射艾塞那肽后胰腺組織膽固醇含量下降明顯。

2.5 艾塞那肽對(duì)大鼠胰島組織的影響

HE染色顯示，肥胖糖尿病大鼠的胰島體積縮小，著色較淺，空泡區(qū)較多，與周圍的交界不清，排列較為疏松。注射艾塞那肽組的糖尿病大鼠胰島較注射生理鹽水組胰島數(shù)目增多，體積增多，排列更為規(guī)則（圖5）。

圖2 各組大鼠胰腺組織ABCA1的mRNA、蛋白水平表達(dá)Fig.2 Expression of ABCA1 mRNA and protein in the pancreas of rats in each group.#P＜0.05 vs SD-saline group,*P＜0.05 vs DMsaline group.

圖3 艾塞那肽對(duì)大鼠胰腺組織脂質(zhì)沉積表達(dá)的影響Fig.3 Effect of GLP-1 on lipid deposition in rat pancreas.A:SD rats injected with saline.B:SD rats injected with exenatide.C:Obese diabetic rats injected with saline.D:Obese diabetic rats injected with exenatide.

圖4 各組大鼠胰腺組織膽固醇含量Fig.4 Cholesterol content in the pancreas of rats in each group.#P＜0.05 vs SD-saline group; *P＜0.05 vs DM-saline group. TC: Total cholesterol; FC: Free cholesterol; CE:Cholesterol esters.

2.6 艾塞那肽對(duì)肥胖糖尿病大鼠血脂、胰島功能的影響

結(jié)果如表1所示，肥胖糖尿病大鼠注射生理鹽水組TG、TC、胰島抵抗指數(shù)上升，胰島敏感指數(shù)下降。注射艾塞那肽后上述指標(biāo)明顯改善。

3 討論

本研究發(fā)現(xiàn)肥胖糖尿病大鼠胰腺組織中ABCA1表達(dá)水平顯著降低，胰腺組織膽固醇含量增加，脂質(zhì)沉積明顯，這表明糖脂毒性影響ABCA1介導(dǎo)的膽固醇流出，導(dǎo)致胰腺組織膽固醇蓄積。進(jìn)一步研究還發(fā)現(xiàn)該組大鼠胰島呈現(xiàn)體積縮小、結(jié)構(gòu)紊亂，檢測(cè)結(jié)果提示大鼠血清甘油三酯、總膽固醇水平升高、胰島分泌能力降低，這說(shuō)明大鼠胰島功能紊亂與β細(xì)胞膽固醇蓄積可能相關(guān)。

本研究中注射艾塞那肽后肥胖糖尿病大鼠胰腺組織ABCA1表達(dá)增加，胰島形態(tài)和結(jié)構(gòu)好轉(zhuǎn)，組織膽固醇含量下降，胰島分泌功能改善，這表明艾塞那肽可通過(guò)上調(diào)ABCA1表達(dá)改善糖脂毒性導(dǎo)致的包括胰島β細(xì)胞在內(nèi)的胰腺組織膽固醇蓄積，從而進(jìn)一步改善胰腺內(nèi)分泌功能。艾塞那肽降糖效果理想，同時(shí)低血糖不良反應(yīng)輕微，一度被稱為“智能降糖藥物”。艾塞那肽通過(guò)增加β細(xì)胞再生和增殖，抑制β細(xì)胞凋亡［18］。有研究報(bào)道GLP-1R激動(dòng)劑和DPP IV抑制劑可誘導(dǎo)胰島β細(xì)胞增殖，減少細(xì)胞凋亡。GLP-1連續(xù)注入大鼠胰島PDX-1表達(dá)上調(diào)，誘導(dǎo)β細(xì)胞增殖及新生。給糖尿病模型大鼠注射GLP-1R受體激動(dòng)劑可改善葡萄糖耐量和增加胰島β細(xì)胞增殖。而艾塞那肽是否通過(guò)促進(jìn)膽固醇流出改善β細(xì)胞膽固醇蓄積，從而增強(qiáng)其胰島素合成與釋放功能，目前研究較少。

肝X受體(LXR)是在調(diào)節(jié)膽固醇代謝中的起核心作用的核激素受體，并且是ABCA1的主要轉(zhuǎn)錄激活因子［19］。LXRβ-/-小鼠的胰島ABCA1水平降低，其GSIS受損以及胰島組織脂質(zhì)沉積增加。激活LXR使胰島β細(xì)胞ABCA1強(qiáng)表達(dá)和增加胰島素分泌［20］。在Gerin I等的研究中發(fā)現(xiàn)，LXRβ-/-小鼠胰島細(xì)胞脂滴可能是膽固醇酯積累的結(jié)果，LXRβ可調(diào)控膽固醇轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白ABCA1和ABCG1的表達(dá)［21］。AMP激活的蛋白激酶(AMPK)一直是治療2型糖尿病的一個(gè)潛在的靶點(diǎn)。學(xué)者發(fā)現(xiàn)水楊酸鹽可通過(guò)激活A(yù)MPKβ上調(diào)巨噬細(xì)胞的ABCA1和ABCG1表達(dá)，促進(jìn)膽固醇流出［22］。在β細(xì)胞中，GLP-1與GLP-1R結(jié)合后，促使ATP的轉(zhuǎn)化為胞質(zhì)cAMP，進(jìn)一步激活胞質(zhì)內(nèi)PKA/AMPK信號(hào)通路，促進(jìn)GSIS［23］。GLP-1通過(guò)cAMP/AMPK信號(hào)通路直接作用LXR抑制肝細(xì)胞脂質(zhì)生成［24］。上述證據(jù)提示GLP-1有可能通過(guò)激活A(yù)MPK信號(hào)通路，作用于胞核LXRβ，促進(jìn)胞膜ABCA1活化，促進(jìn)胰島β細(xì)胞膽固醇流出。

圖5 大鼠胰腺HE染色Fig.5 HE staining of the pancreas of rats. The volume of islet was significantly reduced, and the vacuole area was expanded in the pancreatic tissue of obese diabetic rats.A:SD rats injected with saline;B:SD rats injected with exenatide;C:Obese diabetic rats injected with saline;D:Obese diabetic rats injected with exenatide.

表1 各組大鼠血脂及胰島水平的變化Fig.1 Changes of blood lipids and insulin levels in rats in each group

但艾塞那肽對(duì)胰腺組織的影響具有爭(zhēng)議性，圍繞艾塞那肽是否會(huì)引起急性胰腺炎甚至胰腺腫瘤的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)未形成共識(shí)，一定程度影響艾塞那肽的臨床使用［25-26］。有研究表明長(zhǎng)期應(yīng)用艾塞那肽可使大鼠胰腺出現(xiàn)急慢性損傷，表現(xiàn)為腺泡細(xì)胞核固縮、胞漿空泡增多等，且腺泡炎癥評(píng)分顯著增加［27-28］。艾塞那肽可加速非典型性增生的胰腺上皮內(nèi)成瘤（PanIN）病變的形成和生長(zhǎng)，增加胰腺癌的發(fā)病幾率［29］。但有研究顯示，長(zhǎng)期應(yīng)用艾塞那肽對(duì)胰腺炎相關(guān)的生化標(biāo)志物水平、胰腺組織學(xué)、導(dǎo)管細(xì)胞增殖或凋亡等均沒(méi)有顯著影響。此外研究發(fā)現(xiàn)某些人類胰腺癌細(xì)胞系檢測(cè)有GLP-1 受體表達(dá)，但艾塞那肽并不影響胰腺癌細(xì)胞的增殖和凋亡，也不會(huì)促進(jìn)裸鼠體內(nèi)人類胰腺癌移植物的生長(zhǎng)［30］。

盡管本次實(shí)驗(yàn)表明糖脂毒性導(dǎo)致大鼠胰腺組織ABCA1表達(dá)降低，其所介導(dǎo)的膽固醇流出受阻，胰腺組織膽固醇蓄積，而艾塞那肽可促進(jìn)胰腺組織ABCA1表達(dá)，拮抗上述進(jìn)程。但在艾塞那肽作用下胰腺組織具體功能的變化還需相關(guān)研究論證，內(nèi)在機(jī)制研究需進(jìn)一步探索，此外還需體外實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步研究艾塞那肽對(duì)腺泡細(xì)胞、導(dǎo)管細(xì)胞等胰腺細(xì)胞如的影響。