沈仕俊 ，王巧麗，楊金江，李國(guó)劍，李孟麗，張小麗，甘平

0 引言

肺癌是人類常見的惡性腫瘤之一，發(fā)病率和死亡率分別居惡性腫瘤的第三和第一位，而非小細(xì)胞肺癌（NSCLC）在肺癌中占很大比例，NSCLC在惡性腫瘤中的發(fā)病率和死亡率大約為9.3%和14.6%[1-2]。目前NSCLC的治療主要以手術(shù)、化療、放療、生物治療、免疫治療等綜合治療為主[3]，但結(jié)果卻難以令人滿意，5年生存率僅約為17.4%[4]。

隨著研究的深入，PD-1/PD-L1通路的生物學(xué)活性逐漸被闡明并應(yīng)用于腫瘤領(lǐng)域的治療。但不是所有NSCLC患者的療效都令人滿意，有關(guān)PD-1/PD-L1抑制劑治療實(shí)體瘤的預(yù)測(cè)標(biāo)志物成為研究的熱點(diǎn)。

基因突變致癌已經(jīng)成為整個(gè)腫瘤領(lǐng)域的共識(shí)，此時(shí)在所評(píng)估基因的外顯子編碼區(qū)每兆堿基中發(fā)生置換和插入/缺失突變的總數(shù)即腫瘤突變負(fù)荷（tumor mutation burden,TMB）開始進(jìn)入研究者們的視野。但TMB對(duì)于NSCLC患者選用PD-1/PD-L1抑制劑治療的結(jié)局評(píng)估仍是一個(gè)有爭(zhēng)議的生物標(biāo)志物。因此，我們通過Meta分析比較在高TMB組和低TMB組的NSCLC患者中使用PD-1/PD-L1抑制劑的臨床療效。以期為晚期NSCLC患者使用PD-1/PD-L1抑制劑提供指導(dǎo)。

1 資料與方法

本研究在國(guó)際前瞻性系統(tǒng)綜述注冊(cè)中心（PROSPERO）中注冊(cè)，注冊(cè)號(hào)為CRD42020162264。

1.1 文獻(xiàn)檢索

對(duì)PubMed、Web of Science、Cochrane Library、中國(guó)生物醫(yī)藥數(shù)據(jù)庫(kù)（CBM）、Embase、中國(guó)知網(wǎng)（CNKI）等電子數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行了全面的文獻(xiàn)檢索。檢索時(shí)間均為建庫(kù)至2020年3月25日。檢索詞為：（“Nivolumab” or “Opdivo” or“ONO-4538” or “Tecentriq” or “MPDL-3280A” or“RG-7446” or “Pembrolizumab” or “Keytruda” or“Lambrolizumab” or “MK-3475” or “PEMBRO”or “Durvalumab” or “MEDI-4736” or “Imfinzi” or“Pidilizumab” or “CT-011” or “PD-1” or “PD-L1”or “PD-1/PD-L1” or “programmed cell death 1” or“programmed cell death ligand 1”）and（“tumor mutation burden” or “tumor mutation load” or “TMB”or “TML”） and （“ non-small-cell lung cancer” or“NSCLC”）及對(duì)應(yīng)的中文檢索詞。另手動(dòng)檢索所選文章和評(píng)論的參考文獻(xiàn)，以獲得所有可能相關(guān)的研究。所有檢索文獻(xiàn)不限語(yǔ)種。

1.2 文獻(xiàn)納入、排除標(biāo)準(zhǔn)

納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）經(jīng)病理證實(shí)為NSCLC；（2）臨床試驗(yàn)或隊(duì)列研究采用具有截?cái)嘀档腡MB評(píng)估NSCLC患者經(jīng)PD-1/PD-L1抑制劑（nivolumab、pembrolizumab、atezolizumab、durvalumab、avelumab）治療后的結(jié)局；（3）文章中給出了客觀緩解率/總緩解率（ORR）的比值比（OR），無(wú)進(jìn)展生存期（PFS）或總生存期（OS）的風(fēng)險(xiǎn)比（HR）及其95%CIs，或有足夠的信息提取數(shù)據(jù)；（4）可評(píng)估患者人數(shù)不少于20人。排除標(biāo)準(zhǔn)：非原創(chuàng)性研究（如Meta分析、綜述）、會(huì)議摘要、病例報(bào)告、重復(fù)研究、無(wú)法提取TMB與使用PD-1/PD-L1抑制劑治療NSCLC結(jié)局指標(biāo)關(guān)系數(shù)據(jù)的研究、數(shù)據(jù)不完整或無(wú)法檢索全文的研究。

1.3 數(shù)據(jù)提取

數(shù)據(jù)提取和評(píng)估由兩名研究人員獨(dú)立完成，意見不統(tǒng)一時(shí)通過與第三名研究人員討論解決。提取的數(shù)據(jù)包括：試驗(yàn)名稱/作者、發(fā)表年份、試驗(yàn)階段、治療線、試驗(yàn)藥物、高TMB和低TMB患者人數(shù)和PFS、ORR、OS及95%CI。

1.4 文獻(xiàn)質(zhì)量評(píng)價(jià)

采用New castle-Ottawa Scale（NOS）質(zhì)量評(píng)估量表來評(píng)估納入研究或隊(duì)列的質(zhì)量。根據(jù)總分（0～9分）分為三組：研究質(zhì)量差（0～3分）、中等質(zhì)量（4～6分）和高質(zhì)量（7～9分）。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法及數(shù)據(jù)分析

風(fēng)險(xiǎn)比（HR）及其95%CI來評(píng)價(jià)TMB與PD-1/PD-L1抑制劑治療非小細(xì)胞肺癌PFS、OS的關(guān)系，比值比（OR）及其95%CI用于評(píng)估ORR。若卡方檢驗(yàn)P＜0.1或I2＞50%則認(rèn)為有異質(zhì)性。假如觀察到異質(zhì)性，利用隨機(jī)效應(yīng)模型來減少異質(zhì)性對(duì)結(jié)果的影響，反之使用固定效應(yīng)模型。Egger’s和Begg’s檢驗(yàn)用于評(píng)估發(fā)表偏倚。RevMan5.3和STATA15.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果

2.1 文獻(xiàn)檢索和篩選結(jié)果

從PubMed、Embase和Cochrane Library、CNKI、中國(guó)生物醫(yī)學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)（Chinese Biomedical Literature Database,CBM）和萬(wàn)方數(shù)據(jù)庫(kù)檢索了676條記錄。排除了93項(xiàng)重復(fù)研究。篩選標(biāo)題和摘要后，495項(xiàng)研究被排除。剩下的88篇文章通過閱讀全文，共有1209例患者的11篇文獻(xiàn)（12項(xiàng)隊(duì)列研究）被納入[5-15]，見圖1。

2.2 入選文獻(xiàn)基本情況與質(zhì)量評(píng)估

本研究納入文獻(xiàn)的主要特征和每個(gè)研究的截?cái)嘀?，見?。納入研究的質(zhì)量通過NOS進(jìn)行評(píng)估，見表2。其中10項(xiàng)研究質(zhì)量較高，其余研究評(píng)價(jià)為中等質(zhì)量，確保了納入研究的相對(duì)質(zhì)量較高，增強(qiáng)了Meta分析的可靠性。

2.3 根據(jù)TMB水平判斷PD-1/PD-L1抑制效果

本研究結(jié)果顯示，高TMB顯著提高PD-1/PD-L1抑制劑治療的NSCLC患者的PFS，卻降低ORR。共12項(xiàng)研究報(bào)道了TMB與PFS的關(guān)系，高TMB組PFS明顯優(yōu)于低TMB組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（HR=0.54,95%CI:0.42～0.70;P＜0.001），見圖2；共5項(xiàng)研究637例患者評(píng)估了經(jīng)PD-1/PD-L1抑制劑治療的NSCLC患者中TMB與OS的關(guān)系，高TMB組與低TMB組OS比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（HR=0.68,95%CI:0.40～1.19,P=0.18），見圖3；有5項(xiàng)研究332例患者評(píng)估了經(jīng)PD-1/PD-L1抑制劑治療的NSCLC患者中TMB與ORR的相關(guān)性，高TMB患者的ORR明顯低于低TMB患者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（HR=4.41,95%CI:2.54,7.63;P＜0.001），見圖4。PFS（I2=66%,P＜0.00001）和OS（I2=71%,P=0.18）分析中觀察到異質(zhì)性，故采用隨機(jī)效應(yīng)模型，而關(guān)于ORR（I2=0,P＜0.00001）的分析中無(wú)異質(zhì)性，則采用固定效應(yīng)模型。

2.4 發(fā)表偏倚

本研究通過分析Egger’s檢驗(yàn)、Begg’s漏斗圖對(duì)文獻(xiàn)的發(fā)表性偏倚進(jìn)行評(píng)估。TMB與PFS、OS、ORR相關(guān)性Begg’s漏斗圖基本對(duì)稱，分別見圖5A～C，Egger’s檢驗(yàn)P值分別為0.305、0.703、0.823，表明對(duì)此項(xiàng)內(nèi)容研究的相關(guān)文獻(xiàn)未出現(xiàn)發(fā)表性偏倚。

圖1 文獻(xiàn)檢索及篩選流程圖Figure 1 Flow diagram of literature retrieval and screening

2.5 敏感度分析和亞組分析

通過敏感度分析發(fā)現(xiàn)異質(zhì)性主要來自于Chae[5]和Rizvi等[11]。去除這兩篇文獻(xiàn)后，I2下降到45%，P值異質(zhì)性增加到0.06，HR=0.54（95%CI0.46,0.62）。對(duì)TMB測(cè)序方法和患者來自地區(qū)進(jìn)行亞組分析，結(jié)果顯示TMB測(cè)序方法和地域在治療NSCLC的PFS方面無(wú)顯著相關(guān)性。對(duì)PD-1/PD-L1抑制劑治療或聯(lián)合其他治療進(jìn)行亞組分析，與高TMB組相比，PD-1/PD-L1抑制劑聯(lián)合其他治療組顯示了OS的優(yōu)勢(shì)（HR=0.46,95%CI:0.29,0.72,P＜0.01）。NSCLC中PD-1/PD-L1抑制劑治療TMB相關(guān)性亞組分析結(jié)果，見表3。

表1 納入研究基本特征Table 1 Characteristics of included studies

表2 12項(xiàng)研究的NOS評(píng)分Table 2 Scores of 12 cohort studies according to Newcastle-Ottawa Scale (NOS)

圖2 TMB與PFS的相關(guān)性森林圖Figure 2 Forest plot of association between TMB and PFS

3 討論

有研究表明，在沒有使用PD-1/PD-L1抑制劑的情況下，高TMB患者的生存率更差，充分說明PD-1/PD-L1抑制劑對(duì)于提高生存率和克服預(yù)后不良特點(diǎn)的臨床價(jià)值[11]。此外，一些研究表明，在多種癌癥中TMB水平在NSCLC中幾乎最高，并且TMB正在成為預(yù)測(cè)PD-1/PD-L1抑制治療的潛在生物標(biāo)志物[16-17]。本結(jié)果表明高TMB與免疫治療的PFS正相關(guān)，但與ORR負(fù)相關(guān)。筆者認(rèn)為出現(xiàn)這種情況可能提示TMB確實(shí)與免疫治療的療效相關(guān)，并且在部分患者中的療效十分好，但并非所有TMB高的患者都可以從中獲益。此外，符合條件的生物標(biāo)志物如程序性細(xì)胞死亡配體1（PD-L1）的表達(dá)[18]、腫瘤浸潤(rùn)淋巴細(xì)胞（TILs）[19]、致癌驅(qū)動(dòng)突變[20]、錯(cuò)配修復(fù)缺陷（dMMR）[21]和微衛(wèi)星不穩(wěn)定（MSI）[22]與PD-1/PD-L1抑制劑治療NSCLC療效的研究越來越明確，如果能將TMB與這些生物標(biāo)志物結(jié)合可能會(huì)更加精確的篩選出真正能從PD-1/PD-L1抑制劑中獲益的NSCLC患者。

圖3 TMB與OS的相關(guān)性森林圖Figure 3 Forest plot of association between TMB and OS

圖4 TMB與ORR的相關(guān)性森林圖Figure 4 Forest plot of association between TMB and ORR

圖5 TMB與PFS(A)、OS(B)、ORR(C)的相關(guān)性Begg's漏斗圖Figure 5 Funnel plot of association between TMB and PFS(A),OS(B),ORR(C)

TMB是指腫瘤細(xì)胞基因組中，所評(píng)估基因的外顯子編碼區(qū)每兆堿基中發(fā)生置換和插入/缺失突變的總數(shù)[23]。一方面驅(qū)動(dòng)基因突變可以導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生；另一方面大量的細(xì)胞突變可以產(chǎn)生新抗原，這些新抗原可以激活CD8+的細(xì)胞毒性T細(xì)胞，從而發(fā)揮T細(xì)胞介導(dǎo)的抗腫瘤效應(yīng)[24]。因此，當(dāng)基因變異數(shù)目累積增多時(shí)，會(huì)產(chǎn)生更多的新抗原，進(jìn)而被免疫系統(tǒng)識(shí)別的可能性越大。而PD-1/PD-L1通路被激活后，可抑制T淋巴細(xì)胞增殖和抑制T細(xì)胞的免疫功能[25]。所以很多學(xué)者認(rèn)為TMB也許能預(yù)測(cè)PD-1/PD-L1抑制劑的臨床療效并進(jìn)行了大量研究。

本研究在合并PFS和OS中存在顯著異質(zhì)性，通過亞組分析發(fā)現(xiàn)顯著的異質(zhì)性集中在靶向NGS組。TMB預(yù)測(cè)PD-1/PD-L1抑制劑治療效果的最佳截?cái)嘀岛蜋z測(cè)模式有待進(jìn)一步研究。Goodman等[26]報(bào)告了將TMB分為三層的策略：低（1～5 mut/Mb）、中（6～19 mut/Mb）和高（≥20 mut/Mb）。在臨床實(shí)踐中，將TMB的高表達(dá)和低表達(dá)劃分為界限似乎更有意義。大多數(shù)研究[6-7,9-10,12,14]大約有10 mut/Mb或150個(gè)突變，這似乎在非小細(xì)胞肺癌中具有相對(duì)穩(wěn)定的預(yù)測(cè)價(jià)值。實(shí)際上，由于在不同的檢測(cè)方式下TMB的變化很大，可能沒有一個(gè)通用的TMB截?cái)嘀的軕?yīng)對(duì)不同的檢測(cè)方式[27-28]。目前還不能將WES作為檢查PD-1/PD-L1抑制劑治療反應(yīng)的預(yù)測(cè)因子，主要是因?yàn)殡y度大、成本高、耗時(shí)長(zhǎng)，在日常臨床實(shí)踐中有一定的局限性[29]。相比之下，使用靶向性NGS檢測(cè)法比WES更方便、更經(jīng)濟(jì)[17,30-31]。有研究表明，在基因組覆蓋率為0.5 Mb的面板中，靶向NGS測(cè)定的TMB的準(zhǔn)確性有所下降[17]，而靶向NGS和WES檢測(cè)法量化的TMB需要大量的腫瘤組織標(biāo)本，不僅是侵襲性創(chuàng)傷，而且部分患者的腫瘤太小無(wú)法獲得標(biāo)本。一種省時(shí)又方便的經(jīng)血液檢測(cè)TMB方法被報(bào)道[32]。此外，一些關(guān)于實(shí)體腫瘤TMB評(píng)估的臨床試驗(yàn)正在進(jìn)行，這些試驗(yàn)有望提供更多高質(zhì)量的結(jié)果，幫助我們確定合適的TMB截?cái)嘀岛蜋z測(cè)模式[33-34]。

表3 TMB對(duì)PD-1/PD-L1抑制劑治療非小細(xì)胞肺癌療效預(yù)測(cè)的亞組分析Table 3 Subgroup analysis about predictye value of TMB for PD-1/PD-L1 inhibitors treatment on non-small cell lung cancer

本研究以O(shè)RR、PFS和OS作為終點(diǎn)，評(píng)估PD-1/PD-L1抑制劑治療的短期和長(zhǎng)期效益，使其更加全面和有說服力。其次，本研究從不同面進(jìn)行亞組分析，發(fā)現(xiàn)與高TMB組相比，PD-1/PD-L1抑制劑聯(lián)合其他治療組顯示了OS的優(yōu)勢(shì)，并通過TMB檢測(cè)方法的亞組分析發(fā)現(xiàn)了大部分異質(zhì)性的來源。靈敏度分析表明我們的結(jié)果具有良好的穩(wěn)定性。

本研究也存在一些局限性，首先，納入研究的樣本量存在差異，導(dǎo)致不同亞組間樣本量差異較大，樣本量較小的研究可能是Meta分析發(fā)表偏倚的主要來源。加之，一些重要的臨床特征，如生活方式[35]、年齡和性別[36-37]等已被報(bào)道是影響PD-1/PD-L1抑制劑治療效果的重要因素，由于數(shù)據(jù)不足而被忽視。Conforti等[36]報(bào)道了男性使用這些PD-1/PD-L1抑制劑治療比女性有更大的治療效果。Wallis等[37]最近更新的一項(xiàng)較早的薈萃分析顯示，PD-1/PD-L1抑制劑治療的療效沒有性別差異。

有研究有報(bào)道稱TMB可以獨(dú)立預(yù)測(cè)PD-1/PD-L1抑制劑的療效[16,38]，本結(jié)果提示這一觀點(diǎn)有待進(jìn)一步研究。本薈萃分析中，大多數(shù)研究中招募的患者都來自西方，這些研究顯示高TMB和免疫治療效果的提高之間有很強(qiáng)的相關(guān)性。在亞洲和其他地區(qū)需要更多的平行研究，但在探討抗PD-1/PD-L1抑制劑聯(lián)合抗CTLA-4治療或化療等聯(lián)合治療還需進(jìn)一步證實(shí)上述結(jié)果，還需在生活方式、年齡、性別等方面進(jìn)行更多研究分析。

綜上所述，高TMB可以預(yù)測(cè)PD-1/PD-L1抑制劑治療非小細(xì)胞肺癌PFS的提高，但其對(duì)OS、ORR及長(zhǎng)期生存的預(yù)測(cè)價(jià)值尚需進(jìn)一步研究，需要更多大樣本量和標(biāo)準(zhǔn)化設(shè)計(jì)的研究來進(jìn)一步探討TMB在某些亞組中的預(yù)測(cè)價(jià)值。其次，尋找最佳截?cái)嘀岛蜋z測(cè)方式迫切需要解決。此外，將TMB與符合條件的生物標(biāo)志物結(jié)合可能會(huì)擴(kuò)大受益于免疫檢查點(diǎn)抑制劑患者的選擇。