吳曉敏，陳映雪，周星宇，張 俊，黎 瑩，李 欣，張笑菲，陳士嶺

南方醫(yī)科大學(xué)南方醫(yī)院婦產(chǎn)科生殖醫(yī)學(xué)中心，廣東 廣州510515

在全球范圍內(nèi)，促性腺激素釋放激素拮抗劑（GnRH-ant）方案已經(jīng)成為輔助生殖治療最常用的控制性促排卵方案之一，GnRH-ant方案療程簡化，治療時(shí)間短，明顯降低卵巢過度刺激綜合征的風(fēng)險(xiǎn)［1］，對垂體抑制程度減輕，停藥后卵巢功能恢復(fù)迅速，因此被廣泛地應(yīng)用于高齡人群與卵巢儲(chǔ)備減退（DOR）患者。

高齡DOR群體周期取消率高，妊娠率低［2］，DOR是一個(gè)漸進(jìn)性發(fā)展的過程，促卵泡刺激素（FSH）的升高早于黃體生成素（LH）的變化［3］，導(dǎo)致基礎(chǔ)FSH/LH的比值升高。已有研究表明，≥35歲的DOR患者，LH/FSH與卵母細(xì)胞數(shù)量正相關(guān)，加之使用GnRH-ant后內(nèi)源性LH被抑制，預(yù)測卵巢反應(yīng)性較差，提示可以考慮通過給予HMG，提高LH與FSH的比例，以降低刺激不良風(fēng)險(xiǎn)［4］。有證據(jù)顯示GnRH-ant方案中添加HMG可以顯著提高胚胎種植率和臨床妊娠率［5］，亦有相反的觀點(diǎn)認(rèn)為患者應(yīng)用GnRH-ant后的內(nèi)源性LH仍足以維持對卵泡發(fā)育的刺激作用，需要重新評估添加的必要性［6-7］，目前對GnRH-ant方案中添加HMG的研究較少且結(jié)論各異，國內(nèi)對于特定高齡DOR群體的應(yīng)用缺乏文獻(xiàn)報(bào)道，需要進(jìn)一步探索。

本研究旨在分析應(yīng)用GnRH-ant方案過程中，高齡DOR患者添加HMG是否受益以及HMG添加時(shí)機(jī)對妊娠結(jié)局的影響，以探求更好的用藥方案，為提高高齡DOR群體臨床促排卵治療的有效性提供參考依據(jù)。

1 資料和方法

1.1 研究對象

回顧性分析2014年1月～2019年12月于本中心采用GnRH-ant方案行常規(guī)體外受精/卵胞漿單精子顯微注射受精（IVF/ICSI）助孕的高齡DOR患者，納入標(biāo)準(zhǔn)：年齡≥35歲，且滿足以下2項(xiàng)標(biāo)準(zhǔn)中的任意一項(xiàng)：（1）雙側(cè)卵巢基礎(chǔ)竇狀卵泡數(shù)（AFC）≤5；（2）基礎(chǔ)FSH≥10 U/L，和（或）基礎(chǔ)FSH/LH＞3.6。

1.2 促排卵方案及分組

所有患者均采用GnRH-ant方案，于月經(jīng)周期第2-4天評估卵巢基礎(chǔ)狀態(tài)，給予FSH制劑（注射用重組人促卵泡素，默克雪蘭諾；重組促卵泡素β注射液，默沙東；注射用尿促卵泡素，麗珠）150～300 U/d啟動(dòng)促排卵治療，根據(jù)HMG（注射用尿促性素，麗珠）的添加時(shí)機(jī)，共分為3組。無添加組：不添加HMG，僅使用FSH至扳機(jī)日；早期添加組：Gn第1日開始每日添加HMG 75～150 U至扳機(jī)日；中晚期添加組：主導(dǎo)卵泡直徑約10～14 mm時(shí)每日添加HMG 75～150 U至扳機(jī)日，同時(shí)減少相應(yīng)FSH劑量。Gn使用第5或6日時(shí)皮下注射GnRH-ant 0.25 mg/d直至扳機(jī)日，當(dāng)2～3個(gè)優(yōu)勢卵泡直徑≥18 mm時(shí)給予HCG 5000～10 000 U或聯(lián)合促性腺激素釋放激素激動(dòng)劑（GnRH-a）0.2 mg扳機(jī)，誘發(fā)排卵36～38 h后行經(jīng)陰道超聲引導(dǎo)下取卵術(shù)，取卵日開始黃體支持。

1.3 胚胎培養(yǎng)及孕期監(jiān)測

根據(jù)男方精液質(zhì)量及患者病情決定行IVF或ICSI，取卵后第3天或第5天行新鮮胚胎移植，若患者不適合鮮胚移植（因內(nèi)膜因素、孕酮升高等）則行全胚冷凍。移植12 d后檢測血β-絨毛膜促性腺激素水平，移植后4周通過超聲觀察到一個(gè)或多個(gè)孕囊及胎兒心管搏動(dòng)確定為臨床妊娠。優(yōu)質(zhì)胚胎標(biāo)準(zhǔn)為2PN來源、卵裂球數(shù)目7～8個(gè)且評分Ⅰ、Ⅱ級（Edwards標(biāo)準(zhǔn)）的D3胚胎［8］或評分≥3BB的囊胚（Gardner評分法）。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

數(shù)據(jù)采用SPSS 22.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用單因素方差分析或Kruskal-Wallis檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料用率表示，采用χ2檢驗(yàn)。P＜0.05（雙側(cè)）為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 患者基礎(chǔ)情況比較

本研究共納入682例≥35歲的DOR患者，其中無添加組371例，早期添加HMG組139例，中晚期添加HMG組172例。3組患者女方年齡、不孕年限、體質(zhì)量指數(shù)（BMI）、原發(fā)不孕比例、繼發(fā)不孕比例、基礎(chǔ)FSH、LH、E2、P、AFC、AMH差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05，表1）。

表1 患者基礎(chǔ)情況比較Tab.1 Baseline characteristics of the patients

2.2 卵巢刺激情況和促排卵結(jié)局

3組扳機(jī)日LH、E2、P水平、扳機(jī)日子宮內(nèi)膜厚度、扳機(jī)日直徑≥14 mm、≥16 mm、≥18 mm的卵泡個(gè)數(shù)、受精率、卵裂率、優(yōu)質(zhì)胚胎數(shù)差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；早期添加組、中晚期添加組Gn用量高于無添加組，中晚期添加組獲卵數(shù)高于早期添加組，中晚期添加組成熟卵子數(shù)、可利用胚胎數(shù)均高于無添加組及早期添加組（P＜0.05，表2）。

表2 卵巢刺激情況及促排卵結(jié)局Tab.2 Outcomes of controlled ovarian hyperstimulation in the patients

2.3 新鮮移植周期妊娠結(jié)局

3組間新鮮周期種植率、早期流產(chǎn)率、異位妊娠率、活產(chǎn)率比較均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）。中晚期添加組臨床妊娠率高于無添加組（P＜0.05），但早期添加組與無添加組及中晚期添加組比較均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05，表3）。

表3 新鮮移植周期妊娠結(jié)局Tab.3 Clinical outcomes of fresh embryo transfer cycle

2.4 全胚冷凍周期首次凍融胚胎移植（FET）妊娠結(jié)局

中晚期添加組臨床妊娠率較早期與無添加組妊娠率稍高，但未達(dá)到統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，3組間種植率、早期流產(chǎn)率、異位妊娠率、活產(chǎn)率比較均無顯著性差異（P＞0.05，表4）。

3 討論

本研究資料顯示，中晚期添加組的成熟卵子數(shù)、可用胚胎數(shù)、新鮮周期臨床妊娠率明顯升高，提示GnRHant方案中中晚期添加HMG能改善高齡DOR人群的促排卵結(jié)局和新鮮周期臨床妊娠率。此外，無添加組扳機(jī)日的LH水平為4.52±5.18 IU/L，與早期和中晚期添加組相比無顯著差異，表明添加HMG后不影響血清LH水平，不能夠通過血清LH水平反應(yīng)添加HMG后的LH水平。

HMG是外源性LH制劑的一種，是從絕經(jīng)期婦女尿中提取的促性腺激素（Gn），含F(xiàn)SH∶LH 比例1∶1，HMG中LH的活性主要由hCG驅(qū)動(dòng)［9］，與LH相比，hCG半衰期更長［10］，與黃體生成素/人絨毛膜促性腺激素受體（LHCGR）親和性更高［11］，其分泌不受性激素反饋調(diào)節(jié)機(jī)制的影響，能夠?yàn)槁雅萆L提供更穩(wěn)定的刺激環(huán)境。

表4 全胚冷凍周期首次FET妊娠結(jié)局Tab.4 Clinical outcomes of the first frozen-thawed embryo transfer cycle with a"freeze-all"strategy

女性35歲以后LH的生物活性下降［12］，使用GnRHant會(huì)導(dǎo)致卵泡液中LH、AMH水平顯著降低，而AMH與卵母細(xì)胞的著床潛力正相關(guān)，補(bǔ)充HMG能誘導(dǎo)卵泡分泌雄激素，刺激AMH分泌，改善卵母細(xì)胞質(zhì)量［13］，對于高齡DOR患者，推測添加HMG能增加IVF成功率［14-15］。有學(xué)者觀察到，高齡患者添加rLH與單用rFSH相比，獲卵數(shù)、種植率、流產(chǎn)率等均無差異，并無額外益處［16-18］。Alviggi［19］則提出，補(bǔ)充外源性LH制劑可能對兩類患者有利，包括預(yù)期對卵巢刺激反應(yīng)較遲鈍者以及36～39歲者，與本文研究結(jié)果一致。既往研究多集中于長方案以及rLH添加與否對妊娠結(jié)局的影響，本文根據(jù)添加時(shí)機(jī)進(jìn)行分組，首次明確闡述了GnRH-ant方案中高齡DOR患者中晚期添加HMG可獲益。

本研究中，與中晚期添加組相比，早期添加組的患者扳機(jī)后獲卵數(shù)偏少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。根據(jù)LH窗［20］和LH ceiling學(xué)說［21］，甾體激素的合成及優(yōu)勢卵泡的繼續(xù)生長需要在合適的LH作用水平下，即達(dá)到LH閾值，但不能超過一定的LH范圍，過低或過高均不利于卵泡發(fā)育。不同發(fā)育階段的卵泡LH上限不同，與未成熟卵泡相比，成熟卵泡的LH上限更高?？紤]早期添加組獲卵數(shù)下降可能是由于GnRH-ant方案允許內(nèi)源性LH的早期作用，再添加HMG會(huì)使得LH活性超過上限值，早卵泡期，未成熟卵泡耐受性較低，LH活性過高，將會(huì)抑制顆粒細(xì)胞增殖，造成過早黃素化或卵泡閉鎖［22］。一方面，顆粒細(xì)胞功能喪失和過早黃素化，會(huì)導(dǎo)致許多與卵母細(xì)胞發(fā)育有關(guān)的細(xì)胞因子如抑制素、胰島素樣生長因子等合成受阻，干擾卵丘-卵母細(xì)胞復(fù)合體的成熟過程［23］；另一方面，獲卵數(shù)的減少造成最終可利用的胚胎數(shù)少，這可能是早期添加組成熟卵子數(shù)、可利用胚胎數(shù)均低于晚期添加組的原因。

生理狀態(tài)下，卵泡早期，F(xiàn)SH刺激卵泡募集，使小竇狀卵泡免于凋亡。卵泡中期，血液中升高的E2通過負(fù)反饋機(jī)制抑制FSH，但被選擇的優(yōu)勢卵泡依然可以進(jìn)一步發(fā)育生長，很大程度上是由于卵泡逐漸依賴于LH［24］，該階段顆粒細(xì)胞開始表達(dá)自身LHCG受體并能直接對LH產(chǎn)生應(yīng)答，同時(shí)卵母細(xì)胞、顆粒細(xì)胞和卵泡膜細(xì)胞產(chǎn)生的卵泡內(nèi)調(diào)節(jié)因子使得顆粒細(xì)胞對FSH敏感性降低，LH的作用日益增大。高齡DOR患者處于生殖功能的老化階段，顆粒細(xì)胞有絲分裂速度減慢，凋亡比例增高［25］，LHCG受體敏感性下降。在卵泡中后期，當(dāng)生長的卵泡處于對類固醇生物合成刺激和最終成熟的最大需求時(shí)，內(nèi)源性LH水平快速下降，可能會(huì)對卵子正常發(fā)育造成不利影響［26］。此時(shí)添加HMG符合生理需求，中晚期添加HMG能上調(diào)FSHR和LHR的表達(dá)，增加芳香化酶的活性，增加顆粒細(xì)胞對FSH的敏感性［27-28］，刺激雄激素-AMH軸，從而改善卵子發(fā)育能力，提高胚胎質(zhì)量［29］。因此無添加組及中晚期添加組在獲卵數(shù)上雖無差異，但在成熟卵子數(shù)及可利用胚胎數(shù)上中晚期添加組明顯更高，這與國內(nèi)外學(xué)者研究一致，卵泡中后期添加HMG可以彌補(bǔ)內(nèi)源性LH活性不足帶來的負(fù)面影響，促進(jìn)卵母細(xì)胞發(fā)育成熟［30-31］。

研究中觀察到，中晚期添加組鮮胚移植周期臨床妊娠率明顯高于無添加組，除了由于中晚期添加HMG促進(jìn)卵子發(fā)育成熟，子宮內(nèi)膜上存在LHCG受體［32］，研究證實(shí)，HMG中的hCG成分對蛻膜化、著床、血管生成等過程具有重要的旁分泌作用［33-34］，hCG可以直接作用于內(nèi)膜調(diào)節(jié)蛻膜代謝，誘導(dǎo)基底層成纖維細(xì)胞中與蛻膜化相關(guān)的α-平滑肌細(xì)胞肌動(dòng)蛋白合成，調(diào)節(jié)血管內(nèi)皮生長因子、巨噬細(xì)胞集落刺激因子、胰島素樣生長因子結(jié)合蛋白1等的表達(dá)，同時(shí)保護(hù)內(nèi)膜基質(zhì)細(xì)胞免于氧化應(yīng)激相關(guān)的凋亡［35］。此外，當(dāng)子宮內(nèi)膜過早或過久暴露于hCG作用時(shí)，會(huì)觸發(fā)LHCG受體下調(diào)和下游信號減敏，細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶1/2磷酸化消除，內(nèi)膜細(xì)胞的粘附能力和緊密連接調(diào)節(jié)受損，繼而影響妊娠率，與Evans等的研究一致［36］，中晚期適量添加HMG能改善內(nèi)膜容受性，但過早添加反而削弱hCG的生物學(xué)作用，這可能是早期添加組臨床妊娠率高于無添加組，而低于中晚期添加組的原因。3組中，中晚期添加組活產(chǎn)率仍最高，比無添加組高9.5%，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，考慮與中晚期添加組樣本量較少有關(guān)，有待擴(kuò)大樣本量進(jìn)一步研究。

新鮮移植周期中晚期添加組臨床妊娠率高于無添加組，而在全胚冷凍周期兩組差異在統(tǒng)計(jì)學(xué)上不顯著，推測可能原因是卵巢刺激周期中，中晚期添加HMG能改善子宮內(nèi)膜的接受能力，促進(jìn)內(nèi)膜血管化，而凍胚移植可能消除了HMG 對內(nèi)膜的積極作用。Andersen等［37］的研究也表明，促排卵過程使用HMG會(huì)使血清和卵泡產(chǎn)生不同的激素水平波動(dòng)，繼而影響內(nèi)分泌反應(yīng)和子宮內(nèi)膜接受性。

本研究中，早期添加組與中晚期添加組Gn使用量均高于無添加組，可能是由于HMG含有較多的尿蛋白雜質(zhì)，制劑批次間差異較大，其生物活性存在內(nèi)變異，不如通過基因工程單克隆技術(shù)合成的FSH制劑純度高，生物活性和均一性好。但國產(chǎn)的HMG 價(jià)格僅為進(jìn)口rFSH的1/9，仍然不失為是一種經(jīng)濟(jì)有效的促排卵藥物選擇。

綜上所述，應(yīng)用GnRH-ant 方案時(shí)，中晚期添加HMG促進(jìn)卵泡發(fā)育，可能可以提高子宮內(nèi)膜的容受性，有利于改善高齡DOR患者的新鮮周期臨床妊娠率。本研究為回顧性研究，有待于嚴(yán)謹(jǐn)?shù)那罢靶噪S機(jī)對照試驗(yàn)進(jìn)一步分析，在藥代動(dòng)力學(xué)和分子水平上對其調(diào)控機(jī)制進(jìn)行驗(yàn)證。