劉金鳳，覃紹敏，石勝，林俊，杜毅超，馬玲，秦樹英，白安斌，陳鳳蓮，張振江，吳健敏*

(1.廣西壯族自治區(qū)獸醫(yī)研究所/廣西獸醫(yī)生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣西 南寧 530001;2.上海海利生物技術(shù)股份有限公司，上海 201403)

豬瘟(classical swine fever,CSF)是由豬瘟病毒(classical swine fever virus,CSFV)引起的一種急性、熱性及高度接觸性傳染病，是目前危害養(yǎng)豬業(yè)發(fā)展主要傳染病之一[1]。早在上世紀(jì)60年代，我國(guó)就成功研制了豬瘟兔化弱毒苗，對(duì)豬瘟急性發(fā)生和大規(guī)模流行控制起了決定性作用。然而，近年來豬瘟流行趨勢(shì)發(fā)生了變化，發(fā)病特征和臨床癥狀越來越復(fù)雜，出現(xiàn)典型豬瘟和非典型豬瘟并存，持續(xù)性感染和隱性感染共現(xiàn)的現(xiàn)象，豬瘟防控依然面臨著重要挑戰(zhàn)[2-4]。目前，除研制有效的豬瘟疫苗和制備抗豬瘟病毒特異性抗體外，開發(fā)經(jīng)濟(jì)簡(jiǎn)便的豬瘟病毒快速檢測(cè)方法，對(duì)有效進(jìn)行豬瘟防控同樣具有重要意義。

紅細(xì)胞凝集試驗(yàn)是一種以紅細(xì)胞作為指示物的免疫檢測(cè)技術(shù)，其主要試劑為紅細(xì)胞特異性抗體。紅細(xì)胞膜H抗原是一種共有抗原，分布在人所有血型紅細(xì)胞表面，以其為抗原制備的特異性抗體能與不同血型的紅細(xì)胞結(jié)合，不發(fā)生凝集反應(yīng)，而當(dāng)這種抗體與另外的抗原或抗體結(jié)合形成雙功能分子時(shí)，能通過待檢樣品中抗原或抗體的橋聯(lián)作用，使紅細(xì)胞發(fā)生肉眼可見的凝集反應(yīng)[5-7]。單鏈抗體具有天然抗體的親和力，分子量小，易于改造并可大量制備，是構(gòu)建雙功能抗體的理想元件[8-9]。本研究在抗人紅細(xì)胞膜H抗原單鏈抗體基因(2E8-scFv)[6]及抗豬瘟病毒單鏈抗體基因(CSFV-scFv)基礎(chǔ)上[10]，通過基因重組技術(shù)，以柔性肽(G4S)3連接，構(gòu)建抗人紅細(xì)胞表面H抗原單鏈抗體與抗豬瘟病毒單鏈抗體融合的雙功能單鏈抗體基因，經(jīng)大腸桿菌密碼子優(yōu)化后進(jìn)行原核表達(dá)，分析其雙功能活性，制備抗豬瘟病毒雙功能抗體，為進(jìn)一步建立以紅細(xì)胞凝集試驗(yàn)為技術(shù)支撐的CSFV病原快速檢測(cè)方法奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 主要材料

TOP10感受態(tài)細(xì)胞、pCzn1質(zhì)粒、BL21(Plyss)感受態(tài)細(xì)胞、CSFV、豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)、豬圓環(huán)病毒2型(PCV2)、豬細(xì)小病毒(PPV)流行株均由本實(shí)驗(yàn)室保存；CSFV、偽狂犬病毒(PRV)、PCV2、PRRSV、PPV病原陽性血清均為臨床病原檢測(cè)為單一病毒感染的豬血清；限制性內(nèi)切酶、DNA Marker、T4連接酶為TaKaRa公司產(chǎn)品；質(zhì)粒小提試劑盒、DNA膠回收試劑盒、蛋白Marker、BCA蛋白定量試劑盒為TIANGEN公司產(chǎn)品；IPTG為Promega公司產(chǎn)品；抗His單克隆抗體為 Invitrogen 公司產(chǎn)品；HRP-羊抗鼠IgG、FITC-羊抗鼠IgG為Solarbio公司產(chǎn)品；Ni-IDA親和層析柱為Novagen公司產(chǎn)品；其他化學(xué)試劑均為進(jìn)口或國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 雙功能單鏈抗體基因密碼子優(yōu)化及合成

將CSFV-scFv與2E8-ScFv通過彈性連接肽Linker(Gly4Ser)3連接，構(gòu)建雙功能單鏈抗體基因2E8-CSFV，根據(jù)http://www.kazusa.or.jp/codon、GenScript Rare Codon Analysis Tool和CodonW1.4.2對(duì)2E8-CSFV基因序列密碼子組成、使用頻率及鳥嘌呤和胞嘧啶比率(GC含量)等進(jìn)行分析，并根據(jù)大腸桿菌密碼子的偏好性[11]，利用密碼子優(yōu)化軟件，將2E8-CSFV基因的部分密碼子替換成高度表達(dá)的大腸桿菌密碼子。優(yōu)化后的雙功能單鏈抗體基因DNA序列發(fā)生變化，但表達(dá)的蛋白質(zhì)氨基酸序列不變，并在基因的上游加入NdeⅠ，下游加入XbaⅠ酶切位點(diǎn)。優(yōu)化后的雙功能單鏈基因由南京鐘鼎生物科技有限公司合成，連接于pUC載體，即 pUC-2E8CSFV。

1.3 雙功能單鏈抗體基因表達(dá)載體的構(gòu)建

將重組質(zhì)粒pUC-2E8CSFV和pCzn1載體分別用NdeⅠ、XbaⅠ雙酶切后凝膠電泳回收酶切產(chǎn)物，并進(jìn)行T4 DNA連接，轉(zhuǎn)化TOP10感受態(tài)細(xì)胞，挑取單克隆，提取質(zhì)粒并用NdeⅠ和XbaⅠ進(jìn)行雙酶切鑒定后測(cè)序分析，構(gòu)建重組質(zhì)粒pCzn1-2E8CSFV。

1.4 重組質(zhì)粒的原核表達(dá)

將測(cè)序正確的重組質(zhì)粒pCzn1-2E8CSFV轉(zhuǎn)化BL21(Plyss)感受態(tài)細(xì)胞，挑取單菌落接種于3 mL 含Amp 的LB培養(yǎng)基中，37 ℃ 220 r/min 培養(yǎng)過夜，第2天按1∶100將菌液接種于30 mL 含Amp 的LB培養(yǎng)基中，培養(yǎng)至菌體OD600約0.6～0.8時(shí)，加入IPTG至終濃度為0.5 mmol/L，誘導(dǎo)培養(yǎng)4 h后取樣。同時(shí)以未經(jīng)誘導(dǎo)的菌液為對(duì)照，細(xì)菌經(jīng)超聲波破碎后進(jìn)行離心，收集上清和沉淀經(jīng)SDS-PAGE鑒定。

1.5 表達(dá)產(chǎn)物的純化

按1.4中的步驟方法對(duì)重組質(zhì)粒進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，表達(dá)培養(yǎng)體積為1 000 mL。離心棄上清收集菌體，將菌體重懸于20 mL 裂解液中，超聲波破碎后，4 ℃、10 000 r/mim 離心 20 min，收集包涵體沉淀，用包涵體洗滌液洗滌3次后，用溶解緩沖液按一定比例4 ℃放置過夜溶解包涵體，再次4 ℃、10 000 r/mim 離心 20 min，取上清經(jīng)0.45 μm濾器過濾后，用Ni-IDA親和層析柱進(jìn)行蛋白純化。收集洗脫液SDS-PAGE 檢測(cè)，并將其裝入透析袋中，用含有不同濃度(6、4、2、0 mol/L)尿素的復(fù)性液梯度稀釋復(fù)性，最后 PBS脫鹽，獲得純化蛋白-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.6 單鏈抗體的活性鑒定

1.6.1 間接免疫熒光(IFA)檢測(cè)雙功能單鏈抗體病毒結(jié)合活性

用豬瘟病毒接種生長(zhǎng)良好的PK-15細(xì)胞，37 ℃共培養(yǎng)24～72 h，細(xì)胞融合達(dá)80%時(shí)，以80%預(yù)冷丙酮固定細(xì)胞15～30 min，PBS洗滌2次后，5%脫脂奶粉4 ℃封閉過夜，加入純化的重組蛋白37 ℃孵育1 h，PBS洗滌2次，加入抗His單克隆抗體37 ℃孵育1 h，加入FITC標(biāo)記的羊抗鼠IgG，37 ℃ 避光孵育1 h，于熒光顯微鏡下觀察結(jié)果。同時(shí)以正常培養(yǎng)PK-15細(xì)胞，PPV和PCV2感染的PK-15細(xì)胞以及PRRSV感染的Marc-145細(xì)胞對(duì)照。

1.6.2 間接ELISA檢測(cè)雙功能單鏈抗體活性

收集CSFV細(xì)胞培養(yǎng)液，經(jīng)反復(fù)凍融后，4 ℃ 12 000 r/min 離心15 min，收集上清液制備病毒液。將病毒液4 ℃包被酶標(biāo)板過夜(5 μg /mL)，PBST洗滌3次，加入3%脫脂奶粉封閉2 h，PBST洗滌3次。將表達(dá)的重組蛋白進(jìn)行倍比稀釋，取100 μL分別加入各酶標(biāo)孔，37 ℃結(jié)合反應(yīng)1 h，PBST洗滌3次，加入100 μL/孔鼠抗His抗體(1∶1 000)，37 ℃孵育1 h，棄液體，PBST洗滌3次，加入100 μL/孔HRP標(biāo)記的羊抗鼠二抗(1∶1 000)，37 ℃孵育1 h，棄液體，PBST洗滌3次，加入100 μL/孔TMB顯色液，37 ℃顯色30 min后，加入2 mol/L H2SO4終止顯色，50 μL/孔，在450 nm 處讀取OD值。

1.6.3 紅細(xì)胞凝集試驗(yàn)檢測(cè)雙功能單鏈抗體活性

取CSFV病原陽性、陰性血清，按50 μL/孔依次加入血凝板中，然后再每孔加入50 μL表達(dá)的重組蛋白(500 μg/mL)和50 μL 1%的O型(A、B、AB型)人紅血球細(xì)胞，混均勻，室溫靜置30～60 min，觀察結(jié)果，紅細(xì)胞呈網(wǎng)狀平鋪于孔底為100%凝集(++++)，紅細(xì)胞呈網(wǎng)狀平鋪于孔底，但邊緣下滑為75%凝集(+++)，紅細(xì)胞于孔底呈環(huán)狀或小團(tuán)為50%凝集(++)，紅細(xì)胞少量凝集成小團(tuán)為25%凝集(+)，紅細(xì)胞沉于孔底呈點(diǎn)狀為不凝集(-)。同時(shí)設(shè)置其他常見豬病毒PRV、PCV2、PRRSV、PPV經(jīng)病原為陽性的血清作為對(duì)照。

2 結(jié)果

2.1 雙功能單鏈抗體基因設(shè)計(jì)優(yōu)化及合成

CSFV-scFv和2E8-ScFv通過連接肽Linker(Gly4Ser)3連接，構(gòu)建融合基因2E8-CSFV，綜合分析大腸桿菌密碼子偏好性、轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)元件、mRNA二級(jí)結(jié)構(gòu)、GC含量等參數(shù)，在不改變?nèi)诤匣虬被嵝蛄械那疤嵯?，將基因所有密碼子替換成大腸桿菌使用頻率最高或次高的密碼子，優(yōu)化后基因全長(zhǎng)1 533 bp，GC含量為53.44%，處于相對(duì)平衡狀態(tài)，優(yōu)化后合成基因連接于PUC，構(gòu)建重組質(zhì)粒pUC-2E8-CSFV。

2.2 雙功能單鏈抗體基因重組表達(dá)載體構(gòu)建

將重組質(zhì)粒pUC-2E8-CSFV酶切，回收目的片段后，定向克隆到pCzn1載體中，構(gòu)建重組表達(dá)載體pCzn1-2E8-CSFV，重組質(zhì)粒經(jīng)酶切鑒定，可見預(yù)期長(zhǎng)約4.4 kb目的條帶和1.5 kb的目的條帶(圖1)，將酶切鑒定正確的重組質(zhì)粒進(jìn)行測(cè)序鑒定，結(jié)果顯示與預(yù)期一致。

M.DL 5000 DNA Marker；1.pCzn1-2E8-CSFV質(zhì)粒；2.pCzn1-2E8-CSFV雙酶切產(chǎn)物圖1 pCzn1-2E8-CSFV質(zhì)粒酶切鑒定

2.3 雙功能單鏈抗體的原核表達(dá)

重組表達(dá)載體pCzn1-2E8-CSFV轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(Plyss)，進(jìn)行IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)SDS-PAGE分析，結(jié)果見圖2。在約55 kDa處出現(xiàn)明顯的誘導(dǎo)條帶，與預(yù)期結(jié)果相符合。進(jìn)一步收集誘導(dǎo)菌液的上清及沉淀SDS-PAGE分析可知，目的蛋白主要以包涵體形式表達(dá)，主要存在于沉淀中(圖2)。

M.預(yù)染蛋白分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1.未誘導(dǎo)的pCzn1-2E8-CSFV；2.IPTG誘導(dǎo)的pCzn1-2E8-CSFV；3.誘導(dǎo)破碎后上清；4.誘導(dǎo)破碎后沉淀圖2 pCzn1-2E8-CSFV表達(dá)產(chǎn)物SDS-PAGE分析

2.4 雙功能單鏈抗體的純化及鑒定

表達(dá)菌大量誘導(dǎo)表達(dá)，收集菌體制備包涵體，用Ni-IDA -Sepharose CL-6B 親和層析柱純化目的蛋白，并進(jìn)行6 mol/L尿素變性和梯度復(fù)性，純化復(fù)性后目的蛋白經(jīng)SDS-PAGE分析，結(jié)果見圖3。目的蛋白在大腸桿菌中高效表達(dá)，經(jīng)親和層析柱純化后得到純度90%以上的純化蛋白，BCA測(cè)定蛋白濃度最高可達(dá)0.25 mg/mL。

M.蛋白分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1.破碎后沉淀；2.流出液圖3 表達(dá)產(chǎn)物純化后SDS-PAGE分析

2.5 間接免疫熒光檢測(cè)雙功能單鏈抗體病毒結(jié)合活性

采用IFA方法檢測(cè)雙功能單鏈抗體病毒結(jié)合活性，結(jié)果見圖3。在熒光顯微鏡下可見CSFV病毒感染的細(xì)胞產(chǎn)生特異性綠色熒光(圖4)，而PRRSV、PCV2、PPV病毒感染組及陰性對(duì)照組細(xì)胞則無特異性熒光反應(yīng)(圖略)，表明原核表達(dá)的重組雙功能單鏈抗體與豬瘟病毒具有良好的結(jié)合特性。

A.未感染CSFV的PK-15細(xì)胞；B.感染CSFV的PK-15細(xì)胞圖4 雙功能抗體間接免疫熒光檢測(cè)

2.6 間接ELISA檢測(cè)雙功能單鏈抗體活性

采用間接ELISA方法檢測(cè)雙功能單鏈抗體活性。以豬瘟病毒為抗原包被ELISA板，與不同濃度的重組蛋白2E8-CSFV進(jìn)行反應(yīng)，結(jié)果見圖5。2E8-CSFV濃度從0.5 mg/mL倍比稀釋后，隨著濃度降低，OD450值下降，表明原核表達(dá)的重組雙功能單鏈抗體2E8-CSFV具有較好的生物活性，與豬瘟病毒有一定的結(jié)合能力。

圖5 雙功能抗體與CSFV的結(jié)合活性分析

2.7 紅細(xì)胞凝集試驗(yàn)檢測(cè)雙功能單鏈抗體活性

以不同血型的人紅細(xì)胞為指示劑，用純化復(fù)性后的重組雙功能單鏈抗體與不同豬病毒病原陽性血清進(jìn)行紅細(xì)胞凝集試驗(yàn)，結(jié)果見圖6。在不同血型(O、A、B、AB)紅細(xì)胞中，重組雙功能單鏈抗體2E8-CSFV 均能與CSFV病原為陽性的血清發(fā)生凝集反應(yīng)，但與PRV、PCV2、PRRSV、PPV病原為陽性血清均未發(fā)生凝集反應(yīng)(圖7)。表明原核表達(dá)的雙功能單鏈抗體2E8-CSFV既能與人紅細(xì)胞特異性結(jié)合，同時(shí)又能與豬瘟病毒反應(yīng)，具有雙功能特性。

1.O型人紅細(xì)胞；2.A型人紅細(xì)胞；3.B型人紅細(xì)胞；4.AB型人紅細(xì)胞；A.雙功能單鏈抗體組；B.陰性對(duì)照組圖6 雙功能單鏈抗體紅細(xì)胞凝集特性檢測(cè)

1.PRV；2:PCV2；3.PPV；4.PRRSV；5.CSFV圖7 紅細(xì)胞凝集試驗(yàn)方法特異性分析

3 討論

目前以scFv為基礎(chǔ)構(gòu)建的雙功能抗體已在許多領(lǐng)域得到了廣泛應(yīng)用并且具有多克隆抗體和單鏈抗體無法比擬的優(yōu)點(diǎn)[12]，然而在動(dòng)物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，對(duì)動(dòng)物源性抗原單鏈抗體的研究相對(duì)匱乏，而豬瘟病毒單鏈抗體應(yīng)用于豬瘟病原檢測(cè)國(guó)內(nèi)更是鮮有報(bào)道。我國(guó)是養(yǎng)豬大國(guó)，每年因豬瘟造成的損失難以估計(jì)，豬瘟仍是限制我國(guó)養(yǎng)豬業(yè)發(fā)展的一大難題，防治任務(wù)艱巨，如何準(zhǔn)確快速的進(jìn)行豬瘟病原學(xué)診斷具有重要意義。盡管近年來PCR、DNA探針、ELISA等技術(shù)廣泛用于豬瘟病原的診斷研究，加快了病原微生物檢驗(yàn)速度，有著不可替代的優(yōu)勢(shì)[13]，然而，就我國(guó)養(yǎng)殖國(guó)情，基層獸醫(yī)站和養(yǎng)殖場(chǎng)并不具備開展這些技術(shù)的人員設(shè)備條件，難以開展大規(guī)模應(yīng)用。因此，有必要探索一種簡(jiǎn)便、快速、特異并適合基層生產(chǎn)使用的診斷技術(shù)。將單鏈抗體技術(shù)與以抗原抗體反應(yīng)為本質(zhì)的紅細(xì)胞凝集試驗(yàn)技術(shù)相結(jié)合研制豬瘟病原快速診斷方法有望取得較好的應(yīng)用前景。

獲得特異性強(qiáng)、活性高的雙功能抗體是建立紅細(xì)胞凝集試驗(yàn)檢測(cè)方法的前提?；蛑亟M技術(shù)彌補(bǔ)了傳統(tǒng)化學(xué)交聯(lián)法和雙雜交瘤法操作復(fù)雜、穩(wěn)定性差、產(chǎn)量低等缺點(diǎn)，可廣泛用于雙功能抗體的制備。1994年，Lilley等[14]首次應(yīng)用基因重組技術(shù)制備出抗人紅細(xì)胞單鏈抗體和HIV-1抗原融合的雙功能抗體；邵長(zhǎng)利等[6]以抗人紅細(xì)胞H抗原單克隆抗體為材料，制備其單鏈抗體2E8-scFv，并構(gòu)建2E8-scFv融合HIV-1 gp41抗原肽的雙功能抗體，用于HIV抗體檢測(cè)，為建立基于紅細(xì)胞H抗原的免疫檢測(cè)技術(shù)奠定了基礎(chǔ)。我們實(shí)驗(yàn)室在前期研究中以2E8-scFv為基礎(chǔ)，成功制備了用于豬瘟抗體[15]、偽狂犬抗體[16]及狂犬抗體[17]快速檢測(cè)的雙功能分子，進(jìn)一步證實(shí)了2E8-scFv融合外源基因能在原核系統(tǒng)中表達(dá)，并具有雙功能活性。

本試驗(yàn)應(yīng)用基因重組技術(shù)，通過柔性肽將2E8-scFv和CSFV-scFv連接構(gòu)建雙功能單鏈抗體基因。不同物種細(xì)胞在蛋白翻譯過程中，與外源基因所編碼的氨基酸密碼子使用頻率之間存在差異，研究表明密碼子優(yōu)化能顯著提高蛋白的表達(dá)水平。為提高雙特異性抗體的表達(dá)效率，在不改變基因氨基酸序列前提下，綜合分析宿主細(xì)胞密碼子偏好性、mRNA二級(jí)機(jī)構(gòu)、GC含量等參數(shù)對(duì)基因密碼子進(jìn)行優(yōu)化并合成，克隆至pCzn1原核載體進(jìn)行大腸桿菌誘導(dǎo)表達(dá)。SDS-PAGE和Western blot鑒定目的蛋白主要以包涵體形式表達(dá)，其原因可能是大腸桿菌表達(dá)率過高，合成的蛋白沒有足夠的空間折疊，二硫鍵產(chǎn)生錯(cuò)配或過多的蛋白非特異性結(jié)合，溶解度下降形成不溶性包涵體[18]。包涵體含量高、純度高，可作為活性蛋白貯存庫(kù)存在。通常采用氧化還原法或尿素梯度透析法從包涵體中獲得活性蛋白[19]，雙功能抗體半胱氨酸含量低，氧化還原半胱氨酸形成正確二硫鍵的方法，不適用于雙功能抗體的變性復(fù)性。因此本研究選用0 mol/L～6 mol/L尿素，對(duì)表達(dá)的包涵體進(jìn)行變性和梯度透析，緩慢恢復(fù)線性多肽的正確結(jié)構(gòu)。間接免疫熒光顯示復(fù)性后，雙功能抗體能與豬瘟病毒結(jié)合，保留了親本抗體的抗原結(jié)合活性，但試驗(yàn)所用抗體濃度較高，可能與抗體純化復(fù)性方法有關(guān)，蛋白復(fù)性不完全，復(fù)性產(chǎn)物中活性蛋白含量低，導(dǎo)致抗體親和力低；此外，以CSFV為包被抗原，間接ELISA檢測(cè)雙功能抗體的CSFV結(jié)合活性，結(jié)果線性關(guān)系不理想，這可能與純化后的蛋白純度有關(guān)；進(jìn)一步紅細(xì)胞凝集試驗(yàn)表明，重組雙功能抗體能與CSFV抗原為陽性的血清發(fā)生凝集反應(yīng)，證實(shí)雙功能抗體的雙特異性，但紅細(xì)胞凝集效果不太理想，抗體使用量較大，反應(yīng)時(shí)間較長(zhǎng)，與預(yù)期存在一定差距，雙功能抗體的活性、純度及凝集試驗(yàn)的反應(yīng)條件還需進(jìn)一步優(yōu)化提高。

綜上所述，本研究通過基因重組技術(shù)，成功構(gòu)建密碼子優(yōu)化型抗人紅細(xì)胞表面抗原與抗豬瘟病毒單鏈抗體融合的雙功能抗體基因，及其高效原核表達(dá)系統(tǒng)，成功制備出既能與人紅細(xì)胞結(jié)合，又能與CSFV病原反應(yīng)的雙功能抗體，為后續(xù)建立CSFV病原紅細(xì)胞凝集試驗(yàn)快速檢測(cè)方法奠定基礎(chǔ)。