閆鵬宇，閆旭韜，楊勇軍綜述，楊曉峰審校

0 引言

膀胱癌（bladder cancer,BC）是中國(guó)泌尿生殖系統(tǒng)常見的惡性腫瘤之一[1]，約75%新診斷的BC為非肌層浸潤(rùn)性膀胱癌（non-muscle invasive bladder cancer,NMIBC），局限于膀胱壁黏膜或黏膜下層，主要治療手段為經(jīng)尿道膀胱腫瘤切除術(shù)（transurethral resection of the bladder tumor,TURBT）聯(lián)合膀胱內(nèi)灌注化療藥物。但TURBT術(shù)后1年腫瘤復(fù)發(fā)率為40%～80%，25%的患者進(jìn)展為肌層浸潤(rùn)性膀胱癌（muscle invasive bladder cancer,MIBC）[2]。目前普通白光膀胱鏡檢查是BC診斷和術(shù)后隨訪的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)手段，其對(duì)微小腫瘤、原位癌、術(shù)中殘留腫瘤的識(shí)別能力有限，導(dǎo)致腫瘤的漏診，而常規(guī)膀胱內(nèi)灌注藥物的不良反應(yīng)嚴(yán)重影響患者術(shù)后生活質(zhì)量[3]。因此，如何精準(zhǔn)地發(fā)現(xiàn)病灶及界定腫瘤的邊界、既能徹底切除腫瘤又能減少正常組織細(xì)胞的損傷成為了BC臨床診療亟需解決的問(wèn)題。

隨著B C 靶向分子載體、靶向特異性作用機(jī)制、靶向光學(xué)分子影像和靶向光免疫療法（photoimmunotherapy,PIT）研究的不斷深入，BC的靶向診療有望取得新的進(jìn)展。為此，本文結(jié)合國(guó)內(nèi)外最新文獻(xiàn)及本研究組的前期工作，將已發(fā)現(xiàn)的BC靶向分子載體的研究現(xiàn)狀綜述如下。

1 靶向基團(tuán)的種類及特性

靶向分子載體是指能夠特異識(shí)別抗原蛋白并與之緊密結(jié)合的靶向基團(tuán)，主要包括抗體、抗體片段、支架蛋白、肽和小分子等，見表1[4]?？贵w與抗原特異性結(jié)合以及成熟的抗體制備技術(shù)，使其成為臨床應(yīng)用最多的一類靶向基團(tuán)，但單克隆抗體分子量較大（約150 kDa）、腎臟不能排泄、體內(nèi)主要通過(guò)肝臟分解代謝，導(dǎo)致抗體具有血液內(nèi)循環(huán)時(shí)間長(zhǎng)、非特異性組織蓄積和組織穿透能力差等缺點(diǎn)[5-6]。而采用化學(xué)技術(shù)制備的抗體片段（微抗體、抗原結(jié)合片段、雙抗體、單鏈可變片段等），分子量約為15～80 kDa，既保留了完整抗體特異性結(jié)合抗原的生物學(xué)特性，又具有組織滲透性強(qiáng)和血液滯留時(shí)間短的優(yōu)點(diǎn)[7]。

另外，最新關(guān)注的靶向基團(tuán)還有非免疫球蛋白類支架蛋白（scaffolds protein），如親和體、結(jié)蛋白和Centyrin等[8-10]，這些蛋白支架既有類似抗體的靶向功能，又具有相對(duì)分子量小、高親和力、折疊速率快、理化性能穩(wěn)定、能接受化學(xué)修飾等優(yōu)點(diǎn)。

此外，肽類和小分子的分子量最小，能與腫瘤特異性結(jié)合，而不與或很少與正常組織、細(xì)胞結(jié)合的小分子肽被稱為腫瘤導(dǎo)向肽（tumor homing peptide,THP）。THP為基礎(chǔ)的載體系統(tǒng)能夠有效穿透組織且?guī)缀鯚o(wú)免疫原性，其半衰期短、腎清除率快、組織蓄積少以及生產(chǎn)工藝便捷、成本更低等優(yōu)勢(shì)[11]，具有良好的應(yīng)用前景。

2 膀胱癌靶向分子載體

2.1 抗體及其衍生物

CD47是一種普遍存在于人類細(xì)胞膜表面的跨膜糖蛋白，與巨噬細(xì)胞表面的信號(hào)調(diào)節(jié)蛋白α結(jié)合后能抑制其吞噬功能使腫瘤產(chǎn)生免疫逃逸[12]。CD47在80%以上的BC細(xì)胞膜上高表達(dá)，包括乳頭狀尿路上皮癌、鱗狀細(xì)胞癌、微乳頭狀瘤及腺癌[13]。本項(xiàng)目組使用Alexa Fluor 790標(biāo)記的抗-CD47孵育26例新鮮離體人BC組織進(jìn)行近紅外熒光成像，腫瘤組織的平均熒光強(qiáng)度明顯高于臨近正常組織（分別為132.31±6.67和52.27±12.09,P＜0.001），見圖1[14]。Pan等[13]評(píng)價(jià)了抗-CD47-Qdot625介導(dǎo)的內(nèi)鏡分子成像檢測(cè)BC的診斷準(zhǔn)確性，21例新鮮完整膀胱標(biāo)本經(jīng)抗-CD47-Qdot625孵育后，在藍(lán)光下檢測(cè)到119個(gè)可疑區(qū)域，通過(guò)病理學(xué)驗(yàn)證，其診斷敏感度和特異性分別為82.9%和90.5%。

CAⅨ是碳酸酐酶家族中的一員，在缺氧條件下調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)pH值，進(jìn)而改變腫瘤細(xì)胞的黏附、增殖和進(jìn)展的生物學(xué)特性[15]。免疫組織化學(xué)染色顯示CAⅨ在BC組織中的陽(yáng)性率高達(dá)67.1%，在正常的尿路上皮和膀胱慢性炎性病變組織中均呈陰性（P＜0.01）[16]。Wang等[17]在8例新鮮完整膀胱標(biāo)本內(nèi)灌注抗-CAⅨ-Qdot625，白光膀胱鏡診斷BC的敏感度為76.0%，特異性為90.5%，而抗-CAⅨ介導(dǎo)的藍(lán)光內(nèi)鏡分子成像下的腫瘤檢測(cè)獲得了較高的診斷準(zhǔn)確率，總體敏感度和特異性分別為88.00%和93.75%。

PIT是一種新型的分子靶向光動(dòng)力治療模式，親水性酞菁染料IR700與單克隆抗體結(jié)合進(jìn)行的靶向性PIT，有效減少了單純IR700光動(dòng)力療法的不良反應(yīng)[18]。Kiss等[19]研究發(fā)現(xiàn)，抗-CD47-IR700介導(dǎo)的PIT治療，IR700使用劑量低，但顯著增加了人膀胱腫瘤細(xì)胞系和原代膀胱腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞毒作用。通過(guò)尾靜脈注射抗-CD47-IR700對(duì)BC異種移植小鼠模型進(jìn)行近紅外光免疫治療（NIRPIT），單次治療發(fā)現(xiàn)NIR-PIT組腫瘤生長(zhǎng)明顯減慢，在連續(xù)5周的治療后，NIR-PIT能夠有效抑制腫瘤生長(zhǎng)（P=0.0104），明顯延長(zhǎng)治療組小鼠的生存期（P=0.009）[20]。

表1 靶向基團(tuán)的種類及特征[4]Table 1 Types and characteristics of targeting groups[4]

圖1 膀胱癌組織圖像Figure 1 Images of bladder cancer tissues

單鏈可變片段（single-chain variable fragment,scFv）是抗體內(nèi)部結(jié)合抗原的最小功能結(jié)構(gòu)域，Rezaei等[20]開發(fā)了新型抗-CD47-scFv磁性納米粒子（magnetic nanoparticles,MNP），體外研究表明抗-CD47-scFv-MNP對(duì)BC細(xì)胞系EJ138和5637具有高親和力，經(jīng)外磁場(chǎng)作用的靶向熱療后能顯著降低腫瘤細(xì)胞存活率。

2.2 腫瘤導(dǎo)向肽（THP）

目前，利用噬菌體展示肽庫(kù)技術(shù)和組合化學(xué)方法，先后篩選出四種與BC結(jié)合的靶向配體，分別是九肽序列Bld-1[21]、環(huán)九肽序列PLZ4[22]、環(huán)七肽序列NYZL1[23]和PLSWT7[24]。其中前兩種篩選自MIBC細(xì)胞系，后兩種則來(lái)自NMIBC細(xì)胞系。研究顯示，四種THP均能在離體細(xì)胞、組織和小鼠體內(nèi)與BC特異性結(jié)合，但它們結(jié)合腫瘤細(xì)胞的分子位點(diǎn)目前還不清楚[21-24]。

PLSWT7是目前唯一運(yùn)用于內(nèi)鏡下分子成像的多肽載體。Peng等[24]將PLSWT7-IRDye800CW分子探針灌注入8例離體人膀胱腔內(nèi)，分析了40個(gè)膀胱內(nèi)感興趣區(qū)域，進(jìn)行了近紅外分子成像診斷與組織病理學(xué)比較研究，發(fā)現(xiàn)PLSWT7-IRDye800CW分子影像診斷BC的敏感度和特異性分別為84.00%和86.70%。

常規(guī)尿液脫落細(xì)胞檢查是一種簡(jiǎn)單易行的非侵入性診斷方法，但檢測(cè)的敏感度較低。Jia等[25]使用Bld-1-FITC探針結(jié)合80例血尿患者尿液中的腫瘤細(xì)胞，其診斷BC的敏感度和特異性分別為79.31%和100%，優(yōu)于尿脫落細(xì)胞學(xué)檢查和熒光原位雜交技術(shù)檢查（敏感度分別為20.69%和72.41%）。另外一項(xiàng)包含66例BC的研究發(fā)現(xiàn)，NYZL1-FITC探針與尿液中腫瘤細(xì)胞的結(jié)合與腫瘤惡性程度成正比，平均陽(yáng)性結(jié)合百分比在Ta、T1、T2和T3～T4期分別為30%、57%、73%和85%[26]。

在靶向化療方面，Bld-1能夠與凋亡肽KLA和阿霉素（DOX）構(gòu)建靶向制劑，并內(nèi)化進(jìn)入人膀胱癌HT1376細(xì)胞[27-28]。Jung等[27]評(píng)價(jià)了Bld-1-KLA在小鼠體內(nèi)的治療效能，靜脈注射給藥4周后，Bld-1-KLA組小鼠的腫瘤體積明顯小于對(duì)照組（P＜0.001）。Wei等[28]使用Bld-1-DOX治療荷瘤小鼠16天后，Bld-1-DOX組的腫瘤體積明顯縮小，且小鼠無(wú)明顯不良反應(yīng)，而單用DOX治療組出現(xiàn)明顯的心臟和肝臟損害。Lin等[29]開發(fā)了PLZ4靶向納米膠束，在靶向遞送方面的效率是非靶向膠束的1.5倍（P＜0.05）且是游離染料的14.3倍（P＜0.01），靶向膠束不僅能黏附在腫瘤細(xì)胞表面，還能被靶細(xì)胞攝取。使用PLZ4納米膠束介導(dǎo)的紫杉醇（PTX）進(jìn)行靶向化療，成功將荷瘤小鼠的中位存活期從單純紫杉醇治療組的55天提高到了靶向治療組的69.5天（P=0.03）[30]。

術(shù)中光學(xué)分子影像引導(dǎo)的外科手術(shù)被認(rèn)為是繼開放手術(shù)、微創(chuàng)外科手術(shù)之后的第三代外科手術(shù)新模式。傳統(tǒng)的依據(jù)白光內(nèi)窺鏡圖像和操作者的經(jīng)驗(yàn)確定腫瘤浸潤(rùn)深度和手術(shù)切緣的方式具有主觀性。一項(xiàng)涉及8490例經(jīng)TURBT治療BC患者的系統(tǒng)回顧顯示，17%～67%的初發(fā)Ta期患者和20%～71%的初發(fā)T1期患者在復(fù)發(fā)時(shí)發(fā)現(xiàn)了殘留腫瘤，36%～86%殘留腫瘤位于初次切除部位[3]。Peng[24]等采用PLSWT7-IRDye800CW進(jìn)行了分子成像引導(dǎo)BC手術(shù)治療的臨床前研究，將小鼠異種移植模型隨機(jī)分為兩組：對(duì)照組（n=20）和實(shí)驗(yàn)組（n=20）分別在自然光和光學(xué)分子成像下進(jìn)行腫瘤切除術(shù)。1周后，對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組腫瘤復(fù)發(fā)率分別為95%和5%；術(shù)后30天兩組的總存活率分別為0和90%。

3 膀胱癌的多載體靶向和多模態(tài)診療

BC具有較強(qiáng)的異質(zhì)性，單純的一種靶向分子載體很難使全部患者受益，使用抗-CD47、抗-CAⅨ和無(wú)靶向性IgG4三種單抗對(duì)離體BC組織進(jìn)行多路復(fù)合分子成像發(fā)現(xiàn)，診斷圖像較單靶點(diǎn)成像噪聲更低，分辨率更加精準(zhǔn)（ROC AUC為0.93（0.73,1.0））[31]。多模態(tài)分子探針能集成多種成像和（或）治療模式，Lin等[32]開發(fā)的PLZ4-納米卟啉平臺(tái)，在進(jìn)行BC光動(dòng)力學(xué)診斷的同時(shí)實(shí)現(xiàn)BC的靶向光動(dòng)力學(xué)治療、靶向光熱治療和靶向化療結(jié)合的三模態(tài)治療，顯著提升BC的臨床診斷水平和治療水平。

4 展望與挑戰(zhàn)

綜上所述，靶向分子載體介導(dǎo)的靶向性定位功能在膀胱癌早期診斷、完整切除、靶向治療等方面具有巨大的應(yīng)用潛力，但仍有許多科學(xué)問(wèn)題和技術(shù)難點(diǎn)需要解決，比如靶向載體、連接體、熒光染料等的安全性驗(yàn)證，臨床有效性的標(biāo)準(zhǔn)化評(píng)價(jià)體系的建立等，需要臨床醫(yī)生、化學(xué)家、物理學(xué)家、藥理學(xué)家和工程師之間的多學(xué)科交叉協(xié)作。