李漫麗 范珂 崔紅培

河南省人民醫(yī)院眼科 河南省立眼科醫(yī)院 河南省眼科研究所，鄭州 450003

視網(wǎng)膜缺血-再灌注損傷(retinal ischemia-reperfusion injury，RIR)是一種復(fù)雜的病理過(guò)程，多見(jiàn)于糖尿病視網(wǎng)膜病變、急性閉角型青光眼、視網(wǎng)膜中央動(dòng)靜脈阻塞等缺血性眼部疾病[1]。研究表明，視網(wǎng)膜缺血-再灌注過(guò)程中，由于機(jī)體抗氧化系統(tǒng)的不平衡，如超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)活性的降低，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)活性氧簇(reactive oxygen species，ROS)過(guò)度堆積，誘發(fā)視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞(retinal ganglion cells，RGCs)凋亡，導(dǎo)致大鼠視力不可逆喪失[3-4]。牡荊苷是金蓮花、紅草等毛茛科植物的有效成分，屬于黃酮碳苷類(lèi)化合物，難溶于水。研究證實(shí)，牡荊苷對(duì)腦缺血-再灌注大鼠神經(jīng)功能具有保護(hù)作用，可能與調(diào)節(jié)輔助性T淋巴(helper T lymphocyte，Th)1/Th2細(xì)胞平衡向Th2漂移、減輕腦細(xì)胞DNA損傷有關(guān)[5]。牡荊苷還可減輕急性腦缺血再灌注大鼠氧化應(yīng)激反應(yīng)，推測(cè)與調(diào)控核因子E2相關(guān)因子2(nuclear factor E2-related factor 2，Nrf2)/抗氧化反應(yīng)元件(antioxidant response element，ARE)信號(hào)通路，上調(diào)Nrf2的基因和蛋白表達(dá)，增強(qiáng)機(jī)體的抗氧化應(yīng)激反應(yīng)能力有關(guān)[6]。然而，牡荊苷對(duì)RIR引起的氧化應(yīng)激損傷是否有保護(hù)作用，目前尚未見(jiàn)報(bào)道。本研究探討牡荊苷對(duì)RIR模型大鼠視網(wǎng)膜的保護(hù)作用及其抗氧化機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF級(jí)雄性SD大鼠60只，3月齡，體質(zhì)量(220±10)g，購(gòu)于北京維通利華公司，飼養(yǎng)于鄭州大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，室溫20～25 ℃，相對(duì)濕度50%～65%，12 h明暗交替。動(dòng)物飼養(yǎng)及實(shí)驗(yàn)過(guò)程遵循ARVO要求，本研究經(jīng)河南省立眼科醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)審核批準(zhǔn)(批文號(hào)：HNEECA-2019-04)。

1.1.2主要試劑及儀器 牡荊苷標(biāo)準(zhǔn)品(質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥99%，中國(guó)國(guó)家藥品生物制品研究所)；丙二醛(malondialdehyde，MDA)、一氧化氮(nitric oxide，NO)、SOD檢測(cè)試劑盒(武漢博士德生物工程有限公司)；TUNEL檢測(cè)試劑盒、蘇木精-伊紅檢測(cè)試劑盒(上海碧云天生物技術(shù)有限公司)；核蛋白提取試劑盒(美國(guó)Sigma公司)；托吡卡胺滴眼液(北京華潤(rùn)雙鶴藥業(yè)股份有限公司)；熒光金(美國(guó)Fluorochrome公司)；兔抗大鼠Nrf2多克隆抗體(PA5-68817)、兔抗大鼠血紅素加氧酶-1(heme oxygenase-1，HO-1)單克隆抗體(PA5-77833)、兔抗大鼠醌氧化還原酶1(quinone oxidoreductase 1，NQO1)單克隆抗體(39-3700)(美國(guó)Invitrogen公司)；熒光標(biāo)記山羊抗兔IgG多克隆抗體(ab205719，英國(guó)Abcam公司)。Tono-penXL眼壓計(jì)(美國(guó)Reicherrt公司)；熒光倒置顯微鏡(日本Olympus公司)；酶標(biāo)儀(美國(guó)Thermos公司)。

1.2 方法

1.2.1大鼠RIR模型建立 實(shí)驗(yàn)大鼠腹腔內(nèi)注射質(zhì)量分?jǐn)?shù)10%的水合氯醛(400 mg/kg)行全身麻醉，均取右眼造模，質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%地卡因點(diǎn)眼行表面麻醉，托吡卡胺滴眼液擴(kuò)瞳，固定頭部，將輸液器一端連接含無(wú)菌生理鹽水的輸液瓶，另一端連接32G胰島素針頭，取胰島素針頭平行于大鼠身體縱軸，沿眼顳側(cè)角膜緣穿刺進(jìn)入前房，打開(kāi)輸液器開(kāi)關(guān)，將輸液瓶緩慢升高150 cm，用Tono-penXL眼壓計(jì)測(cè)量眼壓為110 mmHg(1 mmHg=0.133 kPa)，此壓力與大鼠體循環(huán)收縮壓接近；維持此高眼壓1 h后將輸液瓶緩慢降低至與動(dòng)物眼球高度平齊，拔出針頭，恢復(fù)視網(wǎng)膜供血。術(shù)后眼表涂抹紅霉素軟膏1次。

1.2.2實(shí)驗(yàn)分組及處理 將60只實(shí)驗(yàn)大鼠按照隨機(jī)數(shù)字表法隨機(jī)分為正常對(duì)照組、模型組和牡荊苷組，每組20只，均以右眼為實(shí)驗(yàn)眼。取模型組和牡荊苷組大鼠按照1.2.1方法建立RIR模型。將牡荊苷標(biāo)準(zhǔn)品用N,N二甲基甲酰胺(N.N-dimethylformamide，DMF)生理鹽水溶液(DMF∶ 生理鹽水=1∶ 20)溶解配制成質(zhì)量濃度為5.0 mg/ml的牡荊苷溶液。取牡荊苷組大鼠于造模后按照25 mg/kg劑量腹腔內(nèi)注射牡荊苷溶液，每日注射1次，連續(xù)給藥7 d[7]。取模型組大鼠腹腔內(nèi)注射相同劑量的DMF生理鹽水溶液。取正常對(duì)照組大鼠右眼行前房穿刺而不升高眼壓，同時(shí)腹腔內(nèi)注射相同劑量的DMF生理鹽水溶液。

1.2.3視網(wǎng)膜組織病理學(xué)觀(guān)察 造模后第7天，各組中任意選取5只大鼠，用質(zhì)量分?jǐn)?shù)10%的水合氯醛(400 mg/kg)腹腔內(nèi)注射行全身麻醉，摘除實(shí)驗(yàn)眼并置于質(zhì)量分?jǐn)?shù)10%多聚甲醛溶液中固定24 h，去除眼前節(jié)組織及晶狀體后，常規(guī)脫水、透明，石蠟包埋，行視網(wǎng)膜矢狀面5 μm厚石蠟切片，常規(guī)蘇木精-伊紅染色，倒置顯微鏡下觀(guān)察視網(wǎng)膜組織結(jié)構(gòu)，采用圖像分析系統(tǒng)采集圖像，應(yīng)用Image-Pro-Plus 6.0分析系統(tǒng)測(cè)定大鼠視網(wǎng)膜厚度。每組隨機(jī)選取5只大鼠的切片觀(guān)察RGCs形態(tài)和RGCs層至外核層視網(wǎng)膜厚度，每張切片隨機(jī)選取5個(gè)視野，取平均值。

1.2.4逆行熒光金染色標(biāo)記法檢測(cè)視網(wǎng)膜RGCs密度 造模后第7天，各組中任意選取5只大鼠，將大鼠麻醉后剪開(kāi)顳側(cè)球結(jié)膜，剪斷外直肌，充分暴露視神經(jīng)，于球后2 mm處剪斷視神經(jīng)，將有熒光金染料的明膠海綿置于視神經(jīng)斷端。標(biāo)記40 h后，用水合氯醛腹腔內(nèi)注射處死大鼠，取出眼球，剝離視網(wǎng)膜，制備視網(wǎng)膜鋪片，將視網(wǎng)膜進(jìn)行4個(gè)象限的放射狀切開(kāi)，熒光倒置顯微鏡綠色光源下觀(guān)察熒光金標(biāo)記的RGCs并采集圖像。用Image-Pro-Plus6.0分析系統(tǒng)計(jì)算RGCs密度(個(gè)/mm2)。每個(gè)視網(wǎng)膜標(biāo)本選取中心1、2和3 mm處4個(gè)象限共12個(gè)200倍視野進(jìn)行RGCs密度計(jì)算，取平均值。

1.2.5TUNEL染色法檢測(cè)視網(wǎng)膜RGCs凋亡情況 取1.2.3部分制作的各組5只大鼠視網(wǎng)膜石蠟切片常規(guī)方法脫水，每張切片滴加50 μl體積分?jǐn)?shù)3%過(guò)氧化物酶阻斷劑，室溫孵育10 min，去離子水沖洗3遍，蛋白酶K于濕盒中室溫孵育30 min，磷酸鹽緩沖液(phosphate buffer saline，PBS)漂洗2次，每次3 min；滴加50 μl TUNEL反應(yīng)液，濕盒中室溫孵育1 h，PBS漂洗3次，每次3 min；滴加50 μl conberter-POD，濕盒中室溫孵育1 h，PBS漂洗3次。每次3 min。滴加100 μl BAD溶液，室溫孵育10 min，PBS漂洗3次，每次3 min，蘇木素復(fù)染，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹(shù)膠封片。正常RGCs核染色呈藍(lán)色，凋亡RGCs核染色呈棕黃色。于光學(xué)顯微鏡下觀(guān)察并拍照，每張切片中任意選取5個(gè)200倍視野，應(yīng)用Image-Pro-Plus6.0分析系統(tǒng)計(jì)數(shù)TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞和正常細(xì)胞，取平均值，計(jì)算RGCs凋亡率=TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)/正常細(xì)胞數(shù)×100%。

1.2.6大鼠視網(wǎng)膜組織中SOD活性、MDA和NO濃度檢測(cè) 于造模后第7天，各組中任意選取5只大鼠，過(guò)量麻醉法處死后，摘取實(shí)驗(yàn)眼并分離出視網(wǎng)膜組織。取視網(wǎng)膜組織，加入視網(wǎng)膜組織質(zhì)量5～10倍體積提取液進(jìn)行冰浴勻漿制成細(xì)胞懸液，離心半徑為3 cm，3 000 r/min離心20 min，取上清液。(1)SOD活性測(cè)定 取3 μl視網(wǎng)膜組織上清液用PBS稀釋至150 μl，參照SOD活性檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)配制試劑，將試劑與待測(cè)樣本混勻，37 ℃孵育20 min，BCA法測(cè)定蛋白質(zhì)含量，應(yīng)用酶標(biāo)儀于589 nm波長(zhǎng)處測(cè)吸光度(A)值，計(jì)算SOD活性(U/L，U為商品單位)，SOD活性=[(A待測(cè)樣本-A空白對(duì)照)×標(biāo)準(zhǔn)品濃度×24]/[(A標(biāo)準(zhǔn)品-A空白對(duì)照)×待測(cè)樣本蛋白濃度×50]。(2)MDA摩爾濃度測(cè)定 取5 μl視網(wǎng)膜組織上清液用PBS稀釋到10 μl，按照MDA試劑盒說(shuō)明書(shū)配置試劑，將試劑與待測(cè)樣本混勻，95 ℃水浴40 min，流水冷卻，離心半徑為3cm，3 000 r/min離心10 min取上清液，BCA法測(cè)定蛋白質(zhì)含量，應(yīng)用酶標(biāo)儀于530 nm波長(zhǎng)處檢測(cè)A值，計(jì)算MDA摩爾濃度(μmol/L)，MDA摩爾濃度=[(A待測(cè)樣本-A空白對(duì)照)×標(biāo)準(zhǔn)品摩爾濃度×2]/[(A標(biāo)準(zhǔn)品-A空白對(duì)照)×待測(cè)樣本蛋白濃度]。(3)NO摩爾濃度測(cè)定 取5μl視網(wǎng)膜組織上清液，按照NO試劑盒說(shuō)明書(shū)配置試劑，將試劑與待測(cè)樣本混勻，檢測(cè)589 nm波長(zhǎng)處A值，計(jì)算NO含量(μmoL/L)，NO摩爾濃度=140×(A589+0.010 3)。

1.2.7Western blot法檢測(cè)大鼠視網(wǎng)膜組織細(xì)胞質(zhì)Nrf2、HO-1、NQO1以及細(xì)胞核Nrf2蛋白表達(dá) 取1.2.6部分收集的視網(wǎng)膜組織，用預(yù)冷去離子水沖洗，濾紙吸干水分，置于液氮中迅速冷凍，后轉(zhuǎn)移至超低溫冰箱凍存。取凍存的大鼠視網(wǎng)膜組織標(biāo)本，加入5～10倍體積的提取液進(jìn)行冰浴勻漿，10 000×g，4℃離心15 min，取上清，置冰上待測(cè)。3 000 r/min離心3 min(離心半徑為3 cm)，收集沉淀，加入200 μl蛋白抽提試劑，高速渦旋使細(xì)胞沉淀分散成單細(xì)胞懸液，3 000 r/min離心10 min(離心半徑3 cm)，上清液中即為細(xì)胞質(zhì)蛋白，采用凍干儀對(duì)上清液蛋白進(jìn)行濃縮，按照核蛋白提取試劑盒說(shuō)明書(shū)步驟，加入200 μl核蛋白提取試劑，高速渦旋30 s，3 000 r/min離心10 min(離心半徑為3 cm)，上清液中即為核蛋白。BCA法測(cè)定蛋白濃度。取蛋白上清液進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳后，再電轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，用質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.5%的脫脂乳粉PBS溶液室溫封閉1 h，充分洗滌后分別加入Nrf2(1∶ 1 000)、HO-1(1∶ 1 000)、NQO1(1∶ 1 000)一抗4 ℃孵育過(guò)夜，PBS洗滌3次，每次3 min；加入相應(yīng)二抗(1∶ 5 000)常溫孵育30 min，ECL顯色，細(xì)胞質(zhì)蛋白以GAPDH為內(nèi)參，細(xì)胞核蛋白以H3為內(nèi)參，采用ImageJ軟件分析各蛋白條帶灰度，計(jì)算各目的蛋白相對(duì)表達(dá)量。每組實(shí)驗(yàn)獨(dú)立重復(fù)3次。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料經(jīng)Shapiro-Wilk檢驗(yàn)呈正態(tài)分布，以mean±SD表示，組間資料經(jīng)Levene檢驗(yàn)證實(shí)方差齊性。各組間不同指標(biāo)總體差異比較采用單因素方差分析，多重比較采用LSD-t檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠視網(wǎng)膜組織病理學(xué)表現(xiàn)

正常對(duì)照組大鼠視網(wǎng)膜組織中RGCs排列緊密，核邊界清晰；模型組大鼠RGCs排列疏松不規(guī)則，部分細(xì)胞核出現(xiàn)溶解或破碎樣；牡荊苷組大鼠視網(wǎng)膜中RGCs異常程度較模型組減輕(圖1)。正常對(duì)照組、模型組和牡荊苷組視網(wǎng)膜厚度分別為(128.20±5.31)、(90.21±3.55)和(119.65±6.14)μm，各組視網(wǎng)膜厚度總體比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=8.344，P=0.011)；其中模型組大鼠視網(wǎng)膜厚度明顯低于正常對(duì)照組和牡荊苷組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

圖1 各組大鼠造模后7 d視網(wǎng)膜組織病理學(xué)表現(xiàn)(HE ×200，標(biāo)尺=50 μm) 正常對(duì)照組大鼠視網(wǎng)膜組織中RGCs排列緊密，核邊界清晰，模型組大鼠RGCs排列疏松不規(guī)則，部分細(xì)胞核出現(xiàn)溶解或破碎樣，牡荊苷組大鼠視網(wǎng)膜中RGCs異常程度較模型組減輕A：正常對(duì)照組 B：模型組 C：牡荊苷組 GCL：神經(jīng)節(jié)細(xì)胞層；IPL：內(nèi)叢狀層；INL：內(nèi)核層；OPL：外網(wǎng)狀層；ONL：外核層Figure 1 Histopathological manifestations of rat retina in each group at 7 days after modeling(HE ×200,scale bar=50 μm) RGCs in the normal control group were tightly arranged with clear nuclear boundaries,while the RGCs in the model group were arranged loosely and irregularly,and some of the nuclei were dissolved or broken,and the abnormality of RGCs in the vitexin group was alleviated A:normal control group B:model group C:vitexin group GCL:ganglion cell layer;IPL:inner plexiform layer;INL:inner nuclear layer;OPL:outer plexiform layer;ONL:outer nuclear layer

2.2 各組大鼠視網(wǎng)膜RGCs數(shù)量比較

視網(wǎng)膜逆行熒光金標(biāo)記結(jié)果顯示，在造模后7 d，正常對(duì)照組、模型組和牡荊苷組大鼠視網(wǎng)膜單位面積RGCs數(shù)量分別為(2 330.12±15.05)、(1 300.85±14.00)和(1 921.64±11.78)個(gè)/mm2，總體比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=21.034，P<0.001)；模型組單位面積RGCs數(shù)量低于正常對(duì)照組和牡荊苷組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)；牡荊苷組大鼠視網(wǎng)膜RGCs單位面積數(shù)量與正常對(duì)照組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)(圖2)。

圖2 各組大鼠造模后7 d視網(wǎng)膜RGCs數(shù)量(熒光金 ×200，標(biāo)尺=50 μm)A：正常對(duì)照組大鼠RGCs分布密集 B：模型組大鼠RGCs分布稀疏 C：牡荊苷組大鼠RGCs數(shù)量較模型組有所增加 D：各組大鼠RGCs數(shù)量量化比較 F=21.034，P<0.001.與正常對(duì)照組比較，aP<0.05；與模型組比較，bP<0.05(單因素方差分析，LSD-t檢驗(yàn)，n=5)1：正常對(duì)照組；2：模型組；3：牡荊苷組 RGCs：視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞Figure 2 The number of RGCs in different groups at 7 days after modeling(Fluoro-Gold ×200,scale bar=50 μm)A:The distribution of RGCs in the retina of rats in the control group was dense B:The distribution of RGCs in the model group was sparse C:The number of RGCs was increased in the vitexin group in comparison with the model group D:Quantitative comparison of the number of RGCs among different groups F=21.034,P<0.001.Compared with the normal control group,aP<0.05;compared with the model group,bP<0.05 (One-way ANOVA,LSD-t test,n=5) 1：normal control group；2：model group；3：vitexin group RGCs:retinal ganlion cells

2.3 各組大鼠TUNEL陽(yáng)性RGCs比率比較

造模后7 d，正常對(duì)照組大鼠視網(wǎng)膜組織TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量較少，模型組存在大量TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞，牡荊苷組TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)較模型組有所減少。正常對(duì)照組、模型組和牡荊苷組TUNEL陽(yáng)性RGCs比率分別為(3.01±0.18)%、(68.34±5.04)%和(35.51±2.04)%，總體比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=30.205，P<0.001)。模型組TUNEL陽(yáng)性RGCs比率明顯高于正常對(duì)照組和牡荊苷組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)(圖3)。

圖3 各組大鼠造模后7 d RGCs凋亡情況(TUNEL ×200，標(biāo)尺=50 μm)A：正常對(duì)照組大鼠視網(wǎng)膜組織TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞(箭頭)數(shù)量較少 B：模型組大鼠視網(wǎng)膜組織中存在大量TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞(箭頭) C：牡荊苷組大鼠視網(wǎng)膜組織TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞(箭頭)數(shù)量較模型組有所減少 D：各組大鼠RGCs凋亡率量化比較 F=30.205，P<0.001.與正常對(duì)照組比較，aP<0.05；與模型組比較，bP<0.05(單因素方差分析，LSD-t檢驗(yàn)，n=5)1：正常對(duì)照組；2：模型組；3：牡荊苷組 RGCs：視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞Figure 3 The TUNEL positive RGCs among different groups at 7 days after modeling(TUNEL ×200,scale bar=50 μm)A:The number of TUNEL positive cells (arrow) in retina of the control group was small B:The number of TUNEL positive cells (arrow) in the retina of model group was large C:The number of TUNEL positive cells (arrow) in the vitexin group was smaller than that in the model group D:Quantitative comparison of rat RGCs apoptosis rate among different groups F=30.205,P<0.001.Compared with the normal control group,aP<0.05;compared with the model group,bP<0.05(One-way ANOVA,LSD-t test,n=5) 1：normal control group；2：model group；3：vitexin group RGCs:retinal ganglion cells

2.4 各組大鼠視網(wǎng)膜組織中氧化應(yīng)激反應(yīng)指標(biāo)表達(dá)比較

造模后7 d，正常對(duì)照組、模型組和牡荊苷組大鼠視網(wǎng)膜中SOD活性及MDA、NO摩爾濃度總體比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=11.054、5.347、15.021，均P<0.001)。模型組大鼠視網(wǎng)膜組織中SOD活性低于正常對(duì)照組和牡荊苷組，MDA和NO摩爾濃度高于正常對(duì)照組和牡荊苷組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)(表1)。

表1 各組大鼠視網(wǎng)膜SOD活性、MDA和NO濃度比較(mean±SD)Table 1 Comparison of SOD activity,MDA and NO concentration among different groups (mean±SD)組別樣本量SOD活性(U/L)MDA濃度(μmol/L)NO濃度(μmol/L)正常對(duì)照組5152.35±13.245.11±0.5414.34±1.61模型組5106.44±11.32a8.69±0.76a35.68±1.95a牡荊苷組5133.25±10.36ab6.08±0.52ab18.36±1.02abF值11.0545.34715.021P值<0.001<0.001<0.001 注:與正常對(duì)照組比較,aP<0.05;與模型組比較,bP<0.05(單因素方差分析,LSD-t檢驗(yàn)) SOD:超氧化物歧化酶;MDA:丙二醛;NO:一氧化氮 Note:Compared with the normal control group,aP<0.05;compared with the model group,bP<0.05(One-way ANOVA,LSD-t test) SOD:su-peroxide dismutase;MDA:malondialdehyde;NO:nitric oxide

2.5 各組大鼠視網(wǎng)膜組織中Nrf2信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)比較

造模后7 d，正常對(duì)照組大鼠視網(wǎng)膜組織細(xì)胞質(zhì)Nrf2蛋白條帶灰度在3個(gè)組中最強(qiáng)，HO-1、NQO1和細(xì)胞核Nrf2蛋白條帶灰度在3個(gè)組中最弱；牡荊苷組細(xì)胞質(zhì)Nrf2蛋白條帶灰度在3個(gè)組中最弱，HO-1、NQO1和細(xì)胞核Nrf2蛋白條帶灰度在3個(gè)組中最強(qiáng)。正常對(duì)照組、模型組和牡荊苷組大鼠視網(wǎng)膜中細(xì)胞質(zhì)Nrf2、HO-1、NQO1和細(xì)胞核Nrf2蛋白相對(duì)表達(dá)量總體比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=8.579、6.347、10.523、12.021，均P<0.001)。模型組大鼠視網(wǎng)膜組織中細(xì)胞質(zhì)Nrf2蛋白相對(duì)表達(dá)量明顯低于正常對(duì)照組，HO-1、NQO1和細(xì)胞核Nrf2蛋白相對(duì)表達(dá)量高于正常對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)；牡荊苷組大鼠視網(wǎng)膜組織中細(xì)胞質(zhì)Nrf2蛋白相對(duì)表達(dá)量明顯低于模型組和正常對(duì)照組，HO-1、NQO1和細(xì)胞核Nrf2蛋白相對(duì)表達(dá)量明顯高于模型組和正常對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)(圖4，表2)。

圖4 Western blot檢測(cè)各組大鼠視網(wǎng)膜細(xì)胞質(zhì)Nrf2、HO-1、NQO1及細(xì)胞核Nrf2蛋白表達(dá)1：正常對(duì)照組；2：模型組；3：牡荊苷組 Nrf2：核因子E2相關(guān)因子2；HO-1：血紅素加氧酶-1；NQO1：醌氧化還原酶1；GAPDH：甘油醛-3-磷酸脫氫酶Figure 4 The expression of cytoplasm Nrf2,HO-1,NQO1 and nucleus Nrf2 protein in the retina of rats in three groups by Western blot1:normal control group;2:model group;3:vitexin group Nrf2:nuclear factor E2-related factor 2;HO-1:heme oxygenase-1;NQO1:quinone oxidoreductase 1;GAPDH:glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase

表2 各組大鼠視網(wǎng)膜Nrf2、HO-1、NQO1蛋白相對(duì)表達(dá)量比較(mean±SD)Table 2 Comparison of Nrf2,HO-1 and NQO1 protein relative expression in the retina of rats among the three groups (mean±SD)組別樣本量細(xì)胞質(zhì)Nrf2HO-1NQO1細(xì)胞核Nrf2正常對(duì)照組50.85±0.110.38±0.080.28±0.050.21±0.05模型組50.59±0.07a0.62±0.10a0.68±0.08a0.52±0.09a牡荊苷組50.24±0.04ab0.91±0.12ab0.86±0.09ab0.83±0.14abF值8.5796.34710.52312.021P值<0.001<0.001<0.001<0.001 注:與正常對(duì)照組比較,aP<0.05;與模型組比較,bP<0.05(單因素方差分析,LSD-t檢驗(yàn));Nrf2:核因子E2相關(guān)因子2;HO-1:血紅素加氧酶-1;NQO1:醌氧化還原酶1 Note:Compared with the normal control group,aP<0.05;compared with the model group,bP<0.05 (One-way ANOVA,LSD-t test);Nrf2:nuclear factor E2-related factor 2;HO-1:heme oxygenase-1;NQO1:quinone oxidoreductase 1

3 討論

視網(wǎng)膜是一種高度分化的神經(jīng)組織，其內(nèi)層組織供血來(lái)自視網(wǎng)膜中央動(dòng)脈，對(duì)缺氧、缺血非常敏感。視網(wǎng)膜富含不飽和脂肪酸，易受自由基攻擊，當(dāng)視網(wǎng)膜缺血時(shí)，氧自由基大量積聚，過(guò)量的自由基使組織內(nèi)不飽和脂肪酸過(guò)氧化，形成脂質(zhì)過(guò)氧化產(chǎn)物，繼而破壞線(xiàn)粒體功能，導(dǎo)致RGCs的變性和凋亡，損害視網(wǎng)膜組織結(jié)構(gòu)和功能[8-9]。SOD是機(jī)體抗氧化防御體系中最重要的自由基清除酶之一，可緩解機(jī)體氧化應(yīng)激損傷[10]。MDA作為自由基與不飽和脂肪酸發(fā)生脂質(zhì)過(guò)氧化時(shí)的主要代謝產(chǎn)物，其濃度反映了機(jī)體遭受自由基攻擊的嚴(yán)重程度[11]。NO是精氨酸在一氧化氮合酶催化下生成的內(nèi)源性產(chǎn)物，過(guò)量的NO和組織中超氧化陰離子反應(yīng)，生成氧化能力強(qiáng)的ONOO-，進(jìn)而損傷DNA，誘導(dǎo)RGCs凋亡[12]。本研究應(yīng)用前房灌注方法建立大鼠RIR動(dòng)物模型，模型組大鼠視網(wǎng)膜內(nèi)層厚度和RGCs數(shù)量較正常對(duì)照組減少，RGCs凋亡率增加，SOD活性下降，MDA和NO濃度較正常對(duì)照組增加，說(shuō)明大鼠RIR動(dòng)物模型建立成功。

牡荊苷屬于黃酮類(lèi)化合物，是金蓮花、紅草等的主要藥效成分，其在多種情況下對(duì)氧化應(yīng)激損傷有調(diào)控作用。劉磊等[6]研究證實(shí)，牡荊苷可減輕急性腦缺血-再灌注大鼠氧化應(yīng)激反應(yīng)造成的腦組織損傷；Nurdiana等[13]報(bào)道，牡荊苷可緩解糖尿病大鼠腦組織的氧化應(yīng)激損傷；Xie等[14]報(bào)道，牡荊苷能減輕骨關(guān)節(jié)炎大鼠內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激引發(fā)的軟骨細(xì)胞凋亡和相關(guān)炎癥，并抑制軟骨變性。然而牡荊苷是否對(duì)RIR具有調(diào)控作用，目前報(bào)道較少。本研究采用腹腔內(nèi)注射牡荊苷治療RIR模型大鼠，結(jié)果顯示，牡荊苷能顯著改善模型大鼠視網(wǎng)膜厚度，減少RGCs凋亡，恢復(fù)RGCs數(shù)量，同時(shí)，牡荊苷能上調(diào)大鼠視網(wǎng)膜組織內(nèi)SOD活性，降低MDA和NO濃度，提示牡荊苷能緩解RIR引起的RGCs損傷，這種作用可能是通過(guò)上調(diào)視網(wǎng)膜組織抗氧化應(yīng)激能力而實(shí)現(xiàn)的。

為了進(jìn)一步探討牡荊苷緩解RIR氧化應(yīng)激損傷的作用機(jī)制，本研究檢測(cè)了其對(duì)視網(wǎng)膜組織中Nrf2信號(hào)通路活性的影響。Nrf2是一種與細(xì)胞自我保護(hù)相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子，其介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在抗氧化應(yīng)激過(guò)程中發(fā)揮重要作用。在應(yīng)激情況下，Nrf2位于細(xì)胞質(zhì)內(nèi)，與Keap1結(jié)合，并介導(dǎo)Nrf2的快速泛素化和隨后的降解；在細(xì)胞受到ROS攻擊后，Nrf2被解偶聯(lián)而轉(zhuǎn)位至細(xì)胞核，與ARE結(jié)合，啟動(dòng)下游抗氧化相關(guān)基因HO-1、NQO1等的轉(zhuǎn)錄，最終起到抗氧化應(yīng)激損傷的作用[15-16]。Hui等[17]報(bào)道，Keap1-Nrf2小分子抑制劑能激活視網(wǎng)膜中Nrf2，對(duì)視網(wǎng)膜缺血性損傷有保護(hù)作用；Xu等[18]研究證實(shí)Nrf2激活劑對(duì)RIR視神經(jīng)損傷有保護(hù)作用。已有研究證實(shí)牡荊苷對(duì)氧化應(yīng)激條件下Nrf2通路有調(diào)控作用。Lu等[19]發(fā)現(xiàn)，牡荊苷能通過(guò)控制Nrf2通路減輕脂多糖誘導(dǎo)的急性肺損傷；劉磊等[6]證實(shí)牡荊苷對(duì)急性腦缺血-再灌注大鼠氧化應(yīng)激反應(yīng)的減輕作用與Nrf2信號(hào)通路調(diào)控有關(guān)。本研究結(jié)果顯示，模型組大鼠視網(wǎng)膜組織中細(xì)胞質(zhì)Nrf2蛋白表達(dá)低于正常對(duì)照組，而細(xì)胞核Nrf2表達(dá)高于正常對(duì)照組，下游HO-1和NQO1蛋白表達(dá)也高于正常對(duì)照組，說(shuō)明在RIR條件下，視網(wǎng)膜組織中Nrf2通路活化，抗氧化應(yīng)激系統(tǒng)啟動(dòng)；同時(shí)，牡荊苷組大鼠視網(wǎng)膜組織細(xì)胞核Nrf2表達(dá)及其下游HO-1和NQO1蛋白表達(dá)較模型組進(jìn)一步增加，而細(xì)胞質(zhì)Nrf2表達(dá)較模型組進(jìn)一步降低，提示牡荊苷能活化Nrf2信號(hào)通路，從而增加機(jī)體抗氧化應(yīng)激損傷的能力。本研究存在一些不足，如采用視網(wǎng)膜組織染色切片的方法來(lái)測(cè)量視網(wǎng)膜厚度，未嚴(yán)格固定測(cè)量部位，測(cè)量準(zhǔn)確度不高，后續(xù)研究中將采用OCT儀器對(duì)固定部位進(jìn)行視網(wǎng)膜厚度測(cè)量。

綜上所述，牡荊苷能緩解RIR模型大鼠RGCs損傷，降低RGCs凋亡率，這一作用可能是通過(guò)激活Nrf2相關(guān)通路，提高視網(wǎng)膜組織抗氧化應(yīng)激活性而實(shí)現(xiàn)的。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突