覃亞周 樊小娟 劉靜 李晶明

1西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院眼科 710061；2西安市第四醫(yī)院眼科 710004

家族性滲出性玻璃體視網(wǎng)膜病變(familial exudative vitreoretinopathy，F(xiàn)EVR)是一種視網(wǎng)膜血管生長和發(fā)育異常的遺傳性疾病[1]。FEVR有多種遺傳方式，包括常染色體顯性遺傳、常染色體隱性遺傳和X染色體連鎖隱性遺傳，遺傳方式的不同與涉及的基因突變位點(diǎn)有關(guān)[2]。目前已發(fā)現(xiàn)6個與FEVR相關(guān)的基因，包括卷曲蛋白-4(frizzled-4，F(xiàn)ZD4)、低密度脂蛋白受體相關(guān)蛋白-5(low density lipoprotein receptor related protein-5，LRP5)、四次跨膜蛋白-12(tetraspanin-12，TSPAN12)、Norrin蛋白(norrin disease protein，NDP)、鋅指蛋白408(zinc finger protein 408，ZNF408)和驅(qū)動蛋白家族成員11(kinesin family number，KIF11)[3-8]。近期一項(xiàng)34個FEVR家系的隊(duì)列研究發(fā)現(xiàn)，在父母均存在相關(guān)基因突變的情況下，突變基因以LRP5最為多見，高達(dá)64.6%[9]。部分FEVR患者早期無明顯視力異常，常規(guī)眼科查體容易漏診，隨著分子生物學(xué)和遺傳學(xué)的發(fā)展，基因檢測逐漸成為此類疾病重要的篩檢手段。本研究對1個存在LRP5基因變異的FEVR家系臨床表型和基因突變特點(diǎn)進(jìn)行分析，為FEVR的精準(zhǔn)診斷提供依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料

采用家系調(diào)查研究方法，納入中國陜西省西安市1個漢族FEVR家系2代3名成員。先證者因2017年體檢時發(fā)現(xiàn)眼底有異常改變，無自覺癥狀，就診于西安市第四醫(yī)院并診斷為FEVR，并于2019年10月至西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院眼科就診行基因檢測。本研究遵循《赫爾辛基宣言》，經(jīng)西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)(批文號：2017-740)，所有家系成員均簽署知情同意書。

1.2 方法

1.2.1一般檢查 先證者及其父母均接受常規(guī)眼科檢查，包括應(yīng)用標(biāo)準(zhǔn)對數(shù)視力表(蘇州六六視覺科技股份有限公司)檢查視力、應(yīng)用非接觸式眼壓計(jì)(TX-20，日本Topcon公司)測量眼壓，應(yīng)用裂隙燈顯微鏡(SL-1E，日本Topcon公司)及前置鏡(Digital Wild field,Volk)行眼前節(jié)及眼底檢查，使用超寬眼底視野掃描成像(Daytona，意大利Optos公司)進(jìn)行廣角熒光素眼底血管造影(fundus fluorescein angiography，F(xiàn)FA)以明確各家系成員的臨床表型。

1.2.2基因測序及遺傳學(xué)分析 采集先證者及其父母外周血5 ml，于北京中因科技有限公司進(jìn)行眼科基因診斷芯片檢測，該基因診斷芯片包括76種常見眼科遺傳病的441個致病基因。提取受檢者外周血中基因組DNA，構(gòu)建基因組文庫，通過探針雜交捕獲相關(guān)目的基因外顯子及相鄰內(nèi)含子部分區(qū)域，應(yīng)用NovaSeq 6000技術(shù)測序平臺對富集的目的基因片段進(jìn)行測序，采用Sanger測序?qū)λ鶊?bào)告FEVR相關(guān)的變異位點(diǎn)進(jìn)行驗(yàn)證。根據(jù)美國醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)協(xié)會(American College of Medical Genetics，ACMG)指南[10]，并采用Mutation Taster、Polyphen-2、PROVEN和REVEL軟件對新發(fā)現(xiàn)的變異位點(diǎn)進(jìn)行致病性分析。

2 結(jié)果

2.1 家系患者臨床表型

該家系為常染色體顯性或隱性遺傳。先證者，男，27歲，裸眼視力(uncorrected visual acuity，UCVA)右眼1.0，左眼1.2，眼壓正常，裂隙燈顯微鏡下檢查眼底可見雙眼顳側(cè)周邊部視網(wǎng)膜血管迂曲擴(kuò)張，F(xiàn)FA示雙眼周邊視網(wǎng)膜血管擴(kuò)張成毛刷樣改變并有無灌注區(qū)形成，診斷為FEVR，行眼底激光光凝治療。2019年10月FFA檢查可見雙眼周邊視網(wǎng)膜激光斑，右眼顳側(cè)仍可見少量熒光素滲漏灶(圖1)。

圖1 先證者廣角FFA圖像 A：激光光凝治療前右眼廣角FFA圖像 右眼顳側(cè)周邊部血管毛刷樣改變，可見熒光素滲漏(紅色箭頭) B：激光光凝治療前左眼廣角FFA圖像 左眼顳側(cè)周邊部可見少量熒光素滲漏(紅色箭頭) C：激光光凝治療后2年右眼廣角FFA圖像 右眼顳側(cè)周邊可見激光斑，仍有少量熒光素滲漏 D：激光光凝治療后2年左眼廣角FFA圖像 左眼顳側(cè)可見激光斑，未見熒光素滲漏Figure 1 Wild-field FFA images of the proband A:Wild-field FFA of the right eye before treatment Hairbrush-like vascular abnormality with fluorescein leakage (red arrow) was visible in temporal peripheral retina B:Wild-field FFA of the left eye before treatment A slight fluorescein leakage (red arrow) was visible in temporal peripheral retina C:Wild-field FFA of the right eye 2 years after laser coagulation Laser spots were visible and fluorescein leakage was decreased D:Wild-field fundus fluorescein angiography of the left eye 2 years after laser coagulation Laser spots were visible in peripheral retina and fluorescein leakage was not observed

先證者母親51歲，雙眼UCVA均為0.8，雙眼最佳矯正視力(best corrected visual acuity,BCVA)均為1.0，眼壓正常，眼底檢查可見左眼顳側(cè)周邊視網(wǎng)膜血管迂曲，廣角FFA檢查示左眼顳側(cè)周邊視網(wǎng)膜末梢血管熒光素滲漏，診斷為左眼視網(wǎng)膜周邊血管異常。先證者父親56歲，UCVA右眼0.08，左眼0.1，雙眼BCVA均為1.0，眼壓正常，眼底檢查可見視盤周圍萎縮環(huán)與豹紋狀眼底，廣角FFA檢查未見眼底血管有明顯熒光素滲漏，診斷為雙眼高度近視眼底改變(圖2)。

圖2 先證者父母FFA圖像 A：先證者母親右眼廣角FFA圖像 未見熒光素滲漏 B：先證者母親左眼廣角FFA圖像 可見顳側(cè)周邊視網(wǎng)膜末梢血管熒光素滲漏(紅色箭頭) C：先證者父親右眼廣角FFA圖像 未見熒光素滲漏 D：先證者父親左眼廣角FFA圖像未見熒光素滲漏Figure 2 FFA images of the proband's parents A:Wild-field FFA of the right eye of the proband's mother Fluorescein leakage was not detected B:Wild-field FFA of the left eye of the proband's mother The vascular fluorescein leakage (red arrow) was visible at temporal peripheral retina C:Wild-field FFA of the right eye of the proband's father Fluorescein leakage was not observed D:Wild-field FFA of the left eye of the proband's father Fluorescein leakage was not observed

2.2 家系基因檢測結(jié)果及分析

基因檢測結(jié)果顯示，先證者存在2個新發(fā)現(xiàn)的基因變異位點(diǎn)：LRP5基因c.4110T>G(p.Cys1370Trp)和FSCN2基因c.1495G>A(p.Gly499Ser)(表1)。先證者母親攜帶該LRP5基因突變位點(diǎn)，先證者父親未檢測到以上變異位點(diǎn)。

表1 基因突變檢測結(jié)果Table 1 Gene mutation detection results基因名稱基因組位置變異純合/雜合ACMG致病評級遺傳方式變異來源疾病LRP5chr11:68204466:T>GNM_002335.4:exon19:c.4110T>G:p.Cys1370Trp雜合意義不明確的變異AD/AR母源滲出性玻璃體視網(wǎng)膜病4型(MIM:601813)FSCN2chr17:79504050:G>ANM_001077182.3:exon5:c.1495G>A:p.Gly499Ser雜合意義不明確的變異未知未知視網(wǎng)膜色素變性30型(MIM:607921) 注:AD:常染色體顯性遺傳;AR:常染色體隱性遺傳 Note:AD:autosomal dominant inheritance;AR:autosomal recessive inheritance

p.Cys1370Trp為LRP5基因所編碼蛋白的第1370號氨基酸由半胱氨酸變?yōu)樯彼?。采用Sanger測序法對LRP5基因c.4110T>G突變進(jìn)行驗(yàn)證，確認(rèn)先證者此變異為雜合變異，先證者母親攜帶這一雜合變異，父親則不攜帶(圖3)。根據(jù)該家系臨床表型與基因檢測結(jié)果繪制家系圖(圖4)。Genome Aggregation Database(gnomAD)和Exome Aggregation Consortium(ExAC)等多個數(shù)據(jù)庫均未檢測到此變異，可作為1個中等致病性證據(jù)(moderate evidence of pathogenicity，PM)2。使用MutationTaster、Polyphen-2、PROVEN和REVEL軟件對此變異進(jìn)行蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)、功能和進(jìn)化保守性預(yù)測：MutationTaster預(yù)測該變異致病的概率為0.999；Polyphen-2評分為0.999，為很有可能致病的變異；PROVEN預(yù)測得分為-5.437，低于-2.5，為有害變異；REVEL評分為0.93，為有害變異。以上軟件預(yù)測結(jié)果提供了1個此變異致病的支持證據(jù)(supporting evidence of pathogenicity，PP)3。另外，患者的臨床表型高度符合FEVR，也可作為1個支持證據(jù)PP4。根據(jù)ACMG指南，PM2+PP3+PP4僅能判斷此LRP5基因變異位點(diǎn)為臨床意義未明的變異。

圖3 Sanger法測序驗(yàn)證圖 先證者及其母親攜帶LRP5基因c.4110T>G，黑色箭頭示突變位點(diǎn)Figure 3 Sanger sequencing results Mutation site (c.4110T>G) of LRP5 gene was detected in the proband and his mother,and black arrow indicated the mutation site

圖4 FEVR患者家系圖 □：正常男性；■：患病男性；●：患病女性；：先證者Figure 4 FEVR pedigree chart □:normal male;■:sick male;●:sick female;:proband

另外，僅先證者攜帶的FSCN2基因c.1495G>A(p.Gly499Ser)變異與視網(wǎng)膜色素變性相關(guān)，與FEVR臨床表型不符合，僅MutationTaster、Polyphen-2及PROVEN預(yù)測為有害變異，致病性證據(jù)不足。

3 討論

本研究發(fā)現(xiàn)LRP5基因1個新的突變位點(diǎn)c.4110T>G(p.Cys1370Trp)，雖然該變異目前被判定為臨床意義未明，鑒于該病表型與患者表型高度相符，可認(rèn)為該變異致病可能性大。該突變位點(diǎn)來自于先證者母親，若想進(jìn)一步分析，需明確先證者母親表型，對家族內(nèi)其他人進(jìn)行基因測序。但客觀條件受限，未能取得家族中其他成員配合，故無法進(jìn)行深入研究。

臨床上約50%的FEVR患者由Norrie/Wnt信號通路相關(guān)的基因突變引起，涵蓋FZD4、LRP5、TSPAN12和NDP[11]。Wnt信號通路參與調(diào)控細(xì)胞的增生、遷移和分化，以及眼球的組織發(fā)育和血管形成過程[12]。Norrin通路與異常視網(wǎng)膜血管生成密切相關(guān)，并與Wnt通路共同參與核轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子β-catenin的激活，從而調(diào)控特定組織器官中促進(jìn)細(xì)胞增生和分化的靶基因的表達(dá)。FEVR最常見的遺傳方式是常染色體顯性遺傳，與FZD4和LRP5基因突變有關(guān)。正常情況下，F(xiàn)ZD4和LRP5基因編碼產(chǎn)物組成受體復(fù)合物，并與Wnt或Norrin蛋白結(jié)合，抑制細(xì)胞質(zhì)內(nèi)β-catenin的泛素-蛋白酶體途徑降解，使其在細(xì)胞質(zhì)中積累并進(jìn)入細(xì)胞核，與細(xì)胞核內(nèi)的T細(xì)胞因子或淋巴增強(qiáng)因子(T cell factor/lymphoid enhancer factor，TCF/LEF)作用，促進(jìn)目的基因的表達(dá)。當(dāng)Norrin蛋白配體與FZD4-LRP5受體復(fù)合物結(jié)合時，需要TSPAN12基因表達(dá)產(chǎn)物的參與，促進(jìn)復(fù)合物的多聚化。其中Norrin蛋白是NDP基因編碼的一種富含半胱氨酸的分泌蛋白，可與FZD4結(jié)合，其結(jié)合的特異性和親和力越高，Norrin誘導(dǎo)FZD4和LRP5依賴的經(jīng)典Wnt通路越高效。非經(jīng)典途徑還包括激活胞內(nèi)信號與FZD4的結(jié)合，但此途徑不需要LRP5的參與。

本研究探討的LRP5基因突變可引起FEVR4型，目前LRP5基因突變引起的FEVR發(fā)病率約為22%[11]，已有三十余個突變位點(diǎn)被證實(shí)與FEVR相關(guān)。LRP5蛋白是由1 615個氨基酸組成的單次跨膜蛋白，末端序列與軸蛋白連接，軸蛋白起支架作用并與糖原合成激酶-3、β-catenin組成復(fù)合物，促進(jìn)β-catenin的磷酸化并進(jìn)入細(xì)胞核與TCF/LEF作用。LRP5除了在視網(wǎng)膜血管發(fā)育中具有重要作用外，也可控制成骨細(xì)胞功能和骨的形成，導(dǎo)致骨質(zhì)疏松，嚴(yán)重者可有骨折發(fā)生[13]。因此對于由LRP5基因突變所導(dǎo)致的FEVR患者，尤其是老年患者，需密切關(guān)注骨密度。

先證者還攜帶1個FSCN2基因變異位點(diǎn)c.1495G>A(p.Gly499Ser)。FSCN2基因位于染色體17q25，可在視網(wǎng)膜光感受器細(xì)胞中表達(dá)，誘導(dǎo)肌動蛋白交聯(lián)，對維持光感受器的形態(tài)有著重要作用。FSCN2基因變異常引起視網(wǎng)膜色素變性30型。視網(wǎng)膜色素變性是一種遺傳性的漸進(jìn)性視網(wǎng)膜退化性疾病，主要由視網(wǎng)膜感光細(xì)胞和色素上皮細(xì)胞變性所致，以夜盲、進(jìn)行性視野縮小、視力下降為主要表現(xiàn)，疾病晚期會出現(xiàn)中心視力喪失。該FSCN2基因突變遺傳方式未知，還需要結(jié)合臨床表型及家族史綜合考慮。FSCN2基因突變改變了肌動蛋白的聚合活動和感光細(xì)胞成束蛋白的活動，導(dǎo)致視網(wǎng)膜營養(yǎng)障礙，從而引發(fā)視網(wǎng)膜退化[14]。先證者攜帶LRP5和FSCN2基因突變，其母親只攜帶LRP5基因突變，先證者FFA示周邊視網(wǎng)膜血管擴(kuò)張成毛刷樣改變并有無灌注區(qū)，而其母親FFA僅表現(xiàn)為左眼顳側(cè)周邊視網(wǎng)膜末梢血管熒光素滲漏，先證者的眼底病變較其母親更嚴(yán)重。FSCN2基因是否也參與了FEVR的發(fā)病機(jī)制，LRP5和FSCN2基因之間是否存在相互作用來共同影響FEVR患者的眼底表現(xiàn)，目前尚無相關(guān)研究。

FEVR患者從無癥狀到全盲的過程具有高度多樣性，即使是在同一家系內(nèi)，各患者的臨床表現(xiàn)和嚴(yán)重程度也可能各不相同。本例中先證者及其母親均攜帶LRP5基因突變，先證者眼底表現(xiàn)典型，但是其母親僅表現(xiàn)為輕度的視網(wǎng)膜周邊血管滲漏，推測這一差異可能有以下原因：基因芯片檢測具有局限性，先證者可能攜帶其他不在基因芯片檢測范圍內(nèi)的致病基因；現(xiàn)有的基因測序技術(shù)不能發(fā)現(xiàn)基因大片段缺失和重復(fù)變異，亦不能完全發(fā)現(xiàn)基因位于內(nèi)含子和非翻譯區(qū)的變異；此外，重要信號通路的調(diào)控、表觀遺傳修飾和蛋白質(zhì)的翻譯后修飾在眼球的正常發(fā)育中也有著至關(guān)重要的作用。未來還需更深入的研究從分子水平上明確其發(fā)病機(jī)制。

早期診斷FEVR并制定合適的治療方案是預(yù)防疾病進(jìn)展和挽救患者視力的關(guān)鍵，以往通過FFA可以在早期觀察眼底血管變化，從而提高診斷效率。隨著現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，在基因水平對FEVR家系進(jìn)行基因檢測不僅對于疾病的診斷、發(fā)現(xiàn)新的治療靶點(diǎn)具有十分重要的意義，也可為優(yōu)生優(yōu)育提供遺傳學(xué)咨詢。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突