李江濤，尹永鋒，王潤青，張 平，趙 杰，劉榮麗，陳園園

低氧缺血性腦病是由于腦缺氧或缺血引起腦損傷，從而導致意識改變、肌張力變化，常引起諸如腦癱、癲癇等后遺癥。其中血管性癡呆(vascular dementia,VD)是一種由大腦低氧缺血引發(fā)的腦血管疾病，會損傷患者的學習和記憶，常伴隨著運動失調(diào)、語言能力受損及人格障礙。阿爾茨海默病(alzheimer disease,AD)有約15%的患者會發(fā)生VD。山茱萸，中醫(yī)稱為“山珠玉”，莫諾苷是其主要活性成分，長期以來一直被用于治療腦血管疾病和糖尿病。莫諾苷具有抗氧化應(yīng)激、改善微血管循環(huán)、抗細胞凋亡和神經(jīng)修復功能等多種生物活性。然而，莫諾苷對低氧缺血性腦損傷(hypoxic ischemic brain injury, HIBI)與轉(zhuǎn)錄因子NF-E2相關(guān)因子(Nrf)通路的相關(guān)性研究尚無報道。該文采用Rice法建立HIBI大鼠模型，探討莫諾苷是否能夠通過介導Nrf通路對HIBI模型產(chǎn)生正面影響。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及主要試劑

60只SPF級雄性SD大鼠，體質(zhì)量240～280 g，中國科學院實驗動物中心提供。莫諾苷(純度≥98.0%，美國SIGMA公司)，水合氯醛(天津市大茂化學試劑廠公司)，蘇木精-伊紅(hematoxylin-eosin, HE)染色試劑盒(南京凱基生物有限公司)，化學發(fā)光液(密理博中國有限公司)，蛋白抽提試劑盒、二喹啉甲酸(bicinchoninic acid, BCA)蛋白測定試劑盒(北京索萊寶生物有限公司)，B細胞淋巴瘤2(B-cell lymphoma-2,Bcl-2)、Bcl-2相關(guān)X(Bcl2-associated X,Bax)、半胱天冬酶3(Caspase-3)、Caspase-9、堿性成纖維細胞生長因子(basic fibroblast growth factor,bFGF)、腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(brain-derived neurotrophic factor,BDNF)、突觸后致密蛋白95(postsynaptic density-95,PSD95)、海馬突觸素(synaptophysin,SYP)、轉(zhuǎn)錄因子NF-E2相關(guān)因子2[transcription factor nuclear factor erythroid 2(NF-E2)-related factor 2,Nrf2]和血紅素加氧酶1(heme oxygenase 1,HO-1)一抗、二抗(英國Abcam公司)，超氧化物歧化酶(reactive oxygen species,SOD)、丙二醛(malondialdehyde,MDA)和乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase,LDH)檢測試劑盒(上海信帆生物科技有限公司)。

1.2 主要儀器

電泳儀及半干轉(zhuǎn)膜儀、化學發(fā)光凝膠成像系統(tǒng)(美國伯樂公司)，超低溫冰箱(美國THERMO公司)，倒置顯微鏡(日本奧林巴斯公司)。

1.3 方法

1.3.1

分組、造模及給藥 適應(yīng)性喂養(yǎng)大鼠1周，并于手術(shù)前禁食12 h，禁水4 h。大鼠隨機均分為對照組、模型組、尼莫地平組及莫諾苷(25、50、100 mg/kg)組。采用Rice法建立HIBI模型。實驗方法具體步驟如下：10%水合氯醛腹腔注射，對大鼠進行麻醉，仰臥姿勢固定大鼠，從頸正中處切口找出左頸總動脈，4-0手術(shù)線對結(jié)扎血管，之后將皮膚縫合。術(shù)后2 h，在密閉環(huán)境中，37 ℃、8% O+92%N混合氣體低氧處理2.5 h。對照組大鼠在相同部位切開處理后即縫合皮膚，不作其他處理。缺血缺氧處理完成后，模型組大鼠通過灌胃給予以25、50、100 mg/kg莫諾苷或者4 mg/kg陽性藥尼莫地平，每日1次，連續(xù)28 d；對照組和模型組給予相同體積的生理鹽水進行灌胃。

1.3.2

神經(jīng)功能評分 Bederson法評價大鼠神經(jīng)功能。0分:無神經(jīng)功能損傷；1分:對側(cè)腕、肘屈曲，肩內(nèi)收屈曲；2分：在1分指標的基礎(chǔ)上，同時發(fā)生了前肢抵抗對側(cè)推力下降；3分：對側(cè)轉(zhuǎn)圈。

1.3.3

腦積水檢測及腦組織取材 神經(jīng)功能評分完成后，斷頸處理，迅速取腦組織，測量各組大鼠腦積水量后，將腦組織置于PBS中預冷5 min，4%多聚甲醛進行固定，分裝后保存于-80 ℃冰箱中備用。

1.3.4

HE染色 取雙側(cè)端腦前2/3，切片后行HE染色。

1.3.5

ELISA檢測SOD、MDA及LDH水平 取腦組織相同部位進行勻漿處理，在4 ℃、3 000 r/min條件下離心25 min，收集上清液，按照試劑盒的步驟，檢測SOD、MDA和LDH含量。

1.3.6

Western blot檢測Bcl-2、Bax、Caspase-3、Caspase-9、bFGF、BDNF、PSD95、SYP、Nrf2和HO-1表達 取大鼠雙側(cè)腦后1/3部分，等比例加入含蛋白抑制劑的裂解液，提取各組總蛋白。BCA定量后加Loading buffer煮沸變性，SDS-PAGE凝膠電泳分離蛋白并轉(zhuǎn)至PVDF膜，5%牛血清白蛋白(albumin from bovine serum,BSA)室溫封閉1h后一抗4 ℃孵育過夜，次日用Tri鹽酸+吐溫緩沖鹽溶液(Tris-HCl+Tween,TBST)進行洗滌，重復3次，加入辣根過氧化物酶標記的二抗，室溫孵育1 h，TBST緩沖液洗滌，重復3次，加入電化學發(fā)光試劑(electrochemiluminescence,ECL)進行顯影，凝膠成像儀分析結(jié)果，實驗以β肌動蛋白(β-actin)作為內(nèi)參。

2 結(jié)果

2.1 大鼠神經(jīng)功能和腦積水檢測

相比對照組，模型組大鼠神經(jīng)功能學評分高于2分 (

q

=22.15,

P

<0.01)，表明成功建立了HIBI模型；與模型組比較，經(jīng)過25、50、100 mg/kg劑量莫諾苷治療的大鼠神經(jīng)功能評分均降低(

P

<0.01)，并具有劑量依賴性，差異有統(tǒng)計學意義(

F

=58.47,

P

<0.01)。見圖1A。同時，與對照組比較，模型組大鼠腦積水量增加(

P

<0.01)，經(jīng)過25、50、100 mg/kg劑量莫諾苷的治療，相比于模型組，腦積水量下降，差異有統(tǒng)計學意義(

P

<0.01)，且與莫諾苷給藥劑量呈反比(

F

=48.78,

P

<0.01)。見圖1B。提示莫諾苷能劑量依賴性地減輕HIBI誘導的大鼠神經(jīng)功能損傷，同時HIBI大鼠腦積水量降低。

2.2 莫諾苷改善HIBI模型大鼠腦組織病理改變

對照組腦組織細胞排列規(guī)則、輪廓清晰且結(jié)構(gòu)完整；模型組可見細胞呈彌漫性分布，排列紊亂疏松、空泡化增加，且可見炎性浸潤現(xiàn)象；而與模型組相比，莫諾苷25、50、100 mg/kg組和尼莫地平組治療28 d后細胞密度增加、排列整齊，腦組織病理改變減少。提示莫諾苷能有效改善HIBI模型大鼠的腦組織病理改變。見圖2。

2.3 大鼠腦組織Bcl-2、Bax、Caspase-3、Caspase-9的蛋白表達水平

相比對照組，模型組大鼠腦組織高表達Bax、Caspase-3和-9蛋白，低表達Bcl-2蛋白(

P

<0.01)；同時，與模型組相比，莫諾苷25、50 、100 mg/kg組和尼莫地平組上述蛋白的表達趨勢有了逆轉(zhuǎn)(

P

<0.01)，且呈莫諾苷劑量依賴性。莫諾苷可抑制HIBI誘導的促凋亡蛋白表達同時促進抗凋亡蛋白表達(Bcl-2:

F

=164.8；Bax:

F

=162.6；Caspase-3:

F

=389.1；Caspase-9:

F

=203.2；

P

均<0.01)。見圖3。

圖1 大鼠神經(jīng)功能評分和腦積水量檢測結(jié)果

圖2 大鼠腦組織 HE×400

圖3 大鼠腦組織凋亡蛋白表達情況

圖4 MDA、SOD和LDH檢測結(jié)果

2.4 MDA、SOD和LDH檢測

與對照組的MDA、SOD和LDH水平比較，模型組腦組織中SOD活性下降(

P

<0.01)，MDA和LDH水平上升(

P

<0.01)；莫諾苷治療28 d后，與模型組比較，莫諾苷25、50、100 mg/kg劑量組大鼠腦組織中SOD水平劑量升高(

P

<0.01)，同時莫諾苷25、50、100 mg/kg組的MDA水平下調(diào)，莫諾苷25、50、100 mg/kg組的LDH水平下調(diào)(

P

<0.01)。這說明莫諾苷提高了HIBI大鼠腦組織SOD水平，降低MDA和LDH水平，變化趨勢具有劑量依賴性(SOD:

F

=50.50；MDA:

F

=117.8；LDH:

F

=35.13；

P

<0.01)。見圖4。

2.5 bFGF、BDNF、PSD95和SYP檢測

Western blot檢測各組腦組織蛋白表達，相比對照組，模型組大鼠腦組織中bFGF、BDNF、PSD95和SYP的蛋白表達水平降低(

P

<0.01)；莫諾苷治療28 d后，與模型組相比，莫諾苷25、50、100 mg/kg劑量組大鼠上述指標呈莫諾苷濃度依賴性上調(diào)(

P

<0.01)。莫諾苷具有逆轉(zhuǎn)HIBI誘導的bFGF、BDNF、PSD95和SYP蛋白表達下調(diào)的作用(bFGF:

F

=131.6; BDNF:

F

=174.4; PSD95:

F

=436.2; SYP:

F

=346.2;

P

<0.01)。見圖5。

2.6 Nrf2和HO-1檢測

Western blot法對各組大鼠腦組織Nrf2和HO-1表達進行檢測，相比對照組，模型組大鼠腦組織中Nrf2和HO-1的蛋白表達水平均下調(diào)(

P

<0.01)；莫諾苷治療28 d后，莫諾苷25、50、100 mg/kg劑量組大鼠上述指標較模型組均上調(diào)(

P

<0.01)，且與莫諾苷給藥劑量呈現(xiàn)相關(guān)性。結(jié)果表明，莫諾苷能正向調(diào)節(jié)HIBI誘導的抗氧化相關(guān)通路蛋白Nrf2、HO-1表達水平下調(diào)(Nrf2:

F

=448.9; HO-1:

F

=442.6;

P

<0.01)。見圖6。

圖5 bFGF、BDNF、PSD95和SYP檢測結(jié)果

圖6 Nrf2和HO-1檢測結(jié)果

3 討論

AD是一種以記憶和認知漸進性障礙為特征的神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病，治療主要是通過影響突觸傳遞，降低興奮性氨基酸對膽堿能神經(jīng)的毒害等方式，僅可緩解認知減退，發(fā)揮的作用十分有限，因此需要尋找更為有效的治療新方法。研究表明莫諾苷的抗氧化應(yīng)激、改善微血管循環(huán)及神經(jīng)修復等功能均可能決定了其在腦損傷保護方面的潛在作用。Nrf2信號通路在機體對抗病原入侵和氧化應(yīng)激損傷的過程中發(fā)揮著不可替代的作用。本文擬采用Rice法建立HIBI大鼠模型，并通過莫諾苷灌胃治療HIBI大鼠，以研究莫諾苷對HIBI的抗氧化和神經(jīng)保護作用。

該研究采用了Bederson法評價大鼠神經(jīng)功能，表明HIBI模型會使大鼠的神經(jīng)功能評分升高，主要神經(jīng)癥狀表現(xiàn)為對側(cè)腕、肘屈曲，肩內(nèi)收屈曲等，并且引起腦積水量增加。神經(jīng)功能評分和腦積水量增加是HIBI最為直觀的表現(xiàn)，證明HIBI模型復制成功。而灌胃給予不同濃度莫諾苷治療28 d后表明HIBI可降低大鼠神經(jīng)功能評分，同時減少腦積水量，呈劑量依賴性。說明莫諾苷可減輕HIBI模型大鼠的神經(jīng)功能損傷，減少腦積水；與Liu et al研究相符。進一步研究顯示莫諾苷有效抑制Bax、Caspase-3和Caspase-9，促進Bcl-2蛋白表達，并減少HIBI引起的神經(jīng)元細胞凋亡，減輕大鼠腦組織的病理學改變。此外，莫諾苷還能調(diào)節(jié)SOD、MDA和LDH活性/含量以發(fā)揮抗氧化功能。腦組織低氧缺血損傷會產(chǎn)生大量活性氧、自由基等物質(zhì)，從而引起線粒體質(zhì)膜脂質(zhì)過氧化，最終引起細胞凋亡。在大腦中動脈閉塞模型中，莫諾苷能通過減少氧化應(yīng)激反應(yīng)和抗細胞凋亡來保護缺血/再灌注誘導的腦損傷。在腦組織低氧缺血損傷中，莫諾苷很可能通過相同的機制發(fā)揮腦組織保護作用。此外，本研究還顯示莫諾苷能劑量依賴性地逆轉(zhuǎn)HIBI誘導的bFGF、BDNF、SYP和PSD95的低表達。 bFGF和BDNF同屬于神經(jīng)營養(yǎng)因子家族，可減輕神經(jīng)元損傷誘發(fā)的神經(jīng)變性，改善記憶，在AD腦組織修復中發(fā)揮著重要作用。SYP和PSD95也被證明與認知功能障礙相關(guān)。因此，莫諾苷可通過促進bFGF、BDNF、SYP和PSD95表達，促進腦組織修復，從而減輕腦組織低氧缺血損傷引起的神經(jīng)變性。

轉(zhuǎn)錄因子Nrf2在生理條件下與Keapl以非活性狀態(tài)結(jié)合于胞質(zhì)內(nèi)；當受到環(huán)境因素刺激而被激活時，Keapl降解并釋放出Nrf2，再經(jīng)過核轉(zhuǎn)運入核，提高GST、HO-1和NQO1等抗氧化基因表達，從而抵抗氧化應(yīng)激，維持細胞的氧化還原平衡。周玉燕 等研究表明，莫諾苷能通過調(diào)節(jié)氧化應(yīng)激通路相關(guān)蛋白Nrf2和HO-1表達，介導Nrf2通路對雷公藤甲素造成的肝損傷起到有效的保護作用。本研究也得到了相似的結(jié)果，Nrf2/HO-1通路受莫諾苷影響上調(diào)，提升了HIBI模型大鼠的抗氧化能力，具有劑量依賴性，這一作用減輕了氧化應(yīng)激損傷，也從另一方面解釋了HE染色觀察到的組織病理學改變。