陳 爽，張全兵*，周 云，王 鋒，劉阿英，黃鵬鵬，徐齊宇，徐元宏

臨床上膝關(guān)節(jié)損傷十分常見，在損傷發(fā)生后常常需要對膝關(guān)節(jié)進(jìn)行伸直位或功能位固定。如果固定時間或方式的不當(dāng)，常常會導(dǎo)致膝關(guān)節(jié)伸直型攣縮，主要表現(xiàn)為膝關(guān)節(jié)的最大屈曲角度變小，使關(guān)節(jié)的屈曲活動受限。研究表明，關(guān)節(jié)攣縮形成的主要病理改變，體現(xiàn)在滑膜關(guān)節(jié)的萎縮、變性和粘連，在此之間，關(guān)節(jié)囊的纖維化在整個疾病進(jìn)程中扮演了極為重要的角色。關(guān)節(jié)囊纖維化過程中涉及了多種細(xì)胞因子，并在調(diào)控細(xì)胞外基質(zhì)的沉積和蛋白水平等方面發(fā)揮了關(guān)鍵作用，其致纖維化作用是近些年來研究的熱點。

目前在臨床上，關(guān)節(jié)攣縮發(fā)生后常采用超短波等物理因子治療手段促進(jìn)關(guān)節(jié)功能的恢復(fù)，但對其在治療過程中的作用機制所知甚少。該研究通過建立兔伸直型膝關(guān)節(jié)攣縮模型，采用超短波療法進(jìn)行干預(yù)，旨在研究超短波療法對于兔伸直型膝關(guān)節(jié)攣縮的治療效果，并對關(guān)節(jié)攣縮發(fā)生后關(guān)節(jié)囊纖維化的發(fā)生機制進(jìn)行初步探討。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

該實驗方案經(jīng)安徽醫(yī)科大學(xué)機構(gòu)動物護(hù)理與使用委員會批準(zhǔn)，在實驗過程中對新西蘭白兔給予了人文關(guān)懷。本研究初期共使用32只雄性骨骼成熟新西蘭白兔，3～4個月齡，體質(zhì)量2～2.5 kg，購自安徽醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心。將兔單獨飼養(yǎng)在60 cm×50 cm×40 cm籠內(nèi)，在24 ℃的環(huán)境溫度下進(jìn)行12 h的明-暗循環(huán)，允許籠內(nèi)自由活動并獲取水和食物。采用隨機數(shù)字表法將這32只兔隨機均分為4組：空白對照組(O組)、單純固定組(P組)、自然恢復(fù)組(N組)、超短波治療組(M組)。

1.2 干預(yù)方法

1.2.1

模型制備與固定 模型制備前需對所有兔均靜脈注射戊巴比妥鈉麻醉(30 mg/kg)。在O組中，兔左膝關(guān)節(jié)未進(jìn)行固定并飼養(yǎng)12周。在P組中，兔左膝關(guān)節(jié)進(jìn)行8周管形石膏固定以形成左側(cè)膝關(guān)節(jié)攣縮，如文獻(xiàn)報道使用的方法，采用電動剃毛刀自左腹股溝到足趾近端剃除體毛，爾后左膝關(guān)節(jié)完全伸直、左踝關(guān)節(jié)跖屈60°，綿紙2～3層包裹后按照石膏固定操作方法自左腹股溝至足趾部，注意留出足趾遠(yuǎn)端以觀察末梢血運(圖1)。在N組中，兔左膝關(guān)節(jié)進(jìn)行8周管形石膏固定以形成左側(cè)膝關(guān)節(jié)攣縮，隨后拆除石膏進(jìn)行為期4周的自然恢復(fù)。在M組中，兔左膝關(guān)節(jié)進(jìn)行8周管形石膏固定，隨后拆除石膏進(jìn)行為期4周的超短波治療。

圖1 膝關(guān)節(jié)攣縮模型的制備

1.2.2

超短波治療 設(shè)備預(yù)熱后，將每只需要接受超短波治療的新西蘭白兔放置在絕緣的木桌上，選擇電極對置法，將左下肢暴露于超短波治療設(shè)備的電極中。劑量調(diào)整為微熱量，并將治療時間設(shè)置為15 min，每日1次。

1.3 實驗補充

本次實驗過程中共出現(xiàn)2只新西蘭兔計劃外死亡，分別發(fā)生在實驗第3日的P組和第15天的N組。將尸體交由校實驗動物中心處理，兩組各補充1只新西蘭兔，按各組實驗方法進(jìn)行同樣規(guī)格的麻醉與模型制備，并按照各組要求進(jìn)行相應(yīng)時長的固定和干預(yù)。因此本次實驗中實際使用新西蘭兔34只。

1.4 肌切開術(shù)后關(guān)節(jié)活動度的測量

在每個時間點末，所有新西蘭兔被過量的戊巴比妥鈉安樂死。兔后肢在左髖關(guān)節(jié)處被脫位，并切斷髖關(guān)節(jié)處大腿肌群的起始點，完全剝離左下肢。參考文獻(xiàn)報道的方法，利用關(guān)節(jié)活動度測量儀測量肌切開術(shù)后的左膝關(guān)節(jié)活動度(圖2)。

1.5 膝關(guān)節(jié)后方關(guān)節(jié)囊Masson染色

關(guān)節(jié)活動度測量后，取膝關(guān)節(jié)后方關(guān)節(jié)囊，平均分為兩份。一份用4%多聚甲醛固定，留做Masson染色，另一份立即經(jīng)液氮轉(zhuǎn)移置入-70 ℃冰箱中保存，用于半定量RT-PCR和Western blot檢測。固定的關(guān)節(jié)囊脫水、透明、石蠟包埋。制作5 μm切片、粘片、烤片過夜，保存至4 ℃環(huán)境中。分別采用Masson復(fù)合染色液(試劑A)、磷鉬酸、苯胺藍(lán)染色，分化后脫水、透明、封固。采集圖像完成后，Image Proplus 2.0測定陽性區(qū)域(藍(lán)色)面積所占的百分比，計算平均值，以此作為膠原沉積的衡量指標(biāo)。

圖2 測量膝關(guān)節(jié)在切除所有肌肉后的活動度

1.6 半定量RT-PCR法檢測關(guān)節(jié)囊轉(zhuǎn)化生長因子β1(transforming growth factor β1, TGF-β1)與結(jié)締組織生長因子(connective tissue growth factor, CTGF)的mRNA表達(dá)

利用TRIzol試劑提取總RNA，按RT-PCR試劑盒說明書進(jìn)行cDNA的合成，以此cDNA為模板進(jìn)行PCR反應(yīng)。產(chǎn)物經(jīng)質(zhì)量分?jǐn)?shù)2%瓊脂糖凝膠電泳，凝膠成像系統(tǒng)攝像，進(jìn)行吸光度(A)值掃描，并進(jìn)行相對量分析，用目的因子與β-actin條帶吸光度相比表示相對灰度值。TGF-β1上游引物為5′-AGGAAGGAGGGCTGGAACA-3′,下游引物為5′-CCATCTACGAGGGCTACGC-3′;CTGF上游引物為5′-ACAAGGGACTCTTCTGTGACTTCGG-3′,下游引物為5′-CCAGGCAGTTGGCTCGCATC-3′。

1.7 Western blot法檢測TGF-β1、CTGF的蛋白表達(dá)

制備組織勻漿，離心取上清液，所有操作均在低溫條件下進(jìn)行?？捡R斯亮藍(lán)蛋白定量后，上清液分裝于離心管中并靜置于-70 ℃環(huán)境中。安裝電泳槽，待測蛋白與低分子量標(biāo)準(zhǔn)蛋白各加樣10 μl，采用5%濃縮膠和12%的分離膠進(jìn)行SDS-PAGE。結(jié)束后刮掉濃縮膠，進(jìn)行染色，90伏特低溫下電轉(zhuǎn)移3 h，4 ℃封閉過夜；加入特異性識別抗體一抗，TGF-β1稀釋比例為1∶500，CTGF稀釋比例為1∶200，37 ℃緩慢搖動1 h，再次封閉過夜，棄除抗體液，緩沖液搖動漂洗NC膜3次×10 min/次。加入堿性磷酸酶標(biāo)記的山羊抗兔抗體二抗，TGF-β1 1∶100稀釋，CTGF 1∶5 000稀釋，37 ℃緩慢搖動2 h，作用結(jié)束后棄除，以1×TBS緩沖液搖動漂洗NC膜3次×5 min/次。

2 結(jié)果

2.1 肌切開術(shù)后膝關(guān)節(jié)活動度

O、P、N、M組的肌切開術(shù)后膝關(guān)節(jié)活動度分別為(140.73±4.02)°、(85.12±1.56)°、(85.52±2.45)°、(89.56±2.57)°。各組間比較

F

=776.01，總體組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義(

P

<0.05)，兩兩比較除P與N組外各組間的差異有統(tǒng)計學(xué)意義(

P

<0.05)。P、N、M組肌切開術(shù)后膝關(guān)節(jié)活動度均小于O組(

P

<0.05)；P組與N組肌切開術(shù)后膝關(guān)節(jié)活動度均小于M組(

P

<0.05)，P組與N組肌切開術(shù)后膝關(guān)節(jié)活動度無明顯差異。

2.2 膝關(guān)節(jié)后方關(guān)節(jié)囊膠原蛋白百分比

如圖3所示，O、P、N、M組的膠原百分比分別為(19.50±1.70)%、(44.13±2.48)%、(41.14±2.03)%、(37.39±1.94)%。各組間比較

F

=347.26，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(

P

<0.05)。P、N、M組膠原百分比均大于O組(

P

<0.05)；P組膠原百分比大于N組和M組(

P

<0.05)；N組膠原百分比大于M組(

P

<0.05)。

圖3 各組膝關(guān)節(jié)后方關(guān)節(jié)囊Masson染色 ×400

2.3 TGF-β1的mRNA表達(dá)

4組兔膝關(guān)節(jié)后方關(guān)節(jié)囊TGF-β1 mRNA相對表達(dá)情況見圖4，各組間比較

F

=957.00，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(

P

<0.05)。O組膝關(guān)節(jié)后方關(guān)節(jié)囊TGF-β1的mRNA水平小于P、N、M組(

P

<0.05)；P組膝關(guān)節(jié)后方關(guān)節(jié)囊TGF-β1的mRNA水平大于N組、M組(

P

<0.05)；N組膝關(guān)節(jié)后方關(guān)節(jié)囊TGF-β1的mRNA水平大于M組(

P

<0.05)。

圖4 兔膝關(guān)節(jié)后方關(guān)節(jié)囊TGF-β1 mRNA的相對表達(dá)量

2.4 TGF-β1的蛋白表達(dá)

4組兔膝關(guān)節(jié)后方關(guān)節(jié)囊TGF-β1蛋白相對表達(dá)量情況見圖5，各組間比較

F

=699.36，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(

P

<0.05)。O組膝關(guān)節(jié)后方關(guān)節(jié)囊TGF-β1的蛋白表達(dá)水平小于P、N、M組(

P

<0.05)；P組膝關(guān)節(jié)后方關(guān)節(jié)囊TGF-β1的蛋白表達(dá)水平大于N、M組(

P

<0.05)；N組膝關(guān)節(jié)后方關(guān)節(jié)囊TGF-β1的蛋白表達(dá)水平大于M組(

P

<0.05)。

圖5 兔膝關(guān)節(jié)后方關(guān)節(jié)囊后方關(guān)節(jié)囊TGF-β1的蛋白質(zhì)表達(dá)水平

2.5 CTGF的mRNA表達(dá)水平

4組兔膝關(guān)節(jié)后方關(guān)節(jié)囊CTGF mRNA相對表達(dá)情況見圖6，各組間比較

F

=931.22，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(

P

<0.05)。O組膝關(guān)節(jié)后方關(guān)節(jié)囊CTGF的mRNA表達(dá)水平小于P、N、M組(

P

<0.05)；N組膝關(guān)節(jié)后方關(guān)節(jié)囊CTGF的的mRNA表達(dá)水平大于P、M組(

P

<0.05)；P組膝關(guān)節(jié)后方關(guān)節(jié)囊CTGF的的mRNA表達(dá)水平低于N組和M組(

P

<0.05)。

圖6 兔膝關(guān)節(jié)后方關(guān)節(jié)囊CTGF mRNA的相對表達(dá)量

2.6 CTGF的蛋白表達(dá)

4組兔膝關(guān)節(jié)后方關(guān)節(jié)囊CTGF的蛋白相對表達(dá)量情況見圖7,各組間比較

F

=544.75，總體間差異有統(tǒng)計學(xué)意義(

P

<0.05)；除P組與N組外(

P

>0.05)，其余各組兩兩之間差異有統(tǒng)計學(xué)意義(

P

<0.05)；O組膝關(guān)節(jié)后方關(guān)節(jié)囊CTGF的蛋白表達(dá)水平小于P、N、M組(

P

<0.05)。

圖7 兔膝關(guān)節(jié)后方關(guān)節(jié)囊后方關(guān)節(jié)囊CTGF的蛋白相對表達(dá)量

3 討論

臨床上，關(guān)節(jié)損傷發(fā)生后接受長時間的不適當(dāng)外固定，且在此期間及之后未進(jìn)行系統(tǒng)科學(xué)的康復(fù)治療，易發(fā)生關(guān)節(jié)攣縮。其病理上表現(xiàn)出關(guān)節(jié)囊和關(guān)節(jié)周圍韌帶的纖維化以及骨骼肌的廢用性萎縮，進(jìn)而出現(xiàn)關(guān)節(jié)主動或被動活動度減低，給患者的日常生活活動和心理健康帶來了十分不利的影響。在關(guān)節(jié)囊纖維化的形成過程中，有關(guān)研究表明關(guān)節(jié)囊產(chǎn)生了多種促纖維化顆粒，包括有TGF-β1、CTGF以及其他多種細(xì)胞因子和酶類等，且TGF-β1、CTGF存在著相互作用的關(guān)系。

本研究將空白對照組與單純固定組進(jìn)行對比，隨著固定8周后關(guān)節(jié)攣縮的形成，單純固定組在出現(xiàn)肌切開術(shù)后膝關(guān)節(jié)活動度下降、膝關(guān)節(jié)后方關(guān)節(jié)囊Masson染色膠原百分比明顯地增加，在證明利用長時間固定制備兔膝關(guān)節(jié)關(guān)節(jié)攣縮的可行性的同時，TGF-β1與CTGF的mRNA、蛋白表達(dá)水平也出現(xiàn)相應(yīng)升高，證實了TGF-β1、CTGF與膝關(guān)節(jié)攣縮發(fā)生的相關(guān)性，關(guān)節(jié)攣縮的形成伴隨著TGF-β1與CTGF的高表達(dá)。

在單純固定組與自然恢復(fù)組間對比中，TGF-β1、CTGF的mRNA水平與TGF-β1的蛋白表達(dá)水平均表現(xiàn)為單純固定組顯著高于自然恢復(fù)組，肌切開術(shù)后膝關(guān)節(jié)活動度無明顯差異，而CTGF的蛋白水平卻表現(xiàn)為自然恢復(fù)組大于單純固定組。Mori et al向鼠的皮下單獨注入TGF-β1，僅僅產(chǎn)生了短暫可逆的肉芽組織，連續(xù)注射7 d后肉芽組織消失并且無纖維化組織形成。單獨的外源性CTGF注射同樣不能產(chǎn)生持久的纖維化。然而，同時注射這兩種細(xì)胞因子則導(dǎo)致了持續(xù)兩周以上的纖維化組織形成。Takehara的小鼠持續(xù)纖維化模型則提示在病變初期未觀察到CTGF mRNA的表達(dá)，而在纖維化的末期，可觀察到其水平有明顯上升，TGF-β1的觀察結(jié)果顯示其表達(dá)會隨著固定時間的延長而逐漸下降。表明組織纖維化前期主要由TGF-β1誘導(dǎo)，而中期CTGF發(fā)揮輔助作用并維持組織纖維化。本實驗中的結(jié)果恰好與該觀念相互驗證，提示：① 關(guān)節(jié)攣縮一旦形成后，關(guān)節(jié)囊纖維化恢復(fù)進(jìn)展較慢，至少在本研究中4周的自然恢復(fù)期不足以使其肌切開術(shù)后膝關(guān)節(jié)活動度表現(xiàn)出差異；② TGF-β1作用時間為關(guān)節(jié)攣縮進(jìn)展的前期，隨著時間的推移水平會逐漸下降；③ CTGF的基因表達(dá)和蛋白表達(dá)量表達(dá)不成絕對相關(guān)性；④ CTGF的翻譯表達(dá)蛋白復(fù)雜且歷時較長；⑤ CTGF在維持?jǐn)伩s形成的進(jìn)程中作用持久。較為遺憾的是本實驗未能設(shè)置固定不同時間梯度的分組更加詳細(xì)地探究攣縮形成的確切進(jìn)展與TGF-β1和CTGF表達(dá)升高的時間相關(guān)性，這將是接下來研究完善的一大方向。

將本研究中的自然恢復(fù)組與超短波治療組進(jìn)行比較，超短波治療組的肌切開術(shù)后膝關(guān)節(jié)活動度恢復(fù)更大，而膝關(guān)節(jié)后方關(guān)節(jié)囊膠原百分比、TGF-β1與CTGF的蛋白、mRNA表達(dá)水平的各項指標(biāo)均降低，在各項指標(biāo)上都證明超短波療法對于關(guān)節(jié)攣縮的進(jìn)展有著抑制作用。超短波屬于高頻電治療范圍，被證明有降低炎癥反應(yīng)，改善關(guān)節(jié)僵硬，緩解疼痛等多種治療作用。高頻電治療的原理是電場中產(chǎn)生的熱能，相較于傳統(tǒng)熱療而言，熱能作用可抵達(dá)更深處的組織，且分布均勻。高頻電產(chǎn)熱超短波可調(diào)節(jié)血管內(nèi)皮細(xì)胞的合成和釋放，繼而引起小動脈及毛細(xì)血管擴張，血流速度加快，血管再生增加。本研究中，超短波治療組與自然恢復(fù)組相比，肌切開術(shù)后膝關(guān)節(jié)活動度有明顯好轉(zhuǎn)，TGF-β1與CTGF的mRNA表達(dá)、TGF-β1與CTGF的蛋白表達(dá)得以抑制，證明應(yīng)用超短波療法進(jìn)行干預(yù)可以在一定程度上逆轉(zhuǎn)關(guān)節(jié)囊纖維化并改善關(guān)節(jié)攣縮程度，并且可能是通過調(diào)控CTGF及TGF-β1的表達(dá)實現(xiàn)的。

此前，大多數(shù)的膝關(guān)節(jié)攣縮動物實驗?zāi)Ｐ途捎昧饲拖リP(guān)節(jié)攣縮的模型，而在臨床上伸直型膝關(guān)節(jié)攣縮更為常見，主要表現(xiàn)為膝關(guān)節(jié)屈曲活動的限制。為此本研究采用了已經(jīng)成功制備的兔伸直型膝關(guān)節(jié)攣縮模型，通過超短波療法的介入，使關(guān)鍵的促纖維化因子表達(dá)水平降低，在一定程度上改善伸直型膝關(guān)節(jié)攣縮程度，可能為超短波在關(guān)節(jié)攣縮中的應(yīng)用提供新的理論基礎(chǔ)。

但是超短波療法抑制了CTGF、TGF-β1的表達(dá)，還是促進(jìn)了CTGF、TGF-β1的分解，亦或兩者皆有，甚至于考慮到二者的相互協(xié)同作用，超短波僅通過影響其中之一而改變了兩者的表達(dá)量，本實驗結(jié)果不足以解釋其具體扮演了怎樣的角色，需要進(jìn)一步研究。且該研究主要局限于動物模型中，伸直型膝關(guān)節(jié)攣縮的治療方法仍需進(jìn)一步探討。

(致謝：感謝安徽醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院王華教授對于本文的指導(dǎo)！本研究受到陸軍軍醫(yī)大學(xué)第一附屬醫(yī)院唐康來教授牽頭的國家重點領(lǐng)域創(chuàng)新團(tuán)隊-運動損傷修復(fù)與重建創(chuàng)新團(tuán)隊項目資助，在此表示誠摯的感謝！)