張童桐，司莉南，許紅霞，程文秀，陶瑞鑫，李娟

(南京農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院，江蘇 南京 210095)

質(zhì)量優(yōu)良的卵母細(xì)胞是體外受精(IVF)、體細(xì)胞核移植(SCNT)以及胞漿內(nèi)單精子顯微注射(ICSI)等生物技術(shù)的前提[1]。影響豬卵母細(xì)胞成熟的因素有很多，比如體外成熟環(huán)境、體外成熟液成分、卵母細(xì)胞與卵丘細(xì)胞間的互作及自身的新陳代謝。哺乳動物進(jìn)入發(fā)情周期后，卵母細(xì)胞恢復(fù)減數(shù)分裂并在排卵前經(jīng)過促卵泡激素(FSH)、促黃體生成素(LH)等激素協(xié)同作用完成成熟過程[2]。卵母細(xì)胞成熟包括細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)成熟，只有細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)都成熟的卵母細(xì)胞才具備受精和胚胎發(fā)育的能力[3-4]。細(xì)胞核成熟是卵母細(xì)胞從第一次減數(shù)分裂前期的雙線期的停滯狀態(tài)恢復(fù)并完成第一次減數(shù)分裂，排出第一極體的過程。細(xì)胞質(zhì)成熟則是卵母細(xì)胞完成mRNA和蛋白質(zhì)的積累，細(xì)胞骨架和細(xì)胞器的重組以及細(xì)胞代謝的改變，為卵母細(xì)胞以后的發(fā)育奠定基礎(chǔ)[5-6]。

卵母細(xì)胞的外部環(huán)境對卵母細(xì)胞的成熟及隨后的胚胎發(fā)育都會產(chǎn)生影響[7]。其中能量代謝對于卵母細(xì)胞的成熟是至關(guān)重要的，而葡萄糖是卵母細(xì)胞的關(guān)鍵代謝產(chǎn)物。因此葡萄糖濃度對卵母細(xì)胞成熟，減數(shù)分裂的恢復(fù)，卵丘細(xì)胞的成熟，細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)成熟都十分重要[7]。葡萄糖代謝異常會導(dǎo)致卵母細(xì)胞成熟和發(fā)育能力降低[7]。在卵母細(xì)胞成熟期間，卵泡液中的葡萄糖濃度與血漿中葡萄糖濃度水平相當(dāng)[8-9]，并且葡萄糖濃度與卵巢卵泡大小存在一定正相關(guān)[10]。與代謝物不斷輸入的卵泡環(huán)境相比，靜態(tài)體外成熟(IVM)系統(tǒng)要求培養(yǎng)基含有一定超生理濃度的葡萄糖，以避免消耗至對卵母細(xì)胞發(fā)育有害的水平。例如，通常用于IVM的TCM-199含有5.6 mmol/L葡萄糖。在IVM培養(yǎng)基中提供足夠濃度的葡萄糖可改善卵母細(xì)胞的核成熟和發(fā)育能力[11-12]。但是，葡萄糖濃度過低(小于2.3 mmol/L)或過高(大于10 mmol/L)對卵母細(xì)胞發(fā)育有害。針對糖尿病患者及動物模型的研究揭示，糖代謝異?？梢鹇涯讣?xì)胞核成熟異常，減數(shù)分裂過早恢復(fù)[13]，且會導(dǎo)致胚胎發(fā)育延遲，胚胎發(fā)育潛能降低，胚胎退化和碎片化的發(fā)生率增加[14]。在低葡萄糖濃度環(huán)境中，卵母細(xì)胞糖酵解能力的擾動表現(xiàn)為通過磷酸戊糖途徑(PPP)和己糖糖二磷酸途徑(EMP)的葡萄糖通量下降，從而限制了核酸合成和能量產(chǎn)生的底物[15]。而高濃度葡萄糖的體外成熟環(huán)境會導(dǎo)致牛卵母細(xì)胞氧化應(yīng)激，發(fā)育潛能降低[16]。

隨著人類生活水平的提高，糖尿病患者急劇增加，研究人員常用豬作為可能的異種器官移植來源。因此，探索高濃度葡萄糖對豬卵母細(xì)胞的影響，有助于對人類糖尿病的研究。雖然葡萄糖是卵母細(xì)胞成熟必需的能量來源之一[17]，但在豬卵母細(xì)胞的體外成熟過程中針對高濃度葡萄糖的研究卻較少，故本試驗將針對這一問題做了初步研究。

1 材料與方法

1.1 主要藥品試劑

生理鹽水、抗生素購自南京市的藥店；TCM-199培養(yǎng)基、礦物油、牛血清蛋白(BSA)、透明質(zhì)酸酶(Hya)、杜氏磷酸鹽緩沖液(PBS)、澳洲胎牛血清(FBS)購自Gibco公司；GSH和GSSG檢測試劑盒、MDA檢測試劑盒購自碧云天；葡萄糖購自Sigma公司。

1.2 卵母細(xì)胞采集與挑選

屠宰場母豬選擇初情期前，未配種的大白母豬。在屠宰中取下母豬內(nèi)臟之后，迅速將卵巢剪下用加有硫酸慶大霉素的生理鹽水進(jìn)行清洗，并防止污染產(chǎn)生。采集卵巢時須佩戴無菌乳膠手套，同時保持腹腔臟器干凈清潔。將采集到的卵巢置于38.5 ℃、含雙抗(青霉素、鏈霉素)200 IU/mL(如無特殊標(biāo)注，雙抗均為此濃度)的0.9% NaCl生理鹽水中，用不銹鋼保溫桶(瓶口直徑約7 cm，容積大約1.2 L)無菌運(yùn)回實驗室。通常在2 h以內(nèi)運(yùn)回為最佳時間，由于運(yùn)輸距離較遠(yuǎn)，本實驗室采用大巴車托運(yùn)的方式，在3 h內(nèi)運(yùn)回實驗室。

卵巢無菌送達(dá)實驗室后，用預(yù)熱含雙抗的生理鹽水洗去卵巢表面血跡和雜質(zhì)，放入37 ℃水浴鍋中，保溫待用。采用抽吸法對卵母細(xì)胞進(jìn)行采集。注射器抽取卵泡大小為2～6 mm的卵泡液，于38.5 ℃熱臺上靜置沉淀15 min。吸除上層卵泡液，留下沉淀，加入適量洗卵液(ASP)(TCM-199中加0.8 mmol/LL-谷氨酰胺，2% FBS)稀釋沉淀，分裝于60 mm培養(yǎng)皿中。在體視顯微鏡下，挑選出質(zhì)量良好的具有3層及以上卵丘細(xì)胞的卵丘卵母細(xì)胞復(fù)合體(COCs)，質(zhì)量好的COCs卵胞質(zhì)均勻呈亮灰色，卵丘細(xì)胞分布均勻緊湊，質(zhì)量差的COCs顏色發(fā)暗，卵丘細(xì)胞分布不均或幾乎沒有。

1.3 卵母細(xì)胞體外成熟

將收集得到的COCs經(jīng)IVM清洗后，隨機(jī)分為3組(每組60枚)，分別移入已在CO2培養(yǎng)箱中平衡4 h以上的含有不同濃度葡萄糖的IVM中(每孔60枚)，同時覆蓋400 μL無菌石蠟油。在38.5 ℃、5% CO2及飽和濕度的條件下培養(yǎng)42 h。3個組分別為空白對照組(C)：IVM(TCM-199添加10% FBS、10% 豬卵泡液、0.8 mmol/LL-谷氨酰胺、0.242% 硫酸慶大霉素、15 IU/mL 孕馬血清促性腺激素、15 IU/mL人絨毛膜促性腺激素)中加入正常濃度(5.6 mmol/L)的葡萄糖；高濃度葡萄糖組1(G-1)：IVM中加入葡萄糖濃度為10 mmol/L；高濃度葡萄糖組2(G-2)：IVM中加入葡萄糖濃度為15 mmol/L。

1.4 卵丘擴(kuò)散統(tǒng)計與成熟卵母細(xì)胞挑選

培養(yǎng)42 h后，COCs平鋪于培養(yǎng)皿底部，進(jìn)行拍照并統(tǒng)計。卵丘擴(kuò)散標(biāo)準(zhǔn)參照文獻(xiàn)[18-20]，根據(jù)主觀等級從“ 0”到“ +4”評估擴(kuò)展程度，具體判定標(biāo)準(zhǔn)如下：“ 0”卵丘細(xì)胞無擴(kuò)展；“+1”僅分離卵丘細(xì)胞的最外層；“+2”卵丘細(xì)胞進(jìn)一步擴(kuò)展，涉及卵丘的外半部分；“+3”卵丘細(xì)胞進(jìn)一步擴(kuò)展，但不包括放射冠，“+4”卵丘細(xì)胞完全擴(kuò)展，包括最里面的放射冠。分別對C組、G-1組和G-2組擴(kuò)散程度較好的COCs，即“+3”、“+4”的COCs進(jìn)行統(tǒng)計。之后，將COCs置于400 μL 38.5 ℃ 預(yù)熱Hya (1 mg/mL)中，移液槍經(jīng)反復(fù)吹打使卵母細(xì)胞和卵丘細(xì)胞分離。挑選成功排出第一極體的、質(zhì)量較好的MII期卵母細(xì)胞，并統(tǒng)計各組成熟效率。質(zhì)量好的卵母細(xì)胞胞質(zhì)呈亮灰色，胞質(zhì)均勻，胞質(zhì)與透明帶之間有一條透亮的條帶。

1.5 孤雌激活與胚胎體外培養(yǎng)

挑選的MII期卵母細(xì)胞在F+激活液(0.3 mol/L甘露醇，0.1 mmol/L MgSO4，0.05 mmol/L CaCl2，0.01%聚乙烯醇)的液滴中平衡30 s，待其沉入液滴底部。每次取5枚平衡好的卵母細(xì)胞，放入已添加F+激活液的激活槽中(BTX model 450，電極間距為0.5 cm)，單直流脈沖(0.86 kV/cm,80 μs)激活。電激活后，在孤雌激活液(PCC，胚胎體外培養(yǎng)液PZM3中添加細(xì)胞松弛素B 5 mg/mL)和放線菌酮(CX，1 mg/mL)化學(xué)激活4 h。隨后，將卵母細(xì)胞用PZM-3中清洗3次，移入已于CO2培養(yǎng)箱中平衡了4 h以上的PZM-3中繼續(xù)培養(yǎng)，培養(yǎng)箱的培養(yǎng)條件為38.5 ℃、5% CO2及飽和濕度。分別統(tǒng)計各組2-細(xì)胞、4-細(xì)胞和囊胚的發(fā)育效率。

1.6 卵母細(xì)胞線粒體、ROS熒光染色和胚胎囊胚核熒光染色

1.6.1 卵母細(xì)胞線粒體熒光染色

挑選MII期卵母細(xì)胞，用PBS液清洗3次；各組每次取15枚卵母細(xì)胞，于38.5 ℃培養(yǎng)箱中使用Mito-Tracker(10 μg/mL)活染15 min；PBS清洗3次，每次5 min；多聚甲醛(PFA)中室溫固定30 min；Hoechst 33342(10 μg/mL)室溫避光染核10 min，再次PBS1清洗3次，每次5 min；在載玻片上滴加一滴甘油，將胚胎放入，在蓋玻片四角涂抹羊毛脂，置于甘油正上方進(jìn)行壓片，壓至胚胎略微扁平，制片完成后，用蔡司LSM700共聚焦顯微鏡拍照。

1.6.2 卵母細(xì)胞活性氧(ROS)熒光染色

挑選MII期卵母細(xì)胞，用PBS清洗3次；各組每次取15枚卵母細(xì)胞，置于38.5 ℃培養(yǎng)箱中，使用ROS(10 μg/mL)活染30 min；PB1清洗3次，每次5 min；然后直接在熒光顯微鏡下觀察拍照。

1.6.3 囊胚細(xì)胞核熒光染色

于168 h收集囊胚,進(jìn)行Hoechst染色。細(xì)胞核染色及觀察方法同上。

1.7 卵母細(xì)胞GSH和MDA含量測定

1.7.1 GSH含量測定

各組收集MII期卵母細(xì)胞30枚，PBS清洗后，加入10 μL蛋白試劑去除M溶液，使用液氮和37 ℃水浴鍋進(jìn)行3次快速凍融，4 ℃放置或冰浴放置5 min。4 ℃高速離心機(jī)10 000g離心10 min，取上清暫放-80 ℃冷凍保存，連續(xù)收集3次樣品進(jìn)行測定。按照GSH和GSSG檢測試劑盒操作說明將樣品、標(biāo)準(zhǔn)品和試劑加入96孔板，使用酶標(biāo)儀在412 nm處測定吸光度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算GSH含量。

1.7.2 MDA含量測定

各組收集MII期卵母細(xì)胞30枚，PBS清洗后，10 μL細(xì)胞裂解液(P0013)裂解，裂解后12 000g離心10 min，取上清暫放-80 ℃冷凍保存，連續(xù)收集3次樣品進(jìn)行測定。按照MDA檢測試劑盒操作說明配制好檢測反應(yīng)體系，將檢測反應(yīng)體系工作液按200 μL體系加入到96孔板中，隨后使用酶標(biāo)儀在532 nm測定吸光度。按照標(biāo)準(zhǔn)品吸光度制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算獲得MDA的含量。

1.8 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

用SPSS 20.0軟件one-way ANOVA法進(jìn)行方差分析和顯著性檢驗。每組至少重復(fù)3次，數(shù)據(jù)用“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示。P<0.05，差異顯著；P<0.01，差異極顯著。

2 結(jié)果

2.1 高濃度葡萄糖對卵丘細(xì)胞擴(kuò)散的影響

卵丘細(xì)胞擴(kuò)散是卵母細(xì)胞成熟的標(biāo)志之一。COCs體外成熟42 h后，C組的卵丘細(xì)胞擴(kuò)散效果較好(圖1 A)，而高濃度葡萄糖組的卵丘細(xì)胞擴(kuò)散效果極差(圖1 B、圖1 C)。高濃度葡萄糖組的COCs卵丘擴(kuò)散為3-級、4-級的數(shù)量，極顯著低于C組的數(shù)量(圖1 D)。說明高濃度葡萄糖抑制了卵丘細(xì)胞的擴(kuò)散。

A.空白對照組(C)COCs；B.高濃度葡萄糖組1(G-1)COCs；C.高濃度葡萄糖組2(G-2)COCs；D COCs卵丘擴(kuò)散為3-級、4-級的數(shù)量統(tǒng)計；**表示差異極顯著(P<0.01)。下同圖1 高濃度葡萄糖對卵丘細(xì)胞擴(kuò)散的影響

2.2 高濃度葡萄糖對卵母細(xì)胞成熟的影響

如表1所示，卵母細(xì)胞體外成熟42 h后，高濃度葡萄糖(G-1、G-2)組的死亡率和成活率，與空白對照組(C組)相比均無顯著差異(P>0.05)。此外，與C組相比，G-1組第一極體率顯著下降(P<0.05)，G-2組極體率極顯著下降(P<0.01)。結(jié)果表明，高濃度葡萄糖降低了第一極體的排出率，并且隨著濃度的升高，第一極體的排出率會逐漸降低，但對于卵母細(xì)胞的成活沒有顯著影響。

表1 高濃度葡萄糖對卵母細(xì)胞體外成熟的影響

2.3 高濃度葡萄糖對MII期卵母細(xì)胞線粒體分布的影響

經(jīng)高濃度葡萄糖處理過后，MII期卵母細(xì)胞線粒體分布如圖2所示。在C組中，線粒體均勻分散在胞質(zhì)中，而在G-1、G-2組中，線粒體出現(xiàn)了分布不均的情況。

圖2 高濃度葡萄糖對卵母細(xì)胞線粒體分布的影響

2.4 高濃度葡萄糖對MII期卵母細(xì)胞ROS的影響

G-1、G-2中高濃度葡萄糖體外成熟環(huán)境下的卵母細(xì)胞ROS水平明顯升高(圖3 A、圖3B和圖3C)。熒光強(qiáng)度進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，G-1、G-2的ROS水平極顯著高于C組(圖3 D，P<0.01)。

A.空白對照組(C)；B.高濃度葡萄糖組1(G-1)；C.高濃度葡萄糖組2(G-2)；D.卵母細(xì)胞ROS熒光強(qiáng)度統(tǒng)計圖3 高濃度葡萄糖對卵母細(xì)胞ROS水平的影響

2.5 高濃度葡萄糖對MII期卵母細(xì)胞GSH和MDA含量的影響

與C組相比，G-1組GSH含量顯著降低(P<0.05)，G-2組GSH含量極顯著降低(P<0.01)，見圖4 A。G-1組MDA含量與C組相比，無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05)，但有一定的升高趨勢；G-2組MDA含量比C組顯著升高(P<0.05)，見圖5 B。

A.GSH含量統(tǒng)計；B.MDA含量統(tǒng)計；*表示差異顯著(P<0.05)圖4 高濃度葡萄糖對卵母細(xì)胞GSH和MDA含量的影響

2.6 高濃度葡萄糖對孤雌胚胎發(fā)育的影響

如表2所示，G-1、G-2組比C組胚胎的2-細(xì)胞率顯著降低(P<0.05)，4-細(xì)胞率呈極顯著降低(P<0.01)，囊胚率也呈極顯著降低(P<0.01)。表明高濃度葡萄糖對卵母細(xì)胞存在一定的毒害作用，并且會持續(xù)到胚胎發(fā)育階段。

表2 高濃度葡萄對卵母細(xì)胞孤雌胚胎發(fā)育的影響

如圖5所示，G-1、G-2組的卵母細(xì)胞發(fā)育形成的囊胚，與C組的卵母細(xì)胞發(fā)育形成的囊胚相比，在細(xì)胞數(shù)量上沒有顯著差異(P>0.05)。表明高葡萄糖濃度環(huán)境下的體外成熟雖然會降低胚胎的發(fā)育率，但是對已形成囊胚的發(fā)育沒有顯著的影響。

A.空白對照組(C)囊胚；B.高濃度葡萄糖組1(G-1)囊胚；C.高濃度葡萄糖組2(G-2)囊胚；D.囊胚細(xì)胞數(shù)統(tǒng)計圖5 葡萄糖濃度對卵母細(xì)胞孤雌囊胚細(xì)胞數(shù)的影響

3 討論

試驗結(jié)果表明，高濃度葡萄糖的體外成熟環(huán)境會影響卵母細(xì)胞成熟，對卵丘細(xì)胞的擴(kuò)散也有明顯地不利影響。它不僅引起卵母細(xì)胞內(nèi)線粒體分布發(fā)生變化及ROS水平升高，導(dǎo)致了第一極體的排出減少，而且降低了胚胎的發(fā)育能力。

在卵母細(xì)胞成熟過程中，卵丘細(xì)胞擴(kuò)散是卵母細(xì)胞成熟的關(guān)鍵過程，卵丘細(xì)胞通過縫隙連接對卵母細(xì)胞進(jìn)行營養(yǎng)輸送與廢物代謝，同時卵母細(xì)胞也會通過釋放生長因子促進(jìn)卵丘細(xì)胞的生長，卵丘細(xì)胞和卵母細(xì)胞通過這種互作，來促進(jìn)卵母細(xì)胞的成熟[21]。COCs的縫隙連接是由縫隙連接蛋白組成的一種跨膜結(jié)構(gòu)[22]，而I型糖尿病小鼠中，縫隙連接蛋白的表達(dá)降低，縫隙連接受損，不僅導(dǎo)致卵母細(xì)胞的成熟受到抑制，并且影響卵丘細(xì)胞的生長分化[21]。在豬COCs的成熟中，卵丘細(xì)胞的擴(kuò)散異常會導(dǎo)致卵母細(xì)胞的成熟和發(fā)育能力降低[23]。本試驗結(jié)果也表明，在高葡萄糖濃度環(huán)境下，COCs體外成熟后，卵丘細(xì)胞擴(kuò)散受阻，說明高葡萄糖濃度的成熟環(huán)境可能影響了卵丘細(xì)胞與卵母細(xì)胞之間的正常交流，從而抑制了卵母細(xì)胞的正常成熟。

卵母細(xì)胞的質(zhì)量將會影響早期胚胎的存活，懷孕的建立和維持，胎兒的發(fā)育，甚至成年疾病[24]。豬體外成熟卵母細(xì)胞的細(xì)胞核成熟和細(xì)胞質(zhì)成熟極易不同步[25]，造成卵母細(xì)胞質(zhì)量下降。卵母細(xì)胞在細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)的成熟過程中，對葡萄糖濃度具有一定的依賴性，而且葡萄糖濃度對減數(shù)分裂的恢復(fù)和第一極體的排出有著重要的作用[26-27]。COCs的葡萄糖代謝主要是通過卵丘細(xì)胞進(jìn)行的，卵丘細(xì)胞代謝后產(chǎn)生丙酮酸可被卵母細(xì)胞直接利用，COCs的縫隙連接受損后，丙酮酸向卵母細(xì)胞的輸送受阻，同時導(dǎo)致線粒體的分布不均，引起供能不足，從而影響卵母細(xì)胞成熟[7]。高葡萄糖濃度環(huán)境下會導(dǎo)致葡萄糖代謝的改變，通過葡萄糖代謝途徑磷酸戊糖途徑(PPP)，對卵母細(xì)胞的減數(shù)分裂的恢復(fù)產(chǎn)生影響，PPP途徑代謝增強(qiáng)，導(dǎo)致減數(shù)分裂的過早恢復(fù)，卵母細(xì)胞無法正常成熟，第一極體排出減少；同時糖酵解活性改變，會導(dǎo)致活性氧的增加，造成卵母細(xì)胞損傷[14,16,28]。ROS、MDA水平的增加，表明卵母細(xì)胞本身產(chǎn)生了氧化應(yīng)激，同時抗氧化物GSH的水平顯著降低，容易導(dǎo)致原本的平衡狀態(tài)被打破，一旦超過其本身的處理能力，會導(dǎo)致卵母細(xì)胞的損傷，并且會引起細(xì)胞凋亡。進(jìn)而損害人和牛卵母細(xì)胞發(fā)育能力[16,29]，高葡萄糖濃度環(huán)境會使己糖胺生物合成途徑通量增加，使細(xì)胞分裂和囊胚形成形成能力下降[30]。由于非洲豬瘟影響，卵巢的采集難度增加，采集時間增長，實驗室平均成熟效率與胚胎發(fā)育效率有所下降。因此，本試驗C組的成熟效率與孤雌胚胎的發(fā)育效率，比章美玲等[31]報道的結(jié)果低。雖然在高葡萄糖濃度成熟環(huán)境下，卵母細(xì)胞形成的囊胚細(xì)胞數(shù)與正常成熟環(huán)境下沒有顯著差異，但是其可能會在胚胎植入后產(chǎn)生不良影響，在小鼠中發(fā)現(xiàn)，胚胎植入后停止發(fā)育的概率增加[32]。本試驗進(jìn)一步驗證，高葡萄糖濃度體外成熟環(huán)境，也會對豬卵及其胚胎發(fā)育能力造成損傷。