唐標，陳怡飛，陳聰，王靜鴿，黃磊，錢鳴蓉，楊華*

(1.浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全危害因子與風(fēng)險防控國家重點實驗室，浙江 杭州 310021；2.浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全與營養(yǎng)研究所，浙江 杭州 310021；3.浙江理工大學(xué)生命科學(xué)與醫(yī)藥學(xué)院，浙江 杭州 310018；4.青海大學(xué)農(nóng)牧學(xué)院，青海 西寧 810016)

大腸埃希菌俗稱大腸桿菌，歸屬于腸桿菌科埃希菌屬(Escherichia)[1-2]。大腸桿菌在自然界中廣泛存在，是人畜腸道共棲菌和條件致病菌[3-4]，給畜禽養(yǎng)殖業(yè)造成嚴重的經(jīng)濟損失。近年來，隨著抗生素在畜禽養(yǎng)殖中大量使用，導(dǎo)致了大腸桿菌的耐藥譜較廣且耐藥率居高不下[5-6]。對我國江蘇[7]、山東[8]、廣東[9]、浙江[10]、四川[11]、黑龍江[12]等地區(qū)動物源大腸桿菌的調(diào)查發(fā)現(xiàn)，大腸桿菌耐藥水平持續(xù)處于高位，多重耐藥性問題日益凸顯。多重耐藥大腸桿菌不僅威脅畜禽健康，也可進入環(huán)境或通過食物鏈對人類健康構(gòu)成威脅。

湖南省是我國的農(nóng)業(yè)大省，也是畜禽養(yǎng)殖大省。為調(diào)查湖南省部分地區(qū)動物源大腸桿菌的耐藥水平和耐藥特征，本研究于2019年從湖南省部分養(yǎng)殖場中分離了203株動物源大腸桿菌，進行了藥敏試驗分析，以期為湖南省動物源細菌耐藥性監(jiān)測工作提供數(shù)據(jù)，同時為畜禽養(yǎng)殖過程中合理使用抗菌藥提供參考。

1 材料與方法

1.1 試劑及培養(yǎng)基

Mueller-Hinton肉湯(MHB)、LB瓊脂、緩沖蛋白胨水(BPW)、麥康凱瓊脂(MacConkey Agar)培養(yǎng)基和伊紅美藍(EMB)培養(yǎng)基均購自北京陸橋技術(shù)有限責(zé)任公司。

1.2 標準菌株

大腸桿菌藥敏試驗質(zhì)控菌株ATCC 25922為本實驗室保藏。

1.3 藥敏檢測板

藥敏檢測板購自上海星佰生物技術(shù)有限公司，包含預(yù)制的具有固定稀釋梯度的氨芐西林(AMP)、奧格門丁(阿莫西林/克拉維酸鉀，A/C)、慶大霉素(GEM)、四環(huán)素(TET)、大觀霉素(SPT)、氟苯尼考(FFC)、磺胺異噁唑(SF)、復(fù)方新諾明(SXT)、頭孢噻呋(CEF)、頭孢他啶(CAZ)、恩諾沙星(ENR)、氧氟沙星(OFL)、美羅培南(MEM)、安普霉素(APR)、黏菌素(CL)和乙酰甲喹(MEQ)等16種抗生素。

1.4 采樣和分離方法

2019年10月從湖南省郴州市、常德市、寧鄉(xiāng)市和株洲市的19個畜禽養(yǎng)殖場采集新鮮糞便樣品，每個場采集新鮮糞便15份。采樣場點包括減抗示范場5個和非減抗示范場14個，涉及雞場14個、豬場3個、鴨場2個。

將糞便和肛拭子樣品轉(zhuǎn)接到BPW中，37 ℃增菌12 h，然后在麥康凱瓊脂培養(yǎng)基上進行劃線分離。37 ℃培養(yǎng)12 h，挑取可疑菌落(鮮桃紅色或微紅色，菌落中心呈深桃紅色，邊緣整齊)在EMB上再次劃線驗證，37 ℃培養(yǎng)12 h，挑取可疑菌落(金屬綠色)至LB瓊脂上進行劃線，培養(yǎng)16 h后挑取單菌落進行細菌質(zhì)譜鑒定。將驗證確定的大腸桿菌菌株用20%甘油保藏至-80 ℃下備用。

1.5 接種菌懸液制備

將上述分離保藏的大腸桿菌在LB瓊脂培養(yǎng)基上分離劃線，純化2次后，用接種環(huán)挑取5～10個單菌落至無菌生理鹽水中，配制0.5麥氏濁度的懸浮液(約為1.5×108CFU/mL)；用MHB對菌懸液進行稀釋，使得最終接種菌液濃度為5×105CFU/mL至10×105CFU/mL。

1.6 藥物敏感性試驗及結(jié)果判讀

采用微量肉湯稀釋法(微量孔板)檢測16種抗生素對大腸桿菌的最小抑菌濃度(MIC)，依據(jù)美國臨床實驗室標準化委員會(Clinical and Laboratory Standards Institute of America，CLSI)的相關(guān)藥敏折點判定標準，判斷菌株是否耐藥，并且以敏感(S)、耐藥(R)、中介(I)表示[13]。其中安普霉素和乙酰甲喹暫未有折點。大腸桿菌ATCC 25922作為質(zhì)控菌株。

2 結(jié)果

2.1 大腸桿菌分離與藥敏檢測

從湖南省4市的19個畜禽養(yǎng)殖場分離大腸桿菌203個，每個場分離出菌株數(shù)1～15株，平均每個場10.7株。從雞場、鴨場和豬場分別分離出的菌株數(shù)分別為146、20和37株大腸桿菌。

203株大腸桿菌對16種抗生素的藥物敏感性檢測結(jié)果如圖1所示。根據(jù)測得的MIC分布規(guī)律來看，本研究中分離的菌株對大部分抗生素的耐藥譜較寬，其中氨芐西林、四環(huán)素、磺胺異噁唑、復(fù)方新諾明等抗生素的MIC明顯較高，表現(xiàn)出高度的耐藥。相反，美羅培南、黏菌素的MIC則明顯處于低位。所有受試菌株對氨芐西林和四環(huán)素的耐藥率最高(圖2)，均在80%以上；其次是磺胺異噁唑、復(fù)方新諾明和氟苯尼考，耐藥率分別為74.9%、73.9%和67.0%。受試菌株對氨基糖苷類藥物的耐藥性在不同藥物間存在較大差異，對大觀霉素的耐藥率較高(53.2%)，對慶大霉素的耐藥率較低(19.7%)。203株大腸桿菌對頭孢類藥物的耐藥率較低，對頭孢他啶耐藥率為2.5%，對奧格門丁的耐藥率僅為2.0%。此外，對黏菌素的耐藥率為0.5%，同時對美羅培南均敏感。通過此次的藥敏結(jié)果可以發(fā)現(xiàn)，大腸桿菌的耐藥性和抗生素的使用量相關(guān)性很強，對養(yǎng)殖中常用抗生素耐藥率較高(四環(huán)素類、氟苯尼考、磺胺類)，而對禁用或處方治療藥耐藥率極低(頭孢噻呋、頭孢他啶、奧格門丁、美羅培南、黏菌素)。

注：黃色代表耐藥(R)，綠色代表中介(I)，藍色代表敏感(S)；A～P分別為氨芐西林、奧格門丁、慶大霉素、大觀霉素、四環(huán)素、氟苯尼考、磺胺異噁唑、復(fù)方新諾明、頭孢噻呋、頭孢他啶、恩諾沙星、氧氟沙星、美羅培南、安普霉素、黏菌素、乙酰甲喹圖1 203株大腸桿菌對不同抗生素的最小抑菌濃度數(shù)量統(tǒng)計

圖2 203株大腸桿菌的耐藥率

2.2 不同養(yǎng)殖場來源的大腸桿菌耐藥情況比較

從不同來源3種養(yǎng)殖動物中都分離出了大腸桿菌，見表1。雞源大腸桿菌對四環(huán)素(87.7%)、氨芐西林(85.0%)、磺胺異噁唑(78.1%)、復(fù)方新諾明(75.3%)、氟苯尼考(67.1%)5種抗生素的耐藥率超過50%。鴨源大腸桿菌對氨芐西林的耐藥率最高(90.0%)，其次是四環(huán)素(85.0%)、復(fù)方新諾明(85.0%)、氟苯尼考和磺胺異噁唑(均為65.0%)。豬源大腸桿菌對四環(huán)素的耐藥率最高(97.3%)，隨后是對氨芐西林(81.1%)、大觀霉素(67.6%)、氟苯尼考(67.6%)、磺胺異噁唑(67.6%)和復(fù)方新諾明(62.2%)的耐藥率較高(表1)。此外，雞源大腸桿菌對頭孢噻呋、頭孢他啶、恩諾沙星、氧氟沙星4種抗生素的耐藥率均高于鴨源和豬源。盡管不同動物源的大腸桿菌數(shù)目差異較大，但是一定程度反映了各個動物來源的菌株耐藥性水平均處在高位。

表1 不同動物源大腸桿菌對14種抗生素的耐藥率統(tǒng)計結(jié)果 /%

此次調(diào)查同時比較了減抗示范場和非減抗示范場來源的大腸桿菌耐藥差異，見表2。分離的203株大腸桿菌中有52株來源于減抗示范養(yǎng)殖場，無論是減抗示范養(yǎng)殖場還是非減抗養(yǎng)殖場大腸桿菌分離株均對氨芐西林、四環(huán)素、磺胺異噁唑、復(fù)方新諾明和氟苯尼考表現(xiàn)出較高的耐藥性(>60%)；減抗示范養(yǎng)殖場大腸桿菌分離株除對奧格門丁、美羅培南、黏菌素表現(xiàn)出全部敏感外，對其他藥物均具有不同程度的耐藥。此外，減抗示范養(yǎng)殖場大腸桿菌對氟苯尼考的耐藥率顯著高于非減抗示范養(yǎng)殖場，而對恩諾沙星的耐藥率顯著低于非減抗示范養(yǎng)殖場(P<0.05)，對于其余12種抗生素的耐藥水平無顯著差異。這個結(jié)果表明，減抗示范場的細菌耐藥性相比其他養(yǎng)殖場并沒有明顯差異。

表2 不同類型養(yǎng)殖場分離的大腸桿菌對常用抗生素的耐藥率

2.3 大腸桿菌多重耐藥性分析

多重耐藥性是評價細菌耐藥性水平的另外一個指標。203株大腸桿菌對14種抗生素的多重耐藥結(jié)果如圖3所示。除11株大腸桿菌對所用藥物全部敏感外，其余192株菌對至少一種藥物耐藥。178株菌(87.7%)對3種及以上的抗生素有耐藥性，其中3～5種抗性有87株(42.9%)；6～9種有60株(29.6%)；9～11種有31株(15.3%)。203株大腸桿菌的耐藥譜如表3所示。

表3 湖南省203株大腸桿菌的耐藥譜

圖3 203株大腸桿菌對14種抗生素的多重耐藥分布

本研究中，203株大腸桿菌共有60種耐藥譜型，優(yōu)勢耐藥譜型為AMP-TET-FFC-SF-SXT和AMP-SPT-TET-SF-SX，分別占比9.4%和7.39%。有兩株菌對11種藥物耐藥，譜型分別是AMP-A/C-GEM-SPT-TET-FFC-SF-SXT-CEF-ENR-OFL和AMP-GEM-SPT-TET-FFC-SF-SXT-CEF-CAZ-ENR-OFL。另外，有5.42%的菌株對14種藥物均敏感。此次結(jié)果說明，大腸桿菌多重耐藥比例很高，一定程度上反映出養(yǎng)殖場中細菌具有較高的耐藥水平。

續(xù)表3

3 討論

隨著養(yǎng)殖業(yè)規(guī)模化、集約化的發(fā)展，使用抗生素作為飼料添加劑以預(yù)防和控制畜禽的細菌性疾病已經(jīng)成為主要措施，然而抗生素的不合理使用和濫用導(dǎo)致了動物源耐藥細菌大量出現(xiàn)[14-15]。本研究對湖南省203株大腸桿菌的耐藥性監(jiān)測結(jié)果顯示：所有菌株對四環(huán)素、復(fù)方新諾明、磺胺異噁唑、氨芐西林、氟苯尼考等5種抗生素的耐藥率，比對其他幾種抗生素的耐藥率高，這可能與這幾種藥物在畜禽養(yǎng)殖中大量使用有關(guān)[16]；對黏菌素的敏感率接近100%，這可能與黏菌素在2017年禁止作為飼料添加劑有關(guān)，呈逐年下降的趨勢[17]。對于大部分抗生素，2019年湖南省大腸桿菌仍然呈高水平耐藥。對氨芐西林的耐藥率(84.7%)相比2016年湖南部分豬場(88.5%，52株)[18]稍低，四環(huán)素耐藥率(89.2%)相比2013年湖南永州市(91.2%，91株)[19]和2009湖南西部地區(qū)(96.6%，147株)[20]的報道也有所降低。但是，動物源細菌耐藥性數(shù)據(jù)來源較少，且缺少統(tǒng)一的監(jiān)測方法、標準和藥物范圍，所以往往難以準確的比較耐藥水平差異。

對分離自不同類型養(yǎng)殖場的菌株耐藥性比較發(fā)現(xiàn)，除氟苯尼考和恩諾沙星外，減抗示范養(yǎng)殖場菌株對其余6種抗生素的耐藥率數(shù)值上雖然低于非減抗養(yǎng)殖場菌株，但并沒有統(tǒng)計學(xué)上的差異。這提示我們減抗示范養(yǎng)殖場需要做細菌耐藥性水平評估，耐藥性水平下降需要長期的過程。

質(zhì)粒介導(dǎo)的獲得性耐藥基因豐富多樣，可通過接合轉(zhuǎn)移和轉(zhuǎn)座子插入等方式水平轉(zhuǎn)移至受體細菌，導(dǎo)致多重耐藥現(xiàn)象傳播。即使使用一種抗生素，也可能對多重耐藥質(zhì)粒具有選擇壓力，導(dǎo)致質(zhì)粒長期存在，這無疑會對細菌耐藥性的防控工作帶來巨大阻礙。此次分離的動物源大腸桿菌的耐藥譜以抗氨芐西林/四環(huán)素/氟苯尼考/磺胺異噁唑/復(fù)方新諾明為主，耐藥譜類型達60種，下一步可以通過高通量測序探討是否主要與質(zhì)粒介導(dǎo)相關(guān)。此次研究提示，實際養(yǎng)殖過程中應(yīng)減少上述抗生素的使用，避免長期使用同種或同類抗生素，盡量交替用藥。另外，黏菌素作為飼料添加劑在2017年已被禁用，目前來看大腸桿菌對其耐藥性下降效果明顯，可為獸醫(yī)臨床治療帶來福祉。