羅倩倩，談 勇，胡榮魁，夏 云，夏桂成

南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，江蘇 南京210029

女性無(wú)避孕性生活至少12月而未孕，稱為不孕癥，在我國(guó)發(fā)病率達(dá)7%～10%，其中排卵障礙占25%～35%［1］。臨床上常通過(guò)促排卵方法促進(jìn)卵泡成熟，常用藥物有枸櫞酸克羅米芬（CC）、來(lái)曲唑（LE）、促性腺激素（Gn）等，然而運(yùn)用不當(dāng)可能會(huì)引起卵巢過(guò)度刺激綜合征（OHSS），多胎妊娠等。另外，即使運(yùn)用促排卵藥物，但仍有卵泡發(fā)育遲緩，或卵泡不發(fā)育等情況發(fā)生。對(duì)高齡女性促排卵藥物的過(guò)度使用，可能增加乳腺癌和子宮內(nèi)膜癌的潛在風(fēng)險(xiǎn)［2］。因此尋求有效、安全的促排卵方案顯得尤為重要。滋陰方是導(dǎo)師談?dòng)陆淌诮?jīng)驗(yàn)方（專利號(hào)：ZL200410041406.0），是基于國(guó)醫(yī)大師夏桂成教授“調(diào)周”理論而擬方，具體用藥：當(dāng)歸、白芍、干地黃、山茱萸、菟絲子，經(jīng)過(guò)多年臨床實(shí)踐，療效確切。長(zhǎng)期的臨床觀察證實(shí)其促進(jìn)卵泡發(fā)育療效較好［3-4］。相關(guān)實(shí)驗(yàn)研究滋陰方含藥血清可明顯增加顆粒細(xì)胞E2的分泌量,降低P的分泌量，認(rèn)為滋陰方可通過(guò)調(diào)節(jié)顆粒細(xì)胞的分泌功能進(jìn)而改善類PCOS的卵巢功能［5］。然其治療機(jī)制尚未完全闡明，仍有待繼續(xù)明確。

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法在中藥復(fù)方研究領(lǐng)域中的應(yīng)用較多,為其現(xiàn)代化研究提供了新的思路與方法［6］。本研究擬通過(guò)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的分析，探討其組方治療該病可能機(jī)制，以期為后續(xù)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)提供方向，為臨床提供理論依據(jù)。于此同時(shí)，設(shè)計(jì)臨床對(duì)照試驗(yàn)，通過(guò)觀察滋陰方對(duì)卵泡發(fā)育和周期結(jié)局的影響，進(jìn)一步驗(yàn)證其臨床有效性。

1 資料和方法

1.1 滋陰方活性成分的收集及篩選

利用TCMSP 數(shù)據(jù)庫(kù)（http://lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php）收集滋陰方（當(dāng)歸、白芍、干地黃、山茱萸、菟絲子）的主要活性成分。篩選條件為：藥物相似性（DL）＞0.18，口服生物利用度（OB）≥30%作為篩選閾值。

利用PubChem（https://pubchem.nehi.nlm.nih.gov）對(duì)其分子結(jié)構(gòu)進(jìn)行確證，獲得其Canonical SMILES字符串（SMILES）。

1.2 滋陰方作用靶點(diǎn)的收集

我們利用化學(xué)相似性，通過(guò)Swiss Target Prediction（http://www.swisstargetprediction.ch/），將查詢到的Canonical SMILES 字符串輸入進(jìn)行靶點(diǎn)對(duì)接，獲得上述中藥的潛在靶點(diǎn)基因，即為活性成分作用靶點(diǎn)。用Excel整理藥物活性成分-作用靶點(diǎn)。

1.3 疾病靶點(diǎn)預(yù)測(cè)

我們運(yùn)用GeneCards 數(shù)據(jù)庫(kù)（http://www.genecards.org/），以“ovulation failure infertility”為關(guān)鍵詞進(jìn)行搜索，收集與排卵障礙性不孕癥相關(guān)的基因靶點(diǎn)信息，并導(dǎo)入U(xiǎn)niProt數(shù)據(jù)庫(kù)（https://www.uniprot.or-g/），經(jīng)名稱-ID配對(duì)獲得這些基因靶點(diǎn)的相應(yīng)UniProt ID。將主要活性成分靶點(diǎn)和疾病靶點(diǎn)取交集，獲得滋陰方治療排卵障礙性不孕癥的靶點(diǎn)。用excel整理藥物活性成分-疾病靶點(diǎn)，導(dǎo)入Cytoscape3.6.0軟件，進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)風(fēng)格化顯示。

1.4 構(gòu)建靶基因PPI網(wǎng)絡(luò)

我們使用STRING 數(shù)據(jù)庫(kù)（http://www.string-db.org/）進(jìn)行蛋白-蛋白相互作用（PPI）分析，導(dǎo)入篩選出共同靶點(diǎn)，將蛋白種類設(shè)置為“homo sapiens”，最低相互作用閾值設(shè)為“highest confidence”（0.9），構(gòu)建PPI 網(wǎng)絡(luò)圖。導(dǎo)入Cytoscape軟件，進(jìn)行NetworkAnalyzer分析，然后根據(jù)Degree值篩選關(guān)鍵靶點(diǎn)。

1.5 GO、KEGG分析

我們通過(guò)DAVID（https://david.ncifcrf.gov/）網(wǎng)站，借助“Functional Annotation Tool”對(duì)共同靶基因進(jìn)行GO富集分析，以P＜0.05和FDR＜0.05 為標(biāo)準(zhǔn)篩選。并對(duì)潛在靶點(diǎn)進(jìn)行KEGG 分析，同樣以P＜0.05和FDR＜0.05 為篩選標(biāo)準(zhǔn)，通過(guò)R軟件繪制氣泡圖展示結(jié)果。

1.6 構(gòu)建中藥-有效成分-靶點(diǎn)-KEGG通路網(wǎng)絡(luò)

我們利用cytoscape3.6.0軟件分別構(gòu)建中藥-有效成分、有效成分-靶點(diǎn)、靶點(diǎn)-信號(hào)通路網(wǎng)絡(luò)，利用“Merge”功能進(jìn)行合并，構(gòu)建中藥-有效成分-靶點(diǎn)-KEGG通路網(wǎng)絡(luò)。

1.7 臨床驗(yàn)證

1.7.1 臨床資料 選取2019年1～12月于江蘇省中醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)科門(mén)診就診的排卵障礙性不孕癥患者，共60例。排卵障礙性不孕癥診斷標(biāo)準(zhǔn)：（1）無(wú)避孕性生活至少12個(gè)月而未孕，其中從未妊娠者稱為原發(fā)性不孕；曾有過(guò)妊娠而后未避孕連續(xù)1年不孕者稱為繼發(fā)性不孕；（2）基礎(chǔ)體溫測(cè)定：?jiǎn)蜗嗷虿坏湫碗p相型，溫差小于0.3 ℃，緩慢上升持續(xù)時(shí)間小于10 d；（3）卵泡監(jiān)測(cè)：周期第10天開(kāi)始，B超連續(xù)監(jiān)測(cè)卵泡，晚期或尿促黃體生成素（LH）峰值日優(yōu)勢(shì)卵泡平均直徑＜18 mm，或有成熟卵泡而無(wú)排卵征象；（4）血清孕酮低于黃體期水平。其中（1）必備，（2）～（4）項(xiàng)中符合其中2項(xiàng)者即可診斷。（參考第8版《婦產(chǎn)科學(xué)》《不孕不育專家推薦診療方案》、《人類輔助生殖技術(shù)規(guī)范》2003版）。

1.7.2 納入標(biāo)準(zhǔn) 年齡：21～35歲；符合上述診斷標(biāo)準(zhǔn)；至少3個(gè)自然周期B超監(jiān)測(cè)無(wú)優(yōu)勢(shì)卵泡發(fā)育，即無(wú)排卵征象；基礎(chǔ)促卵泡生成素（FSH）：5～10 mU/mL；1年內(nèi)子宮輸卵管造影示至少有一側(cè)輸卵管通暢；受試者同意并簽署知情同意書(shū)。

1.7.3 排除標(biāo)準(zhǔn) 先天性生理缺陷或畸形、染色體異常、生殖器官器質(zhì)性病變（子宮肌瘤、子宮腺肌癥、卵巢囊腫、生殖器腫瘤及癌前病變等）；高泌乳素血癥、甲功異常；合并心血管、肝、腎、造血系統(tǒng)等嚴(yán)重原發(fā)疾病、精神病者；已知對(duì)所有藥物過(guò)敏者；正在使用口服避孕藥、糖皮質(zhì)激素等激素藥物者；正在參加其他藥物臨床試驗(yàn)者；配偶少弱畸精癥者。

1.7.4 剔除和脫落病例標(biāo)準(zhǔn) 患者未按規(guī)定用藥，無(wú)法判定療效或資料不全等影響療效者；治療過(guò)程中發(fā)生嚴(yán)重不良反應(yīng)者。

1.7.5 治療方法

1.7.5.1 分組方法 將60例病人按隨機(jī)數(shù)字表法分為2組：試驗(yàn)組和對(duì)照組各30人。兩組均采用西藥促排治療，試驗(yàn)組在此基礎(chǔ)上于經(jīng)后期加用中藥滋陰方。本試驗(yàn)通過(guò)南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院倫理委員會(huì)審批（批件號(hào)：2018NL-120-03）。

1.7.5.2 服藥方法（1）試驗(yàn)組促排卵方法：于經(jīng)周第3～5天口服CC 1～2片/d，連服5 d，于經(jīng)周第8天開(kāi)始B超下監(jiān)測(cè)卵泡，并根據(jù)卵泡生長(zhǎng)情況，酌情添加促性腺激素（HMG）（樂(lè)寶得，規(guī)格75 U/支）。當(dāng)優(yōu)勢(shì)卵泡直徑≥18 mm 時(shí)，肌注絨毛膜促性腺激素（HCG）5000～10 000 U，囑患者24 h后同房，48 h后B超下確定卵泡是否排出，若卵泡排出后則開(kāi)始口服地屈孕酮健黃體治療，地屈孕酮服用方法為2次/d，2片/次，連服14 d。2周后測(cè)血清β-HCG，若β-HCG 結(jié)果陽(yáng)性提示妊娠，保胎治療。若β-HCG陰性，則停服地屈孕酮，繼續(xù)下1周期治療。滋陰方服用方法：于月經(jīng)干凈后即服用經(jīng)后滋陰方，當(dāng)卵泡平均直徑≥18 mm（肌注HCG日）時(shí)停用中藥；（2）對(duì)照組：不服用中藥，余治療同試驗(yàn)組。兩組均以3月經(jīng)周期為觀察期限，若妊娠，則終止試驗(yàn)。

1.7.6 觀察指標(biāo) HMG用量、卵泡發(fā)育天數(shù)、扳機(jī)日單個(gè)優(yōu)勢(shì)卵泡E2水平、周期排卵率、未破裂卵泡黃素化綜合征（LUFS）發(fā)生率、周期妊娠率。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

應(yīng)用SPSS23.0統(tǒng)計(jì)軟件分析，計(jì)量資料用t檢驗(yàn)，以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，計(jì)數(shù)資料用卡方檢驗(yàn)。P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 滋陰方活性成分

通過(guò)TCMSP 數(shù)據(jù)庫(kù)，結(jié)合“DL＞0.18”與“OB＞30%”篩選出滋陰方中可被口服吸收的48個(gè)活性成分，去除重復(fù)后得到40個(gè)活性成分。通過(guò)PubChem查找40 個(gè)成分的SMILES 字符串，得到有SMILES 字符串的活性成分24個(gè)（表1）。

2.2 滋陰方活性成分靶點(diǎn)預(yù)測(cè)結(jié)果

借助Swiss Target Prediction 網(wǎng)站，得到每個(gè)成分對(duì)應(yīng)的基因靶點(diǎn)，導(dǎo)出數(shù)據(jù)，共1152個(gè)成分靶點(diǎn)，去重后剩余354個(gè)靶點(diǎn)。需要指出的是MOL000492沒(méi)有預(yù)測(cè)到相關(guān)靶點(diǎn)，而MOL005486預(yù)測(cè)所得的靶點(diǎn)Probability均為0，故將二者予以剔除，剩余22個(gè)活性成分及354個(gè)靶點(diǎn)。

2.3 排卵障礙性不孕癥靶點(diǎn)預(yù)測(cè)結(jié)果

通過(guò)GeneCards數(shù)據(jù)庫(kù)檢索排卵障礙性不孕癥，共得到789個(gè)與排卵障礙性不孕癥相關(guān)的基因，作為疾病候選靶點(diǎn)基因。并提取各基因和排卵障礙性不孕癥的相關(guān)度，將基因名導(dǎo)入U(xiǎn)niProt數(shù)據(jù)庫(kù)，經(jīng)名稱-ID配對(duì)后獲得Uniprot ID 791個(gè)。將主要活性成分靶點(diǎn)和疾病靶點(diǎn)取交集，獲得滋陰方治療排卵障礙性不孕癥的靶點(diǎn)96個(gè)（表2）。應(yīng)用R軟件繪制疾病靶點(diǎn)與藥物成分靶點(diǎn)韋恩圖（圖1）。

2.4 有效成分-疾病靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)

用Excel表格整理“成分-靶點(diǎn)”對(duì)，導(dǎo)入Cytoscape 3.6.0 軟件，進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)風(fēng)格化顯示（圖2）。該網(wǎng)絡(luò)共有節(jié)點(diǎn)118個(gè)，邊405條，其中22個(gè)節(jié)點(diǎn)代表滋陰方活性成分，96個(gè)節(jié)點(diǎn)代表滋陰方治療排卵障礙性不孕癥的靶點(diǎn)。

2.5 構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)

我們將篩選出的96個(gè)共同靶點(diǎn)導(dǎo)入STRING數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行分析，將蛋白種類設(shè)置為“homo sapiens”，最低相互作用閾值設(shè)為“highest confidence”（0.9），獲得PPI網(wǎng)絡(luò)圖（圖3A）。并導(dǎo)入Cytoscape軟件，進(jìn)行Network-Analyzer分析，然后根據(jù)Degree值篩選關(guān)鍵靶點(diǎn)，其中度 值≥9 的 蛋 白 有10 個(gè)，分 別 為SRC、MAPK1、HSP90AA1、MAPK3、PTPN11、ESR1、AKT1、EGFR、NR3C1、KNG1（圖3B）。

2.6 GO分析

將96個(gè)共同靶基因?qū)隓AVID網(wǎng)站，獲得72條GO Term，其中關(guān)于生物學(xué)過(guò)程48條，細(xì)胞組成9條，分子功能15條。我們主要分析關(guān)鍵靶點(diǎn)生物學(xué)過(guò)程，發(fā)現(xiàn)主要集中在類固醇激素介導(dǎo)的信號(hào)通路、RNA聚合酶Ⅱ啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄起始、ERK1和ERK2級(jí)聯(lián)陽(yáng)性調(diào)節(jié)、氧化還原過(guò)程、蛋白磷酸化的正調(diào)控、凋亡過(guò)程負(fù)調(diào)控、MAP激酶活性的正向調(diào)節(jié)、細(xì)胞內(nèi)受體信號(hào)通路、跨膜受體蛋白酪氨酸激酶信號(hào)通路、類固醇代謝過(guò)程、對(duì)雌激素反應(yīng)、RNA聚合酶Ⅱ啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄的正調(diào)控、炎性反應(yīng)負(fù)調(diào)控、對(duì)缺氧的反應(yīng)、正向調(diào)控凋亡過(guò)程、正向調(diào)控細(xì)胞生長(zhǎng)、糖皮質(zhì)激素生物合成的過(guò)程、雄激素生物合成的過(guò)程、類固醇生物合成的過(guò)程等方面（表3）。

2.7 KEGG通路富集

將96個(gè)共同靶基因?qū)隓AVID網(wǎng)站進(jìn)行KEGG通路富集分析，以P＜0.05，F(xiàn)DR＜0.05為篩選標(biāo)準(zhǔn)，共得到富集通路11條（圖4、表4），包括癌癥通路、癌癥中的蛋白聚糖、PI3K-Akt信號(hào)通路、Rap1信號(hào)通路、HIF-1信號(hào)通路、雌激素信號(hào)通路、卵巢類固醇生成、前列腺癌、膀胱癌、類固醇激素生物合成、神經(jīng)膠質(zhì)瘤。

2.8 中藥-有效成分-靶點(diǎn)-通路網(wǎng)絡(luò)及臨床觀察統(tǒng)計(jì)

為了闡明滋陰方作用于排卵障礙性不孕癥的潛在機(jī)制，我們構(gòu)建了由滋陰方中藥-有效成分-靶點(diǎn)-KEGG 通路組成的復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)（圖5）。該網(wǎng)絡(luò)顯示了多個(gè)通路中的相互作用，在該網(wǎng)絡(luò)中，有134 個(gè)節(jié)點(diǎn)（5個(gè)中藥節(jié)點(diǎn)、22個(gè)有效成分節(jié)點(diǎn)、96個(gè)排卵障礙相關(guān)靶點(diǎn)節(jié)點(diǎn)和11條富集通路節(jié)點(diǎn)）和574條邊。圖4和表4 顯示了這11 條信號(hào)通路的詳細(xì)信息。通過(guò)該網(wǎng)絡(luò)分析，表明了滋陰方中的5 種中藥協(xié)同作用，通過(guò)不同的信號(hào)通路途徑治療排卵障礙性不孕癥，60例患者均完成臨床觀察，但在治療過(guò)程中有2位對(duì)照組患者強(qiáng)烈要求服用中藥，故最終試驗(yàn)組32人，對(duì)照組28人。其中試驗(yàn)組周期數(shù)84個(gè)，對(duì)照組72個(gè)。試驗(yàn)組HMG 用量少于對(duì)照組（P＜0.05），卵泡發(fā)育天數(shù)短于對(duì)照組（P＜0.05），班級(jí)日單個(gè)優(yōu)勢(shì)卵泡E2 水平高于對(duì)照組（P＜0.05），排卵率高于對(duì)照組（P＜0.05），妊娠率高于對(duì)照組（P＜0.05），而LUFS率未見(jiàn)明顯差異（P＞0.05）。臨床觀察統(tǒng)計(jì)結(jié)果見(jiàn)表5。

3 討論

西醫(yī)治療主要運(yùn)用各種促排藥物進(jìn)行促排，中藥在該病的治療中亦發(fā)揮著重要的作用［7］?！端貑?wèn)·陰陽(yáng)應(yīng)象大論》“陰陽(yáng)者，天地之道也”。國(guó)醫(yī)大師夏桂成教授立足于中醫(yī)“天人相應(yīng)”的觀點(diǎn)，重視陰陽(yáng)消長(zhǎng)轉(zhuǎn)化在女性生殖節(jié)律的核心作用環(huán)節(jié)，經(jīng)行過(guò)后即進(jìn)入經(jīng)后期，以陰長(zhǎng)為前提，通過(guò)陰藥的運(yùn)用滋陰養(yǎng)血，奠定卵泡發(fā)育的基礎(chǔ)［8］。導(dǎo)師經(jīng)驗(yàn)方滋陰方組成主要為陰藥，當(dāng)歸、白芍、干地黃為四物湯主藥，重在補(bǔ)血養(yǎng)陰，山茱萸入肝腎經(jīng)，重在補(bǔ)肝腎之陰，菟絲子為陽(yáng)中之陰藥，在于陽(yáng)中補(bǔ)陰，正如張景岳“善補(bǔ)陰者,必于陽(yáng)中求陰,則陰得陽(yáng)升而泉源不竭”，共奏助養(yǎng)卵泡之效，以助妊娠。本方旨在養(yǎng)陰，重在補(bǔ)養(yǎng)動(dòng)態(tài)之陰，若不加以助陽(yáng)，純以滋陰，則不易達(dá)到陰長(zhǎng)趨向中高水平的要求，致后期卵泡發(fā)育停滯及經(jīng)間期重陰轉(zhuǎn)陽(yáng)不利，致排卵障礙的發(fā)生。

本研究結(jié)果顯示，滋陰方活性成分22個(gè)，具體如文中表1。經(jīng)查閱文獻(xiàn)，發(fā)現(xiàn)Stigmasterol、beta-sitosterol與17β-雌二醇的結(jié)構(gòu)有很高的相似性，因此可作為雌激素激動(dòng)劑［9］。通過(guò)微量滴定板將beta-sitosterol生物轉(zhuǎn)化為雄烯二酮（一種關(guān)鍵的藥物類固醇中間體）［10］。kaempferol、quercetin、isorhamnetin都屬于生物類黃酮，可抑制KGN細(xì)胞中雌激素的生物合成［11］。實(shí)驗(yàn)證明kaempferol可以通過(guò)PI3K/AKT通路促進(jìn)原始卵泡活化和細(xì)胞增殖，降低體外培養(yǎng)的羊腔前卵泡的DNA碎片［12］。研究分析顯示quercetin對(duì)豬和牛培養(yǎng)的顆粒細(xì)胞的影響，結(jié)果表明quercetin對(duì)可能具有物種特異性的基本卵巢細(xì)胞功能（增殖，凋亡和激素釋放）具有直接作用［13］。有研究旨在測(cè)試膳食quercetin對(duì)熱應(yīng)激雌性兔卵泡數(shù)量，凋亡，體外成熟率和卵母細(xì)胞質(zhì)量的調(diào)節(jié)作用［14］。結(jié)果表明quercetin可改善卵泡發(fā)育，減少顆粒細(xì)胞凋亡，并維持卵母細(xì)胞能力。而對(duì)于有效成分CRL則是卵巢性激素合成的重要底物，對(duì)卵泡發(fā)育有重要影響［1］。

表2 共同靶點(diǎn)基因列表Tab.2 Common target genes list

圖1 維恩圖Fig.1 Venn diagram.

圖2 有效成分-疾病靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)Fig.2 Network of active ingredient-disease target.

上述有效成分對(duì)應(yīng)354個(gè)作用靶點(diǎn)，其中與排卵障礙性不孕癥相關(guān)的共同靶點(diǎn)96 個(gè)，其中包括SRC、MAPK1、HSP90AA1、MAPK3、PTPN11、ESR1、AKT1、EGFR、NR3C1、KNG1，為關(guān)鍵靶標(biāo)。研究發(fā)現(xiàn)SRC蛋白分布在原始卵泡的卵質(zhì)膜和顆粒細(xì)胞膜中，并且表達(dá)水平隨原始卵泡的生長(zhǎng)而增加，通過(guò)PI3K-PKC-ERK1/2途徑在調(diào)節(jié)原始卵泡的活化和生長(zhǎng)［15］。另有研究結(jié)果表明MAPK3/1蛋白在某些原始卵泡和所有生長(zhǎng)的卵泡中表達(dá)［16］。用MAPK3/1信號(hào)抑制劑培養(yǎng)3 d可顯著減少活化卵泡的數(shù)量，并伴有明顯減少的顆粒細(xì)胞增殖和卵母細(xì)胞凋亡的增加。研究發(fā)現(xiàn)［17］，母體持續(xù)暴露于環(huán)境化合物污染對(duì)胎兒卵巢發(fā)育有影響，導(dǎo)致原始卵泡儲(chǔ)備減少，同時(shí)觀察到卵巢蛋白的改變主要在胎兒卵巢蛋白和熱休克家族的幾個(gè)成員（HSPA4L，HSP90AA1和HSF1）。Idrees 等［18］提及PTPN11在牛卵母細(xì)胞的成熟和胚胎發(fā)育中起著重要作用。雌激素是調(diào)節(jié)生育能力的必需激素。細(xì)胞對(duì)雌激素的反應(yīng)是由雌激素受體α（ESR1）和雌激素受體β（ESR2）介導(dǎo)的。在小鼠和大鼠模型中，ESR1的破壞會(huì)導(dǎo)致雄性和雌性不育［19］。AKT1在卵巢支持細(xì)胞譜系中的分子作用仍然知之甚少。有學(xué)者為了深入了解其在此類細(xì)胞中的功能，通過(guò)耗盡了AKT1在鼠原代顆粒細(xì)胞中的表達(dá)，證實(shí)了AKT1參與這種卵巢細(xì)胞類型的代謝，細(xì)胞凋亡，細(xì)胞周期或細(xì)胞骨架動(dòng)力學(xué)的調(diào)節(jié)［20］。有研究綜述了EGF網(wǎng)絡(luò)在卵母細(xì)胞發(fā)育和排卵級(jí)聯(lián)調(diào)節(jié)中的作用，尤其著重于EGF網(wǎng)絡(luò)對(duì)卵母細(xì)胞發(fā)育能力的影響，總結(jié)了EGF網(wǎng)絡(luò)的急性上調(diào)是排卵級(jí)聯(lián)反應(yīng)的重要組成部分，因?yàn)樗鼤?huì)將LH信號(hào)從卵泡周?chē)鷤鬟f到卵母細(xì)胞復(fù)合體［21］。EGF信號(hào)下調(diào)，抑制卵母細(xì)胞減數(shù)分裂成熟并同時(shí)提供減數(shù)分裂誘導(dǎo)信號(hào)。EGF網(wǎng)絡(luò)還控制靜止卵母細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄翻譯，這是卵母細(xì)胞能力不可或缺的過(guò)程。有研究觀察到顆粒細(xì)胞中的NR3C1免疫染色從原始卵泡到竇卵泡逐漸增加，所有卵泡類別的卵母細(xì)胞和顆粒細(xì)胞中都存在NR3C1，除了在原始卵泡的顆粒細(xì)胞中。PCOS以女性不育和代謝異常為特征，是最常見(jiàn)的內(nèi)分泌疾病之一［22］。有研究對(duì)PCOS患者中蛋白質(zhì)變化的進(jìn)行分析，共納入43例PCOS患者和30例健康女性，證實(shí)了5種顯著降低的蛋白質(zhì)，其中包括KNG1［23］。

圖3 PPI網(wǎng)絡(luò)圖Fig.3 PPI network diagram.A:STRING;B:Cytoscape.

表3 共同靶基因GO富集分析Tab.3 GO enrichment analysis of common target genes

圖4 KEGG富集通路分析Fig.4 KEGG enrichment pathway analysis.

表4 共同靶點(diǎn)KEGG通路分析Tab.4 KEGG pathway analysis of common targets

圖5 中藥-有效成分-靶點(diǎn)-通路網(wǎng)絡(luò)圖Fig.5 Network diagram of Chinese medicine-active ingredient-target-pathway.

表5 兩組促排卵情況及周期結(jié)局比較Tab.5 Comparation of ovulation induction and cycle outcome between experimental group and control group

經(jīng)過(guò)GO分析，發(fā)現(xiàn)其生物學(xué)過(guò)程主要集中在類固醇激素介導(dǎo)的信號(hào)通路、氧化、還原、凋亡等過(guò)程。根據(jù)KEGG分析的結(jié)果，與排卵障礙相關(guān)的通路包括PI3KAkt信號(hào)通路、Rap1信號(hào)通路、HIF-1信號(hào)通路、雌激素信號(hào)通路、卵巢類固醇生成、類固醇激素生物合成。缺氧誘導(dǎo)因子是細(xì)胞生長(zhǎng)的主要調(diào)節(jié)因子。研究發(fā)現(xiàn)HIF是參與FSH對(duì)大鼠支持細(xì)胞增殖的調(diào)節(jié)［24］。研究證明HIF-1α在哺乳動(dòng)物卵巢的卵泡生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中以細(xì)胞和階段特異性方式表達(dá)［25］。通過(guò)免疫組織化學(xué)和蛋白質(zhì)印跡分析、顆粒細(xì)胞培養(yǎng)等實(shí)驗(yàn)證明HIF-1α介導(dǎo)的信號(hào)通路可能是體內(nèi)調(diào)節(jié)哺乳動(dòng)物卵巢卵泡生長(zhǎng)和發(fā)育的重要機(jī)制。一篇綜述中提到從原始卵泡停滯到激活生長(zhǎng)到卵母細(xì)胞成熟，哺乳動(dòng)物雌性種系中基因組完整性的保留對(duì)于確保生殖成功至關(guān)重要［26］。由于卵母細(xì)胞是在出生前形成的，并且可能保持多年休眠狀態(tài)，因此必須對(duì)防御機(jī)制進(jìn)行監(jiān)測(cè)并保持良好狀態(tài)，PTEN/PI3K/Akt是控制原始卵泡募集和生長(zhǎng)的主要信號(hào)途徑，該途徑還有助于細(xì)胞生長(zhǎng)，存活和代謝，并有助于維持基因組完整性。雌激素信號(hào)通路對(duì)正常卵泡發(fā)育至關(guān)重要，研究表明在體外成熟培養(yǎng)基中添加E2后，可以看到卵丘擴(kuò)展和隨后卵母細(xì)胞發(fā)育的增加［27］。

我們通過(guò)臨床試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，試驗(yàn)組的HMG用量少，卵泡發(fā)育天數(shù)短，扳機(jī)日單個(gè)優(yōu)勢(shì)卵泡E2水平高，周期排卵率及妊娠率亦高，較對(duì)照組均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05）。因此對(duì)于排卵障礙性不孕癥的患者，我們可以在西藥促排治療的同時(shí)加用中藥滋陰方，幫助孕卵生長(zhǎng)，提高妊娠率。

綜上，滋陰方中多種有效活性可以通過(guò)不同的途徑發(fā)揮其促進(jìn)卵泡發(fā)育的作用。中醫(yī)藥治療排卵障礙性不孕癥有獨(dú)特優(yōu)勢(shì)，多種中藥配伍使用，協(xié)同增效，相對(duì)于西藥促排卵其副作用明顯減少，同時(shí)排卵率及妊娠率明顯優(yōu)于單純西藥，具有良好的臨床應(yīng)用前景。