張海龍,顏廣智,謝博,陳盛楠,鄧汝森,顧萬(wàn)軍,黃良宗
(佛山科學(xué)技術(shù)學(xué)院生命科學(xué)與工程學(xué)院,廣東 佛山 528000)
在過(guò)去的20年中,microRNA(miRNA)已被發(fā)現(xiàn)在不同類型的細(xì)胞中存在,包括癌細(xì)胞和免疫細(xì)胞。miRNA在細(xì)胞增殖與活化、先天免疫細(xì)胞和調(diào)節(jié)性免疫細(xì)胞中的分化、疾病的發(fā)生發(fā)展等多種生化過(guò)程中均扮演重要角色。Th17細(xì)胞是在2005年發(fā)現(xiàn)的不同于Th1和Th2細(xì)胞的第三亞群的輔助性T細(xì)胞,該亞群的輔助性T細(xì)胞主要分泌白細(xì)胞介素-17(IL-17,也稱為IL-17A)、IL-17F和IL-22等細(xì)胞因子,并由于IL-22和IL-17受體的廣泛分布,從而誘導(dǎo)了大量的組織反應(yīng)[1-2]。分化因子(TGF-與IL-6或IL-21)、生長(zhǎng)和穩(wěn)定因子(IL-23)和轉(zhuǎn)錄因子(RORt、STAT3和ROR等)在幼稚CD4+T細(xì)胞向Th17細(xì)胞分化中發(fā)揮重要作用[3-5]。大量研究表明:流感病毒感染宿主可引起miRNA表達(dá)譜的明顯變化,病毒可能通過(guò)調(diào)控某些miRNA表達(dá)量的變化從而實(shí)現(xiàn)免疫逃逸,增強(qiáng)其對(duì)宿主的感染能力;同時(shí)宿主自身也可通過(guò)調(diào)控某些miRNA的表達(dá)變化,從而啟動(dòng)抗病毒反應(yīng)機(jī)制[6]。Th17細(xì)胞在抗感染、寄生蟲免疫以及自身免疫性疾病中發(fā)揮重要作用[7],其分泌的細(xì)胞因子具有促進(jìn)炎性細(xì)胞(中性粒細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞等)聚集至炎癥部位,具有較強(qiáng)的促炎癥反應(yīng)的作用。Th17細(xì)胞參與豬流感病毒感染宿主介導(dǎo)的炎癥損傷,IL-17基因缺失小鼠可抵抗致死性H1N1亞型豬流感病毒攻擊,提高小鼠存活率[8]。miRNA通過(guò)與靶基因的3′UTR結(jié)合導(dǎo)致靶基因的降解或抑制其翻譯過(guò)程發(fā)揮其調(diào)控功能。H1N1豬流病毒感染小鼠miRNA差異表達(dá)分析表明,試驗(yàn)組miR-124-3p相比對(duì)照組顯著上調(diào)約3.8倍,其調(diào)控靶基因之一是STAT3,也是Th17細(xì)胞分化過(guò)程中關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子[9]。因此,豬流感病毒感染小鼠顯著上調(diào)的miR-124-3p可能通過(guò)調(diào)節(jié)Th17細(xì)胞的分化,從而減輕流感病毒感染所致的炎癥反應(yīng)。探討miR-124-3p對(duì)Th17細(xì)胞體外分化的影響對(duì),于豐富miRNA調(diào)控作用,探索一種可行的免疫調(diào)節(jié)方式,降低Th17細(xì)胞介導(dǎo)的炎性反應(yīng)都具有重要作用。
miR-124-3p過(guò)表達(dá)/抑制腺病毒、空白載體由本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建,于-80 ℃凍存;293A細(xì)胞系由中國(guó)科學(xué)院廣州生物醫(yī)藥與健康研究院提供;6~8周齡SPF級(jí)C57BL/6雌性小鼠購(gòu)自廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。
胎牛血清(FBS)購(gòu)自New Zealand公司;青霉素/鏈霉素雙抗混合液購(gòu)自GIBCO公司;小鼠CD4+CD62L+T細(xì)胞磁珠分選試劑盒、Gentle MACS 25C Tubes、autoMACS Running Buffer、TexMACS GMP Medium(Phenol Red)均購(gòu)自德國(guó)Miltenyi Biotec MACS;小鼠淋巴細(xì)胞分離液購(gòu)自深圳達(dá)科為生物技術(shù)有限公司;重組人細(xì)胞因子TGF-β1、重組小鼠細(xì)胞因子(IL-6、IL-1β、IL-23)、抗小鼠IL-4 抗體、抗小鼠IL-2抗體、IL-17A小鼠ELISA檢測(cè)試劑盒均購(gòu)自美國(guó)R&D公司;抗小鼠 IFN-γ抗體、固定/破膜試劑盒、小鼠抗CD3 /CD28單克隆抗體、藻紅蛋白熒光標(biāo)記抗小鼠IL-17單克隆抗體、異硫氰酸熒光素標(biāo)記抗小鼠CD4單克隆抗體、藻紅蛋白熒光標(biāo)記抗小鼠CD62L單克隆抗體均購(gòu)自美國(guó)BD公司;蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)抑制劑Protein Transport Inhibitor cocktail、細(xì)胞刺激試劑Cell Stimulation cocktail、HEPES(1 mol/mL)均購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司、Evo M-MLV 反轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自湖南艾科瑞生物工程有限公司;RNAiso Plus(Total RNA提取試劑)、TB GreenTMPremix ExTaqTM均購(gòu)自日本Takara公司;PBS(不含鈣鎂離子)購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司;24孔、48孔、96孔細(xì)胞培養(yǎng)板、70 μmol/L細(xì)胞篩網(wǎng)均購(gòu)自江蘇NEST。
根據(jù)mmu-miR-124-3p(miR-124-3p)基因(mouse),查找pre-miR序列:ATCAAGATCAGAGA-CTCTGCTCTCCGTGTTCACAGCGGACCTTGATTTAAT-GTCATACAATTAAGGCACGCGGTGAATGCCAAGAGC-GGAGCCTACGGCTGCACTTGAA;根據(jù)mmu-miR-124-3p(miR-124-3p)基因(mouse),查找miRNA成熟體序列,根據(jù)成熟體序列設(shè)計(jì)sponge序列,得到序列如下:GGCATTCGAGACGTGCCTTACGCGGGCA-TTCGAGACGTGCCTTACGCGGGCATTCGAGACGTGCC-TTACGCGGGCATTCGAGACGTGCCTTACGCGGGCATT-CGAGACGTGCCTTACGCGGGCATTCGAGACGTGCCTT-ACGCGGGCATTCGAGACGTGCCTTACGCG;將上述基因合成后,構(gòu)建至穿梭載體PDC315-U6-MCS-CMV-EGFP,然后分別將插入目的序列的穿梭質(zhì)粒與輔助質(zhì)粒pBHGlox(delta) E13cre使用Lipofectamine2000共同轉(zhuǎn)染至293A細(xì)胞,5% CO2,37 ℃恒溫培養(yǎng)24 h,熒光顯微鏡對(duì)培養(yǎng)的細(xì)胞進(jìn)行觀察。7 d后收集細(xì)胞與上清,置于-20 ℃,反復(fù)凍融2 次,1 500 r/min、4 ℃離心1 min,收取上清液,上清液即為構(gòu)建好的載體腺病毒。將收集的載體腺病毒重新感染293A細(xì)胞,5% CO2、37 ℃恒溫培養(yǎng)72 h,按上述方法凍融離心后收集上清液,即為擴(kuò)增的載體腺病毒;過(guò)表達(dá)腺病毒命名為miR-124-3p-over,抑制性腺病毒命名為miR-124-3p-sponge,空載體腺病毒命名為miR-124-3p-blank。將293A細(xì)胞輕輕吹打混勻,并加入至5 mL離心管中(離心管預(yù)先加入了10% FBS的高糖DMEM培養(yǎng)基3 mL),1 000g離心5 min,棄去上清,加入含10% FBS的DMEM培養(yǎng)基重懸,并將其轉(zhuǎn)移至6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中,培養(yǎng)24 h后進(jìn)行傳代;傳代接種2.5×105個(gè)/mL 293A細(xì)胞于3塊24孔板,培養(yǎng)24 h后,細(xì)胞匯合度達(dá)到100%,使用含10%FBS的高糖DMEM培養(yǎng)基稀釋腺病毒原液,各自配制5個(gè)稀釋梯度,分別是10-2、10-3、10-4、10-5、10-6。每個(gè)梯度重復(fù)3個(gè)孔,每孔分別加入50 μL的病毒液,同時(shí)保留剩下9個(gè)孔正常生長(zhǎng)的細(xì)胞作為陰性對(duì)照,繼續(xù)培養(yǎng)。腺病毒感染293A細(xì)胞48 h后,使用熒光顯微鏡(10×10倍)觀察每個(gè)梯度感染的熒光細(xì)胞數(shù),并選用熒光細(xì)胞數(shù)接近50的梯度,每孔采用2個(gè)不同視野進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù),每個(gè)待測(cè)腺病毒共得到6個(gè)數(shù)值,最后計(jì)算平均數(shù);按照公式:滴度=(熒光細(xì)胞數(shù)×每孔的視野數(shù))/(加入病毒液體積×稀釋倍數(shù)),計(jì)算出腺病毒滴度。
按常規(guī)方法處死C57BL/6小鼠,無(wú)菌取脾臟,充分研磨,制成2 mL脾細(xì)胞懸液。按德國(guó)Miltenyi Biotec公司磁珠分選試劑盒說(shuō)明書分選獲得CD4+CD62L+T細(xì)胞,進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù);用TexMACSTMMedium 培養(yǎng)基(含10%胎牛血清、1%雙抗)將細(xì)胞密度調(diào)整為5×105個(gè)/mL,每孔200 μL鋪于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中。
取分選后的單細(xì)胞懸液置于2 mL EP管中,細(xì)胞總數(shù)約4×105個(gè),加入1 mL 4 ℃預(yù)冷的Stain Buffer洗滌細(xì)胞2次,300 r/min、4 ℃離心10 min后棄上清。加入200 μL預(yù)冷Stain Buffer重懸細(xì)胞后,將其分至4個(gè)1.5 mL離心管中。向EP管中加入0.1 μL 異硫氰酸熒光素標(biāo)記的抗小鼠CD4+流式抗體和0.1 μL 藻紅蛋白熒光標(biāo)記的抗小鼠CD62L+流式抗體,并分出空白管和單染管。將熒光標(biāo)記抗體與細(xì)胞懸液吹打混勻后,4 ℃避光孵育30 min。孵育完成后,用1 mL Stain Buffer洗滌細(xì)胞2次,300 r/min、4 ℃離心10 min,棄上清液。向各EP管中加入200 μL預(yù)冷Stain Buffer重懸細(xì)胞,上機(jī)檢測(cè)分析。
將磁珠分選后的幼稚 T細(xì)胞用完全培養(yǎng)基(含10 mmol/L HEPES、1%雙抗)重懸至5×105個(gè)/mL,鋪于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板,每孔200 μL;參考文獻(xiàn)[10]方法,以感染復(fù)數(shù)(MOI)為50對(duì)細(xì)胞進(jìn)行感染,每孔分別加入5 μL腺病毒,每組做3個(gè)重復(fù),37 ℃、5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)4~6 h;分別收集細(xì)胞于1.5 mL滅菌EP管中,300 r/min離心10 min,無(wú)菌PBS洗滌1次后進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn);轉(zhuǎn)染miRNA后培養(yǎng)40 h,提取RNA,用miR-124-3p特異性引物及隨機(jī)引物(Random 6 mers Primer)分別逆轉(zhuǎn)錄為cDNA,以U6為內(nèi)參(正向引物:CGCTTCGGCAGCACATATAC,反向引物:TTCACGAATTTGCGTGTCAT)檢測(cè)過(guò)表達(dá)組和空白對(duì)照組miR-124-3p的相對(duì)表達(dá)量。
分別將轉(zhuǎn)染4~6 h后的幼稚 T細(xì)胞收集于1.5 mL滅菌EP管中,做好標(biāo)記;300 r/min離心10 min,完全棄除上清;用200 μL TexMACSTM培養(yǎng)基(含10%胎牛血清、1% 雙抗和下面所述細(xì)胞因子)充分混勻重懸細(xì)胞;加入的各種重組細(xì)胞因子:TGF-β(人2 ng/mL)、IL-1β(小鼠10 ng/mL)、IL-6(小鼠50 ng/mL)、IL-23(小鼠10 ng/mL)、anti-IFN-γ(小鼠10 μg/mL)、anti-IL-4(小鼠10 μg/mL);在5%CO2、37 ℃細(xì)胞恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)4 d,300 r/min離心10 min,收集上清,剩余細(xì)胞團(tuán)塊用200 μL TexMACSTM完全培養(yǎng)基(含1×cell Stimulation Cocktail和1×Transport Inhibitor Cocktail)繼續(xù)培養(yǎng)6 h后,收集細(xì)胞進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)Th17細(xì)胞占比。
將1.7中收集的上清液進(jìn)行ELISA檢測(cè),檢測(cè)上清中IL-17A濃度。利用Curve exert 1.6.5軟件繪制線性標(biāo)準(zhǔn)曲線,曲線橫坐標(biāo)為標(biāo)準(zhǔn)曲線點(diǎn)的小鼠IL-17A濃度值,縱坐標(biāo)為標(biāo)準(zhǔn)曲線點(diǎn)的OD平均值。通過(guò)樣本的OD值,根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線測(cè)出樣本中小鼠 IL-17A的濃度。
本研究中全部試驗(yàn)結(jié)果均有2次或2次以上獨(dú)立試驗(yàn)統(tǒng)計(jì)得出。兩組數(shù)據(jù)之間的比較使用t檢驗(yàn)。P值小于0.05說(shuō)明兩組之間差異顯著,具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,P值大于0.05則差異不顯著。所有統(tǒng)計(jì)圖均使用GraphPad prism 8.0.2軟件(GraphPad Software,San Diego,USA)進(jìn)行繪制。
每孔采用2個(gè)不同視野進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù),每個(gè)待測(cè)腺病毒共得到6個(gè)數(shù)值,最后計(jì)算平均數(shù)。miR-124-3p過(guò)表達(dá)組平均數(shù)為34個(gè),抑制組平均數(shù)為33個(gè),對(duì)照組平均數(shù)為35個(gè)。因此,miR-124-3p-over =(34 PFU×136)/(0.05 mL×10-4)=9.248×108PFU/mL;NC=(32 PFU×136)/(0.05 mL×10-4)=8.700×108PFU/mL;miR-124-3p-sponge =(35 PFU×136)/(0.05 mL×10-4)=9.520×108PFU/mL。
每只小鼠脾臟可獲得約3×107個(gè)淋巴細(xì)胞,經(jīng)CD4+CD62L+T細(xì)胞磁珠篩選后約可獲得1×106個(gè)幼稚T細(xì)胞,獲得率約為3.33%。其中,流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)幼稚 T細(xì)胞占CD4+T細(xì)胞的比值(純度)>90%,結(jié)果見(jiàn)圖1。
圖1 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)磁珠分選后幼稚 T細(xì)胞占比CD4+T細(xì)胞結(jié)果(n=3)
熒光定量PCR檢測(cè)結(jié)果表明,miR-124-3p-over(40 h)可顯著提高幼稚T細(xì)胞中miR-124-3p的表達(dá)量(P=0.019 4),結(jié)果見(jiàn)圖2。
*表示P<0.05,下同圖2 RT-qPCR檢測(cè)過(guò)表達(dá)組和對(duì)照組中miR-124-3p相對(duì)表達(dá)量(n=3)
流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞表面抗原CD4+和胞內(nèi)抗原IL-17A,確定各組細(xì)胞體外定向分化占比,結(jié)果如圖3所示。與對(duì)照組相比,miR-124-3p-over可抑制幼稚T細(xì)胞體外定向分化為Th17細(xì)胞,差異顯著(P=0.01);而當(dāng)抑制miRNA-124-3p在幼稚T細(xì)胞中表達(dá)水平時(shí),則可以顯著提高體外Th17細(xì)胞定向分化(P=0.02)。
圖3 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)體外定向分化Th17細(xì)胞占比(n=3)
使用Curve exert 1.6.5軟件制作標(biāo)準(zhǔn)曲線(圖4),根據(jù)樣品OD450的值代入標(biāo)準(zhǔn)曲線(y值)求出各組樣品中IL-17A濃度。過(guò)表達(dá)組上清中IL-17A平均濃度為21.565 pg/mL,空白對(duì)照組中IL-17A平均濃度為38.310 pg/mL,抑制組IL-17A平均濃度為64.780 pg/mL(圖5)。由圖5可見(jiàn),與對(duì)照組相比,miR-124-3p過(guò)表達(dá)組上清中IL-17A濃度顯著下降(P=0.02),miR-124-3p抑制組IL-17A濃度顯著增多(P=0.02)。
圖4 curve exert 1.6.5軟件制定的標(biāo)準(zhǔn)曲線
圖5 ELISA法檢測(cè)幼稚 T細(xì)胞體外定向分化Th17細(xì)胞4 d后各組細(xì)胞上清中IL-17A濃度(n=3)
miRNA對(duì)靶基因存在多水平調(diào)節(jié)作用,包括表達(dá)遺傳效應(yīng)、啟動(dòng)子調(diào)控、RNA加工、穩(wěn)定以及翻譯等[11];同時(shí),miRNA也可對(duì)Th17細(xì)胞分化的某些關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子(如STAT3、RORγt)進(jìn)行多水平調(diào)節(jié),從而對(duì)Th17細(xì)胞的分化進(jìn)行“開(kāi)始或停止”,調(diào)控介導(dǎo)Th17細(xì)胞在抗感染、自身免疫性疾病等過(guò)程中發(fā)揮作用。研究證明,miR-21靶向抑制SMAD-7蛋白促進(jìn)Th17細(xì)胞分化介導(dǎo)試驗(yàn)性自身腦脊髓炎發(fā)展[12]。小鼠模型中,miR-193b通過(guò)Wnt/β-catenin 信號(hào)通路抑制A型流感病毒感染所致的肺臟炎性損傷[13]。利用miRNA靶基因預(yù)測(cè)軟件分析表明,miR-124-3p中的一個(gè)重要靶基因,就是Th17細(xì)胞分化相關(guān)的關(guān)鍵正向轉(zhuǎn)錄因子STAT3。在人神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞(SH-SY5Y cells)中,靶向調(diào)控STAT3蛋白表達(dá)對(duì)1-甲基-4-苯基吡啶離子(MPP+)所致的神經(jīng)損傷具有改善作用[14]。
腺病毒表達(dá)載體不僅對(duì)傳代細(xì)胞具有良好的轉(zhuǎn)染效果,在較難轉(zhuǎn)染的原代細(xì)胞(CD4+T淋巴細(xì)胞)也具有良好的轉(zhuǎn)染效果,且具有毒性較低的特點(diǎn)[15]。本試驗(yàn)中,對(duì)磁珠法分選的幼稚T細(xì)胞,培養(yǎng)過(guò)夜后使其適應(yīng)一段時(shí)間,利用腺病毒表達(dá)載體(感染復(fù)數(shù)為50)使其過(guò)表達(dá)并設(shè)置空白對(duì)照組,感作4~6 h,換液培養(yǎng)40 h后,熒光定量PCR檢測(cè)結(jié)果表明,過(guò)表達(dá)組中miR-124-3p表達(dá)量顯著上調(diào)(P<0.05),表明腺病毒表達(dá)載體在轉(zhuǎn)染幼稚T細(xì)胞時(shí),轉(zhuǎn)染細(xì)胞的miRNA表達(dá)可取得較好的試驗(yàn)效果,為miRNA調(diào)控Th17細(xì)胞體外分化提供基礎(chǔ)。為探討miR-124-3p在體外極化條件下對(duì)Th17細(xì)胞分化的影響,本試驗(yàn)采用免疫磁珠法篩選出幼稚 T細(xì)胞,并用流式細(xì)胞術(shù)對(duì)其純度進(jìn)行檢測(cè),結(jié)果表明純度大于90%,說(shuō)明磁珠篩選幼稚 T細(xì)胞具有較好的效果,達(dá)到體外分化的要求。轉(zhuǎn)染腺病毒后的幼稚T細(xì)胞在Th17細(xì)胞體外分化的條件下,刺激其向Th17定向分化的結(jié)果表明,與對(duì)照組相比,miR-124-3p過(guò)表達(dá)組可顯著降低Th17細(xì)胞分化占比,而抑制組可顯著增加Th17細(xì)胞分化占比。與空白對(duì)照組相比,過(guò)表達(dá)組中IL-17A濃度顯著降低,抑制組中IL-17A濃度顯著增加。IL-17是Th17細(xì)胞分泌的免疫調(diào)節(jié)因子,IL-17A主要通過(guò)誘導(dǎo)靶細(xì)胞表達(dá)多種炎癥因子和趨化因子來(lái)發(fā)揮其促進(jìn)炎癥反應(yīng)的功能[16]。豬流感病毒感染誘導(dǎo)的小鼠急性呼吸窘迫綜合征模型中,小鼠血漿和支氣管肺泡灌洗液中IL-17A含量升高,而IL-17A的基因敲除小鼠中,豬流感病毒感染誘導(dǎo)的急性呼吸窘迫綜合征都得到了有效緩解[17]。
綜上所述,miR-124-3p顯著上調(diào)具有抑制宿主Th17細(xì)胞分化作用,從而減輕Th17細(xì)胞介導(dǎo)的炎性反應(yīng),其具體的靶向調(diào)控基因還需要進(jìn)一步深入研究。