張俊 劉彩林 卜戰(zhàn)云

1駐馬店市中心醫(yī)院檢驗(yàn)科 463000；2鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科 450052；3鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院眼科 450052

視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤(retinoblastoma，RB)是臨床上常見(jiàn)的眼內(nèi)原發(fā)性惡性腫瘤，嚴(yán)重威脅患者生命，早期發(fā)現(xiàn)并及時(shí)治療可提高患者生存率。RB的發(fā)病機(jī)制尚未完全闡明，但研究發(fā)現(xiàn)長(zhǎng)鏈非編碼RNA(long noncoding RNA，lncRNA)、微小RNA(microRNA，miRNA)表達(dá)變化與RB的發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)，如miR-25-3p和miR-494通過(guò)調(diào)控PI3K/AKT信號(hào)通路促進(jìn)RB的進(jìn)展[1-2]，miR-144可作為RB診斷的標(biāo)志物[3]，miR-129-5p、miR-936和miR-598通過(guò)減弱PI3K/Akt通路的作用來(lái)抑制RB細(xì)胞的生物學(xué)行為[4-6]，沉默lncRNA ANRIL可通過(guò)調(diào)控miR-99a來(lái)抑制RB細(xì)胞增生[7]，miR-184可增強(qiáng)RB對(duì)化學(xué)療法的敏感性[8]，miR-214-3p通過(guò)靶向ABCB1和XIAP來(lái)調(diào)控RB細(xì)胞凋亡[9]，此外miR-188-5p、miR-218-5p和miR-218-5p也參與RB細(xì)胞的凋亡過(guò)程[10-12]。lncRNA在RB中表達(dá)異常，可能參與細(xì)胞增生、遷移等生物學(xué)行為變化過(guò)程。研究表明，在RB中l(wèi)nc00152、lncRNA MALAT1和lncRNA TP73-AS1表達(dá)上調(diào)，可促進(jìn)細(xì)胞增生、遷移及侵襲[13-15]。lncRNA ADPGK-AS1在胰腺癌組織中的表達(dá)水平升高，并通過(guò)激活鋅指E-盒結(jié)合同源異形盒-1促進(jìn)胰腺癌進(jìn)展[16]。靶基因預(yù)測(cè)顯示，二磷酸腺苷依賴的葡萄糖激酶反義RNA1(adenosine diphosphate-dependent glucokinase antisense RNA 1，ADPGK-AS1)與miR-623存在結(jié)合位點(diǎn)，miR-623在胰腺癌中表達(dá)水平降低，并可通過(guò)抑制基質(zhì)金屬蛋白酶1(matrix metalloproteinase 1，MMP1)的表達(dá)而抑制胰腺癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移[17]，推測(cè)ADPGK-AS1與miR-623的結(jié)合對(duì)RB也可發(fā)揮類似的作用，但其具體分子機(jī)制尚未闡明。本研究探討ADPGK-AS1對(duì)RB細(xì)胞生物學(xué)行為的調(diào)控作用及其機(jī)制，以期為RB的治療提供新的靶點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1RB組織標(biāo)本收集及Y-79細(xì)胞來(lái)源 收集2017年2月至2018年11月在駐馬店市中心醫(yī)院和鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院接受RB手術(shù)的39例39眼患者的術(shù)中瘤體組織及瘤旁組織標(biāo)本，其中男20例，女19例；年齡3～10歲，平均(6.35±2.35)歲。所有患者術(shù)中切除的眼內(nèi)腫瘤組織標(biāo)本經(jīng)組織病理學(xué)檢查證實(shí)為RB，將標(biāo)本置于液氮中迅速冷凍，并轉(zhuǎn)入-80 ℃超低溫冰箱內(nèi)保存。本研究經(jīng)鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)審批(批文號(hào)：2017-KY-73)并遵循《赫爾辛基宣言》，所有患者監(jiān)護(hù)人了解本研究方法及其標(biāo)本再使用目的并自愿簽署知情同意書(shū)。人RB細(xì)胞株Y-79細(xì)胞購(gòu)自上海中喬新舟生物科技有限公司。

1.1.2主要試劑及儀器 DMEM培養(yǎng)液(杭州吉諾生物醫(yī)藥技術(shù)有限公司)；Lipofectamine2000(北京賽因百奧生物技術(shù)有限公司)；小干擾RNA正常對(duì)照(small interfering RNA-normal control，siRNA-NC)、siRNA-ADPGK-AS1、微小RNA正常對(duì)照(microRNA-normal control，miR-NC)、miR-623擬似物(miR-623 mimics)、anti-miR-NC、anti-miR-623(廣州銳博生物科技有限公司)；Trizol試劑(美國(guó)Invitrogen公司)；cDNA合成與實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑(美國(guó)Thermo Fisher公司)；MTT試劑(上海歌凡生物科技有限公司)；兔抗人Ki-67一抗(9449)、兔抗人MMP-2一抗(40994)、兔抗人MMP-9一抗(13667)(美國(guó)CST公司)；辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔IgG二抗(ab172730)(美國(guó)Abcam公司)。Transwell小室(南京迅貝生物科技有限公司)；Matrigel基質(zhì)膠(上海偉進(jìn)生物科技有限公司)；ABI 7500型熒光定量RCR儀(美國(guó)ABI公司)。

1.2 方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)及分組 將Y-79細(xì)胞接種于96孔板，細(xì)胞密度為2.5×105個(gè)/ml,100 μl/孔，細(xì)胞培養(yǎng)24 h。待細(xì)胞培養(yǎng)至80%融合，按照實(shí)驗(yàn)?zāi)康姆謩e將細(xì)胞分為siRNA-NC組、siRNA-ADPGK-AS1組、miR-NC組、miR-623組、siRNA-ADPGK-AS1+anti-miR-NC組和siRNA-ADPGK-AS1+anti-miR-623組，依據(jù)分組方法分別將相應(yīng)質(zhì)粒各10 μl加入培養(yǎng)基以轉(zhuǎn)染Y-79細(xì)胞，將培養(yǎng)基更換為含體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清的正常培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)48 h。

1.2.2qRT-PCR法測(cè)定細(xì)胞中ADPGK-AS1和miR-623相對(duì)表達(dá)量 分別提取瘤旁組織、RB組織及各組Y-79細(xì)胞總RNA，檢測(cè)RNA濃度，將總RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，以cDNA為模板進(jìn)行熒光定量PCR反應(yīng)。ADPGK-AS1正向引物為5’-GCCGATGTCGACACAAGCG-3’，反向引物為5’-AGCAAATGTGTTCCCATCCCT-3’；miR-623正向引物為5’-GCCGAGTGGGTTGTCGGGGACG-3’，反向引物為5’-CAGTGCGTGTGTCGTGGAGT-3’；U6正向引物為5’-ATTGGAACGATACAGAGAAGATT-3’，反向引物為5’-GGAACGCTTCACGAATTTG-3’；磷酸甘油醛脫氫酶(glyceraldehyde phosphate dehydrogenase，GAPDH)正向引物為5’-AACGGATTTGGTCGTATTG-3’，反向引物為5’-GGAAGATGGTGATGGGATT-3’。反應(yīng)體系：10倍PCR緩沖液2.5 μl，MgSO42.5 μl，dNTPs 2.5 μl，正反向引物各0.5 μl，cDNA 2.0 μl，RNase-Free ddH2O補(bǔ)足體系至25.0 μl。反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)反應(yīng)2 min；95 ℃反應(yīng)30 s，59 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共36次循環(huán)。ADPGK-AS1測(cè)定以GAPDH為內(nèi)參，miR-623測(cè)定以U6為內(nèi)參。采用2-△△Ct法檢測(cè)ADPGK-AS1和miR-623相對(duì)表達(dá)量。

1.2.3MTT法評(píng)估各組細(xì)胞活力 將各組Y-79細(xì)胞接種于96孔板，細(xì)胞密度為2.5×105個(gè)/ml,100 μl/孔，細(xì)胞培養(yǎng)24 h。待細(xì)胞培養(yǎng)至80%融合，將MTT溶液加入培養(yǎng)液，20 μl/孔，繼續(xù)培養(yǎng)4 h。離心半徑6 cm，3 000 r/min離心5 min，棄上清，加入二甲基亞砜，150 μl/孔，避光振蕩孵育5 min，采用酶標(biāo)儀檢測(cè)波長(zhǎng)為490 nm處各孔吸光度(A)值。

1.2.4Transwell小室實(shí)驗(yàn)檢測(cè)各組遷移和侵襲的細(xì)胞數(shù) 取各組Y-79細(xì)胞，細(xì)胞密度為2.5×105個(gè)/ml,加入Transwell小室上室，200 μl/孔，下室加入含有10%胎牛血清的培養(yǎng)液，600 μl/孔，培養(yǎng)24 h。培養(yǎng)液中滴加質(zhì)量分?jǐn)?shù)10%多聚甲醛溶液固定20 min，滴加結(jié)晶紫染液，作用10 min，光學(xué)顯微鏡下觀察遷移細(xì)胞數(shù)。將Matrigel基質(zhì)膠稀釋液加入上室，40 μl/孔，繼續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞4 h，后續(xù)實(shí)驗(yàn)同細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)，光學(xué)顯微鏡下觀察侵襲細(xì)胞數(shù)。

1.2.5雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)測(cè)定WT-ADPGK-AS1和MUT-ADPGK-AS1酶活性 LncBase Predicted v.2預(yù)測(cè)顯示ADPGK-AS1與miR-623存在結(jié)合位點(diǎn)(圖1)，分別構(gòu)建野生型載體WT-ADPGK-AS1與突變型載體MUT-ADPGK-AS1，分別將miR-NC、miR-623 mimics與WT-ADPGK-AS1、MUT-ADPGK-AS1加入培養(yǎng)液共轉(zhuǎn)染Y-79細(xì)胞，繼續(xù)培養(yǎng)24 h。采用雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)系統(tǒng)檢測(cè)，按照雙熒光素酶報(bào)告基因試劑盒說(shuō)明書(shū)，應(yīng)用酶標(biāo)儀檢測(cè)螢火蟲(chóng)與海腎熒光值，以海腎熒光值作為內(nèi)參，測(cè)定WT-ADPGK-AS1和MUT-ADPGK-AS1酶活性。分別將pcDNA、pcDNA-ADPGK-AS1、siRNA-NC、siRNA-ADPGK-AS1轉(zhuǎn)染至Y-79細(xì)胞中繼續(xù)培養(yǎng)24 h,并采用熒光定量PCR法測(cè)定細(xì)胞中miR-623表達(dá)。

圖1 ADPGK-AS1的序列中含有與miR-623互補(bǔ)的核苷酸序列 WT：野生型；miR：微小RNA；MUT：突變型；ADPGK-AS1：二磷酸腺苷依賴的葡萄糖激酶反義RNA1Figure 1 The sequence of ADPGK-AS1 contained a nucleotide sequence complementary to miR-623 WT:wild type;miR:microRNA;MUT:mutant type;ADPGK-AS1:adenosine diphosphate-dependent glucokinase antisense RNA 1

1.2.6Western blot法測(cè)定細(xì)胞中Ki-67、MMP-2和MMP-9蛋白表達(dá) 取各組Y-79細(xì)胞，加入400 μl RIPA裂解液提取細(xì)胞總蛋白，采用BCA法測(cè)定蛋白濃度，取30 μg蛋白樣品進(jìn)行SDS-PAGE電泳反應(yīng)，轉(zhuǎn)膜，封閉，分別滴加Ki-67、MMP-2和MMP-9與內(nèi)參GAPDH一抗稀釋液(均1∶ 1 000)，4 ℃孵育24 h，TBS洗滌，滴加相應(yīng)二抗稀釋液(1∶ 2 000)，室溫下孵育1 h，TBST洗滌，ECL顯色，暗室內(nèi)曝光顯影，用Image J軟件分析各條帶灰度值。目的蛋白相對(duì)表達(dá)量=目的蛋白表達(dá)灰度值/GAPDH灰度值。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 21.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料的數(shù)據(jù)經(jīng)Shapiro-Wilk檢驗(yàn)證實(shí)呈正態(tài)分布，以mean±SD表達(dá)。采用均衡分組單因素干預(yù)研究設(shè)計(jì)，瘤旁組織與RB組織中l(wèi)ncRNA ADPGK-AS1和miR-623 mRNA相對(duì)表達(dá)量差異比較采用配對(duì)t檢驗(yàn)，不同干預(yù)的2個(gè)組間各檢測(cè)指標(biāo)差異比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，多組間評(píng)估指標(biāo)差異比較采用單因素方差分析，組間的多重比較采用SNK-q檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 ADPGK-AS1和miR-623在人RB組織中的表達(dá)

與瘤旁組織比較，RB組織中ADPGK-AS1相對(duì)表達(dá)量明顯升高，miR-623相對(duì)表達(dá)量明顯降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=40.522，P<0.01；t=48.497，P<0.01)(表1)。

表1 RB組織與瘤旁組織中ADPGK-AS1和miR-623相對(duì)表達(dá)量比較(mean±SD)Table 1 Comparison of relative expression levels of ADPGK-AS1 and miR-623 between RB tissue and adjacent tissue (mean±SD)組別樣本量ADPGK-AS1相對(duì)表達(dá)量miR-623相對(duì)表達(dá)量瘤旁組織391.00±0.071.00±0.06RB組織392.56±0.230.44±0.04t值40.52248.497P值<0.01<0.01 注:(配對(duì)t檢驗(yàn)) RB:視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤;ADPGK-AS1:二磷酸腺苷依賴的葡萄糖激酶反義RNA1;miR:微小RNA Note:(Paired t test) RB:retinoblastoma;ADPGK-AS1:adenosine diphosphate-dependent glucokinase antisense RNA 1;miR:microRNA

2.2 不同siRNA轉(zhuǎn)染組Y-79細(xì)胞增生相關(guān)指標(biāo)變化

Western blot檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，siRNA-ADPGK-AS1組細(xì)胞中Ki-67蛋白表達(dá)條帶強(qiáng)度較siRNA-NC組減弱(圖2)，Ki-67蛋白相對(duì)表達(dá)量明顯低于siRNA-NC組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=26.833，P<0.01)；與siRNA-NC組比較，siRNA-ADPGK-AS1組Y-79細(xì)胞增生A值明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=18.522，P<0.01)(表2)。

圖2 不同siRNA轉(zhuǎn)染組Y-79細(xì)胞增生及生物學(xué)行為相關(guān)指標(biāo)比較 A：Western blot檢測(cè)顯示siRNA-ADPGK-AS1組細(xì)胞中Ki-67、MMP-2和MMP9蛋白表達(dá)條帶明顯弱于siRNA-NC組 B：不同質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組遷移和侵襲情況(結(jié)晶紫 ×200，標(biāo)尺=200 μm) siRNA-ADPGK-AS1組遷移和侵襲細(xì)胞數(shù)少于siRNA-NC組 1：siRNA-NC組；2：siRNA-ADPGK-AS1組 MMP：基質(zhì)金屬蛋白酶；GAPDH：磷酸甘油醛脫氫酶；siRNA：小干擾RNA；NC：正常對(duì)照;ADPGK-AS1:二磷酸腺苷依賴的葡萄糖激反義RNA1Figure 2 Comparison of Y-79 cells proliferation and biological behavior-related indicators in different siRNA transfection groups A:Ki-67,MMP-2 and MMP9 protein expression bands in the siRNA-ADPGK-AS1 group were significantly weaker than those in the siRNA-NC group B:The migration and invasion of different plasmid transfection groups (crystal violet ×200,scale bar=200 μm) The number of migrating and invading cells in the siRNA-ADPGK-AS1 group was less than that in the siRNA-NC group 1:siRNA-NC group;2:siRNA-ADPGK-AS1 group MMP:matrix metalloproteinase;GAPDH:glyceraldehyde phosphate dehydrogenase;siRNA:small interfering RNA;NC:normal control;ADPGK-AS1:adenosine diphosphate-dependent glucokinase antisense RNA 1

表2 不同siRNA轉(zhuǎn)染組細(xì)胞增生相關(guān)指標(biāo)比較(mean±SD)Table 2 Comparison of cell proliferation-related indexes in different siRNA transfection groups (mean±SD)組別樣本量ADPGK-AS1相對(duì)表達(dá)量細(xì)胞增生值(A)Ki-67蛋白相對(duì)表達(dá)量siRNA-NC組91.00±0.050.71±0.050.57±0.04siRNA-ADPGK-AS1組90.37±0.030.35±0.030.17±0.02t值32.41318.52226.833P值<0.01<0.01<0.01 注:(獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)) siRNA:小干擾RNA;NC:正常對(duì)照;AD-PGK-AS1:二磷酸腺苷依賴的葡萄糖激酶反義RNA1 Note:(Independent sample t test) siRNA:small interfering RNA;NC:normal control;ADPGK-AS1:adenosine diphosphate-dependent glucokinase antisense RNA 1

2.3 不同siRNA轉(zhuǎn)染組Y-79細(xì)胞生物學(xué)行為相關(guān)指標(biāo)比較

Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示，siRNA-ADPGK-AS1組細(xì)胞中MMP-2和MMP9蛋白表達(dá)條帶強(qiáng)度均明顯弱于siRNA-NC組，siRNA-ADPGK-AS1組Y-79細(xì)胞遷移數(shù)目和侵襲數(shù)目均少于siRNA-NC組(圖2)。siRNA-ADPGK-AS1組細(xì)胞中MMP-2和MMP-9蛋白相對(duì)表達(dá)量均明顯低于siRNA-NC組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=22.123，P<0.01；t=26.183，P<0.01)；Transwell小室實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，siRNA-ADPGK-AS1組遷移細(xì)胞數(shù)和侵襲細(xì)胞數(shù)均明顯少于siRNA-NC組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=12.385，P<0.01；t=19.201，P<0.01)(表3)。

表3 不同siRNA轉(zhuǎn)染組細(xì)胞生物學(xué)行為相關(guān)指標(biāo)比較(mean±SD)Table 3 Comparison of biological behavior-related indexes of cells in different siRNA transfection groups (mean±SD)組別樣本量遷移細(xì)胞數(shù)(個(gè))侵襲細(xì)胞數(shù)(個(gè))MMP-2蛋白相對(duì)表達(dá)量MMP-9蛋白相對(duì)表達(dá)量siRNA-NC組995.93±7.8780.06±5.640.69±0.050.81±0.05siRNA-ADPGK-AS1組957.37±5.0338.93±3.080.26±0.030.34±0.02t值12.38519.20122.12326.183P值<0.01<0.01<0.01<0.01 注:(獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)) siRNA:小干擾RNA;NC:正常對(duì)照;MMP:基質(zhì)金屬蛋白酶;ADPGK-AS1:二磷酸腺苷依賴的葡萄糖激酶反義RNA1 Note:(Independent sample t test) siRNA:small interfering RNA;NC:normal control;MMP:matrix metalloproteinase;ADPGK-AS1:a-denosine diphosphate-dependent glucokinase antisense RNA 1

2.4 ADPGK-AS1靶向調(diào)控miR-623的表達(dá)

與miR-NC組比較，miR-623組細(xì)胞中WT-ADPGK-AS1熒光素酶活性明顯下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=14.926，P<0.01)，2個(gè)組間細(xì)胞中MUT-ADPGK-AS1熒光素酶活性比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=0.651，P=0.524)(表4)。與pcDNA組比較，pcDNA-ADPGK-AS1組miR-623的相對(duì)表達(dá)量降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與siRNA-NC組比較，siRNA-ADPGK-AS1組miR-623相對(duì)表達(dá)量升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(表5)。

表4 2個(gè)組WT-ADPGK-AS1和MUT-ADPGK-AS1熒光素酶活性比較(mean±SD)Table 4 Comparison of luciferase activity of WT-ADPGK-AS1 and MUT-ADPGK-AS1 between the two groups (mean±SD)組別樣本量WT-ADPGK-AS1酶活性MUT-ADPGK-AS1酶活性miR-NC組91.03±0.091.01±0.07miR-623組90.54±0.040.99±0.06t值14.9260.651P值<0.010.524 注:(獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)) WT:野生型;ADPGK-AS1:二磷酸腺苷依賴的葡萄糖激酶反義RNA1;MUT:突變型;miR:微小RNA;NC:正常對(duì)照 Note:(Independent sample t test) WT:wild type;ADPGK-AS1:a-denosine diphosphate-dependent glucokinase antisense RNA 1;MUT:mutant type;miR:microRNA;NC:normal control

表5 各組細(xì)胞中miR-623相對(duì)表達(dá)量比較(mean±SD)Table 5 Comparison of relative expression levels of miR-623 among various groups (mean±SD)分組樣本量miR-623相對(duì)表達(dá)量pcDNA組91.00±0.05pcDNA-ADPGK-AS1組90.51±0.04asiRNA-NC組90.99±0.06siRNA-ADPGK-AS1組92.97±0.25bF值612.115P值<0.01 注:與pcDNA組比較,aP<0.05;與siRNA-NC組比較,bP<0.05(單因素方差分析,Tukey檢驗(yàn)) miR:微小RNA;pcDNA:質(zhì)粒載體DNA;ADPGK-AS1:二磷酸腺苷依賴的葡萄糖激酶反義RNA1;siR-NA:小干擾RNA;NC:正常對(duì)照 Note:Compared with pcDNA group,aP<0.05;compared with siR-NA-NC group,bP<0.05 (One-way ANOVA,Tukey test) miR:mi-croRNA;pcDNA:plasmid carrier DNA;ADPGK-AS1:adenosine diphosphate-dependent glucokinase antisense RNA 1;siRNA:small in-terfering RNA;NC:normal control

2.5 不同miRNA轉(zhuǎn)染組Y-79細(xì)胞活力比較

Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示，miR-623組細(xì)胞中Ki-67、MMP-2、MMP-9蛋白表達(dá)條帶明顯弱于miR-NC組，miR-623組Ki-67、MMP-2、MMP-9蛋白相對(duì)表達(dá)量明顯低于miR-NC組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=22.137、22.200、21.094，均P<0.01)；與miR-NC組比較，miR-623組細(xì)胞增生A值降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=16.398，P<0.01)。Transwell小室實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，miR-623組遷移細(xì)胞數(shù)和侵襲細(xì)胞數(shù)均明顯少于miR-NC組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=11.400、17.846，均P<0.01)(圖3，表6)。

表6 不同miRNA轉(zhuǎn)染組Y-79細(xì)胞增生和移行相關(guān)指標(biāo)比較(mean±SD)Table 6 Comparison of Y-79 cell proliferation and migration related indicators between the two different miRNA transfection groups (mean±SD)組別樣本量miR-623相對(duì)表達(dá)量細(xì)胞增生值(A)遷移細(xì)胞數(shù)(個(gè))侵襲細(xì)胞數(shù)(個(gè))Ki-67蛋白相對(duì)表達(dá)量MMP-2蛋白相對(duì)表達(dá)量MMP-9蛋白相對(duì)表達(dá)量miR-NC組91.00±0.060.74±0.0599.92±8.6486.41±5.250.58±0.040.68±0.040.83±0.05miR-623組92.69±0.220.39±0.0462.92±4.4944.77±4.630.25±0.020.31±0.030.42±0.03t值22.23316.39811.40017.84622.13722.20021.094P值<0.01<0.01<0.01<0.01<0.01<0.01<0.01 注:(獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)) miR:微小RNA;NC:正常對(duì)照;MMP:基質(zhì)金屬蛋白酶 Note:(Independent sample t test) miR:micro RNA;NC:normal control;MMP:matrix metalloproteinase

2.6 miR-623與ADPGK-AS1聯(lián)合作用下Y-79細(xì)胞生物學(xué)行為變化

Western blot檢測(cè)顯示，siRNA-ADPGK-AS1+anti-miR-623組細(xì)胞中Ki-67、MMP-2和MMP-9蛋白相對(duì)表達(dá)量均明顯高于siRNA-ADPGK-AS1+anti-miR-NC組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=20.795、17.493、23.479，均P<0.01)。與siRNA-ADPGK-AS1+anti-miR-NC組比較，siRNA-ADPGK-AS1+anti-miR-623組A值明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=15.600，P<0.01)；siRNA-ADPGK-AS1+anti-miR-623組遷移細(xì)胞數(shù)及侵襲細(xì)胞數(shù)明顯增多，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=14.495、17.855，均P<0.01)(圖4，表7)。

表7 2個(gè)組Y-79細(xì)胞增生和生物學(xué)行為相關(guān)指標(biāo)比較(mean±SD)Table 7 Comparison of Y-79 cell proliferation and biological behavior-related indexes between the two groups (mean±SD)組別樣本量miR-623相對(duì)表達(dá)量細(xì)胞增生值(A)遷移細(xì)胞數(shù)(個(gè))侵襲細(xì)胞數(shù)(個(gè))Ki-67蛋白相對(duì)表達(dá)量MMP-2蛋白相對(duì)表達(dá)量MMP-9蛋白相對(duì)表達(dá)量siRNA-ADPGK-AS1+anti-miR-NC組91.00±0.050.34±0.0356.34±4.4435.89±3.330.15±0.020.25±0.030.33±0.02siRNA-ADPGK-AS1+anti-miR-623組90.59±0.050.60±0.0486.44±4.3770.66±4.800.46±0.040.59±0.050.68±0.04t值17.39515.60014.49517.85520.79517.49323.479P值<0.01<0.01<0.01<0.01<0.01<0.01<0.01 注:(獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)) siRNA:小干擾RNA;miR:微小RNA;NC:正常對(duì)照;MMP:基質(zhì)金屬蛋白酶;ADPGK-AS1:二磷酸腺苷依賴的葡萄糖激酶反義RNA1 Note:(Independent sample t test) siRNA:small interfering RNA;miR:micro RNA;NC:normal control;MMP:matrix metalloproteinase;AD-PGK-AS1:adenosine diphosphate-dependent glucokinase antisense RNA 1

圖4 2個(gè)組Y-79細(xì)胞增生和生物學(xué)行為相關(guān)指標(biāo)比較 A：Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示，siRNA-ADPGK-AS1+anti-miR-623組細(xì)胞中Ki-67、MMP-2和MMP-9蛋白表達(dá)條帶明顯強(qiáng)于siRNA-ADPGK-AS1+anti-miR-NC組 B：各組Y-79細(xì)胞遷移和侵襲情況比較(結(jié)晶紫，標(biāo)尺=200 μm) siRNA-ADPGK-AS1+anti-miR-623組遷移和侵襲細(xì)胞數(shù)多于siRNA-ADPGK-AS1+anti-miR-NC組 1：siRNA-ADPGK-AS1+anti-miR-NC組；2：siRNA-ADPGK-AS1+anti-miR-623組 siRNA:小干擾RNA;miR:微小RNA;NC:正常對(duì)照;MMP：基質(zhì)金屬蛋白酶;GAPDH：磷酸甘油醛脫氫酶;ADPGK-AS1：二磷酸腺苷依賴的葡萄糖激酶反義RNA1Figure 4 Comparison of Y-79 cell proliferation and biological behavior-related indicators between the two groups A:Western blot assay showed that the protein expression bands of Ki-67,MMP-2 and MMP-9 in the siRNA-ADPGK-AS1+anti-miR-623 group were significantly stronger than those in the siRNA-ADPGK-AS1+anti-miR-NC group B:Y-79 cell migration and invasion between two groups (crystal violet ×200,scale bar=200 μm) The number of migrating and invading cells in the siRNA-ADPGK-AS1+anti-miR-623 group was more than that in siRNA-ADPGK-AS1+anti-miR-NC group 1:siRNA-ADPGK-AS1+anti-miR-NC group;2:siRNA-ADPGK-AS1+anti-miR-623 group siRNA:small interfering RNA;miR:micro RNA;NC:normal control;MMP:matrix metalloproteinase;GAPDH:glyceraldehyde phosphatede hydrogenase;ADPGK-AS1:denosine diphosphate-dependent glucokinase antisense RNA 1

3 討論

lncRNA在RB細(xì)胞增生、遷移及侵襲等生物學(xué)過(guò)程中發(fā)揮重要的調(diào)控作用，敲低lncRNAPVT1基因可充當(dāng)miR-488-3p的海綿分子而抑制RB的進(jìn)展[18]，lncRNA LINC00202通過(guò)充當(dāng)miR-3619-5p的海綿分子而促進(jìn)RB的進(jìn)展[19]。沉默lncRNAANRIL基因可通過(guò)調(diào)節(jié)miR-99a/c-Myc而抑制RB細(xì)胞的生長(zhǎng)并促進(jìn)其凋亡[20]。LncRNA AFAP1-AS1是一種預(yù)后生物標(biāo)志物，在RB的發(fā)生過(guò)程中起致癌作用[21]。LncRNA在RB發(fā)生及轉(zhuǎn)移過(guò)程中的分子機(jī)制尚未完全闡明。

研究發(fā)現(xiàn)，ADPGK-AS1在骨肉瘤組織中的表達(dá)水平升高，并可通過(guò)靶向miR-542-3p而促進(jìn)細(xì)胞的增生、侵襲和遷移并抑制其凋亡[22]。此外，ADPGK-AS1在乳腺癌組織中表達(dá)水平升高，并可通過(guò)調(diào)節(jié)miR-3196/OTX1分子軸而促進(jìn)細(xì)胞增生、遷移及間質(zhì)-上皮轉(zhuǎn)化過(guò)程[23]。ADPGK-AS1通過(guò)充當(dāng)miR-525的海綿分子而促進(jìn)結(jié)直腸癌的進(jìn)展[24]。本研究結(jié)果顯示RB組織中ADPGK-AS1的表達(dá)水平明顯高于瘤旁組織，進(jìn)一步研究顯示干擾ADPGK-AS1的表達(dá)可明顯降低細(xì)胞活力及Ki-67蛋白水平，提示ADPGK-AS1在RB發(fā)生和發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮重要調(diào)控作用。研究表明，Ki-67在腫瘤組織或細(xì)胞中表達(dá)水平升高可促進(jìn)細(xì)胞增生[25-28]，提示干擾ADPGK-AS1的表達(dá)可抑制RB細(xì)胞增生。腫瘤細(xì)胞遷移及侵襲與細(xì)胞外基質(zhì)沉積有關(guān)，MMP-2和MMP-9可降解細(xì)胞外基質(zhì)從而促進(jìn)細(xì)胞遷移及侵襲[29-32]。本研究結(jié)果顯示，干擾ADPGK-AS1表達(dá)后RB細(xì)胞遷移及侵襲細(xì)胞數(shù)明顯減少，并可抑制MMP-2、MMP-9的表達(dá)，提示干擾ADPGK-AS1表達(dá)可抑制RB細(xì)胞遷移及侵襲。

本研究證實(shí)ADPGK-AS1可競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合miR-623，并可負(fù)向調(diào)控miR-623的表達(dá)。miR-623可抑制肺腺癌的進(jìn)展[33]；其還可抑制乳腺癌細(xì)胞增生、遷移及侵襲[34]；miR-623靶向細(xì)胞周期蛋白D1抑制胃癌中的細(xì)胞增生[35]。本研究結(jié)果顯示，RB組織中miR-623的表達(dá)水平降低，miR-623過(guò)表達(dá)可抑制RB細(xì)胞增生、遷移及侵襲，提示miR-623在RB發(fā)生和發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮重要調(diào)控作用。本研究將siRNA-ADPGK-AS1與anti-miR-623共轉(zhuǎn)染至RB細(xì)胞，結(jié)果顯示細(xì)胞活力增強(qiáng)，遷移及侵襲細(xì)胞數(shù)增多，并可促進(jìn)Ki-67、MMP-2、MMP-9表達(dá)，提示抑制miR-623表達(dá)可明顯逆轉(zhuǎn)干擾ADPGK-AS1表達(dá)對(duì)RB細(xì)胞生物學(xué)行為的作用。

綜上所述，ADPGK-AS1在RB組織中表達(dá)水平升高，而miR-623的表達(dá)水平降低，敲低ADPGK-AS1基因可通過(guò)靶向上調(diào)miR-623的表達(dá)而抑制Y-79細(xì)胞增生、遷移及侵襲，可能成為RB分子治療的潛在靶點(diǎn)，還可為進(jìn)一步揭示RB發(fā)生及發(fā)展的分子機(jī)制提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。但是，ADPGK-AS1-miR-623的靶基因以及詳細(xì)調(diào)控機(jī)制仍需深入研究。

利益沖突所有作者均聲明不存在任何利益沖突

作者貢獻(xiàn)聲明張俊參與研究實(shí)施、資料收集、論文寫(xiě)作和修改；劉彩林參與研究實(shí)施、文章撰寫(xiě)和修改；卜戰(zhàn)云提供課題支持，參與研究選題、研究設(shè)計(jì)、研究過(guò)程指導(dǎo)和論文主要內(nèi)容的修改和定稿