張 雨，崔東倩，劉 倩，韓陳陳，羅婷婷，馬 旸，魏 偉

胰島素樣生長(zhǎng)因子-1(insulin-like growth factor-1，IGF-1)是IGF家族成員，可與胰島素樣生長(zhǎng)因子1受體(insulin-like growth factor 1 receptor，IGF1R)結(jié)合并參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展。研究表明IGF-1可以促進(jìn)黑色素瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移；還可通過(guò)上調(diào)早期生長(zhǎng)反應(yīng)蛋白1(early growth response 1, EGR1)的表達(dá)增強(qiáng)肝癌(hepatocellular carcinoma，HCC)細(xì)胞的遷移和侵襲能力。胰島素樣生長(zhǎng)因子結(jié)合蛋白2(insulin-like growth factor binding protein 2，IGFBP2)是循環(huán)系統(tǒng)中含量第二大的IGFBPs。IGFBP2結(jié)構(gòu)中含有IGF結(jié)合區(qū)域，可在循環(huán)中與IGF形成復(fù)合物并調(diào)節(jié)IGF功能。IGFBP2可通過(guò)調(diào)控IGF/IGFR信號(hào)通路促進(jìn)腫瘤進(jìn)展，但I(xiàn)GFBP2在IGF-1誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲中的作用尚未有報(bào)道。

該研究選用不同濃度IGFBP2與IGF-1聯(lián)合刺激HepG2細(xì)胞，用CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞增殖，transwell法檢測(cè)細(xì)胞遷移和侵襲，Western blot檢測(cè)胞內(nèi)信號(hào)通路相關(guān)蛋白的活化和表達(dá)，旨在揭示IGFBP2在IGF-1誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞增殖、遷移和侵襲中的作用及機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1

主要試劑 高糖DMEM、胎牛血清購(gòu)自美國(guó)Biological Industries公司；胰酶購(gòu)自美國(guó)Wisent Inc公司；BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒購(gòu)自上海Bestbio生物公司；CCK-8試劑盒購(gòu)自日本DOJINDO公司；Elk1、磷酸化Elk1、Akt、磷酸化Akt、p44/42 MAPK (ERK1/2)、磷酸化p44/42 MAPK (ERK1/2)、EGR1、磷酸化IGF-1R抗體均購(gòu)自美國(guó)Cell Signaling Technology公司；β-actin、HRP偶聯(lián)抗兔和小鼠IgG購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；Transwell小室購(gòu)自美國(guó)Corning公司；24孔板購(gòu)自美國(guó)NEST公司；0.5%結(jié)晶紫染色液、PBS緩沖液購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。

1.1.2

細(xì)胞株的培養(yǎng) 人源HCC細(xì)胞株HepG2購(gòu)自美國(guó)American Type Culture Collection公司，以2×10個(gè)/ml密度接種于細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，用含10%胎牛血清的DMEM置于5% CO、37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2 方法

1.2.1

CCK-8法檢測(cè)HepG2細(xì)胞增殖能力 將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HepG2細(xì)胞，用胰蛋白酶消化，配制成細(xì)胞懸液并調(diào)整細(xì)胞密度為5×10個(gè)/ml。取100 μl細(xì)胞懸液接種于96孔板各孔中，5% CO、37 ℃培養(yǎng)至細(xì)胞貼壁且融合度為50%～60%后，將不同濃度的IGFBP2(15.6、31.2、62.5、125、250 ng/ml)與 IGF-1(50 ng/ml)加入各孔中，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔。培養(yǎng)48、72 h后，每個(gè)孔中分別加入10 μl CCK-8溶液，輕輕敲擊培養(yǎng)板混勻，培養(yǎng)箱中孵育1～4 h，酶標(biāo)儀測(cè)定450 nm處的吸光度。

1.2.2

Transwell法檢測(cè)細(xì)胞遷移和侵襲 采用文獻(xiàn)中相關(guān)方法，將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期、融合度為70%～80%且饑餓處理12～24 h的HepG2細(xì)胞，消化并計(jì)數(shù)后，用無(wú)血清培養(yǎng)基DMEM重懸細(xì)胞并調(diào)整細(xì)胞密度為2×10個(gè)/ml，將含有不同濃度IGFBP2(15.6、31.2、62.5、125、250 ng/ml)與IGF-1(50 ng/ml)的200 μl細(xì)胞懸液接種于小室的上室。下室加入600 μl含有10%胎牛血清的培養(yǎng)基，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔進(jìn)行細(xì)胞遷移和侵襲實(shí)驗(yàn)。侵襲實(shí)驗(yàn)中，預(yù)先在上室的底部均勻的鋪一層Matrigel, 鋪膠過(guò)程中避免產(chǎn)生氣泡。培養(yǎng)12 h后取出24孔板，用棉簽小心擦拭小室內(nèi)部，PBS洗2次，4%多聚甲醛固定30 min。0.5%結(jié)晶紫染色液染色15 min，PBS清洗3次，自然晾干，正置顯微鏡拍照計(jì)數(shù)，一個(gè)小室計(jì)數(shù)5個(gè)區(qū)域的細(xì)胞數(shù)，取平均值，一次實(shí)驗(yàn)至少計(jì)數(shù)3個(gè)小室。

1.2.3

Western blot 250 ng/ml IGFBP2與50 ng/ml IGF-1聯(lián)合刺激HepG2細(xì)胞0、0.5、1、4、12、24、48 h后收集細(xì)胞蛋白，用BCA蛋白定量試劑盒進(jìn)行定量，加入一定量的loading buffer后煮樣，10%分離膠，5%濃縮膠進(jìn)行SDS-PAGE電泳，分離后轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，5%脫脂牛奶37 ℃搖床封閉2 h后，一抗(1∶1 000稀釋)4 ℃孵育過(guò)夜。次日，TBST洗膜8 min×3次后，使用辣根過(guò)氧化物酶(HRP)標(biāo)記的二抗(兔二抗按1∶10 000稀釋，鼠二抗按1∶20 000稀釋)室溫孵育2 h，TBST洗膜8 min×3，化學(xué)發(fā)光液暗室顯影。

2 結(jié)果

2.1 IGFBP2對(duì)IGF-1誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞增殖能力的影響

如圖1結(jié)果顯示，刺激細(xì)胞48 h后，與對(duì)照組(IGF-1單獨(dú)刺激)相比，15.5、31.2 ng/ml的IGFBP2與IGF-1聯(lián)合刺激組細(xì)胞增殖差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(

P

>0.05)；62.5、125、250 ng/ml的IGFBP2與IGF-1聯(lián)合刺激組增強(qiáng)HepG2細(xì)胞的增殖能力 (

F

=8.32,

P

<0.05)，且具有濃度依賴的特性。刺激細(xì)胞72 h后，與對(duì)照組(IGF-1單獨(dú)刺激)相比，不同濃度IGFBP2與IGF-1聯(lián)合刺激各組可濃度依賴地增強(qiáng)IGF-1誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞的增殖能力，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(

F

=13.20,

P

<0.05)。

圖1 不同濃度IGFBP2與IGF-1聯(lián)合刺激對(duì)HepG2細(xì)胞增殖能力的影響

2.2 IGFBP2對(duì)IGF-1誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞遷移和侵襲能力的影響

與對(duì)照組相比，用不同濃度(15.6、31.2、62.5、125、250 ng/ml)IGFBP2與IGF-1聯(lián)合刺激HepG2細(xì)胞12 h后可濃度依賴地增加遷移的細(xì)胞數(shù)目(圖2A)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(

F

=113.3,

P

<0.05)(圖2B)；細(xì)胞侵襲數(shù)目統(tǒng)計(jì)結(jié)果表明，與對(duì)照組相比，不同濃度IGFBP2(15.6、31.2、62.5、125、250 ng/ml)與IGF-1聯(lián)合刺激HepG2細(xì)胞12 h后可濃度依賴地增加侵襲的細(xì)胞數(shù)目(圖2C)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(

F

=81.1,

P

<0.05)(圖2D)。

2.3 IGFBP2與IGF-1聯(lián)合刺激活化胞內(nèi)Akt、ERK信號(hào)通路

選用250 ng/ml IGBP2與50 ng/ml IGF-1聯(lián)合刺激HepG2細(xì)胞0、0.5、1、4、12、24、48 h, Western blot檢測(cè)胞內(nèi)信號(hào)通路相關(guān)蛋白的活化和表達(dá)。結(jié)果顯示，與0 h(50 ng/ml IGF-1單獨(dú)刺激)相比，IGF1R的磷酸化水平逐漸增高，并在刺激4 h時(shí)達(dá)到峰值(

P

<0.05)隨后逐步降低；與對(duì)照組(IGF-1單獨(dú)刺激)相比，Akt和ERK的磷酸化水平在聯(lián)合刺激0.5 h時(shí)增高(

P

<0.05)，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)逐漸降低，而總表達(dá)無(wú)明顯改變；聯(lián)合刺激不同時(shí)間EGR1的蛋白表達(dá)水平也逐漸增高(圖3)。以上結(jié)果表明，IGFBP2與IGF-1聯(lián)合刺激活化HepG2細(xì)胞內(nèi)Akt、ERK信號(hào)通路，上調(diào)EGR1的蛋白表達(dá)。

3 討論

腫瘤細(xì)胞增殖、遷移和侵襲是惡性腫瘤重要的生物學(xué)行為。研究表明 IGFBP2的異常表達(dá)與腫瘤細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲關(guān)系密切。在涎腺性囊性癌中，上調(diào)IGFBP2的表達(dá)可以增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞的侵襲遷移能力；IGFBP2通過(guò)激活NF-κB信號(hào)通路促進(jìn)胰腺癌細(xì)胞侵襲；上調(diào)IGFBP2的表達(dá)增強(qiáng)HCC細(xì)胞株Huh7的遷移侵襲能力。然而，IGFBP2對(duì)IGF-1誘導(dǎo)HepG2增殖、遷移和侵襲能力的影響尚不清楚。該研究選用不同濃度IGFBP2與IGF-1聯(lián)合刺激HepG2細(xì)胞，用CCK-8法和transwell法檢測(cè)細(xì)胞功能,結(jié)果表明IGFBP2可以增強(qiáng)IGF-1誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的能力。

圖2 不同濃度IGFBP2與IGF-1聯(lián)合刺激對(duì)HepG2細(xì)胞遷移和侵襲能力的影響

圖3 250 ng/ml IGFBP2 與50 ng/ml IGF-1聯(lián)合刺激不同時(shí)間對(duì)胞內(nèi)Akt及ERK信號(hào)通路活化的影響

Akt及ERK信號(hào)通路的活化與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。研究已證實(shí)IGF-1可以通過(guò)與IGF1R結(jié)合活化Akt及ERK信號(hào)通路增強(qiáng)HCC的遷移和侵襲能力。本研究中，用Western blot法檢測(cè)胞內(nèi)IGF1R、Akt及ERK蛋白表達(dá)，結(jié)果顯示IGF1R在刺激4 h時(shí)磷酸化水平增高，而在刺激0.5 h時(shí)Akt及ERK信號(hào)通路已被活化，提示IGFBP2增強(qiáng)IGF-1誘導(dǎo)的HepG2細(xì)胞增殖、遷移和侵襲可能是通過(guò)IGF-1非依賴途徑活化Akt及ERK信號(hào)通路進(jìn)行的。研究報(bào)道IGFBP-2可通過(guò)自身RGD結(jié)構(gòu)與integrin β1受體結(jié)合活化ERK 信號(hào)通路促進(jìn)膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖和侵襲；在卵巢癌中，IGFBP2可以通過(guò)激活ERK1/2和JNK信號(hào)通路促進(jìn)癌細(xì)胞增殖。因此，IGFBP2活化Akt及ERK信號(hào)通路的具體機(jī)制還需要進(jìn)一步研究。

EGR1是即刻早期基因家族的重要成員，可被其上游如Akt或ERK等信號(hào)通路激活，被活化后可以通過(guò)調(diào)控其下游靶標(biāo)基因在腫瘤惡性生物學(xué)行為中發(fā)揮重要作用。如在前列腺癌中，EGR1通過(guò)與IGF1R基因結(jié)合上調(diào)IGF1R的表達(dá)，從而激活A(yù)kt及ERK信號(hào)通路，最終增強(qiáng)癌細(xì)胞的增殖能力；在肝癌中，肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子(hepatocyte growth factor，HCF)可以誘導(dǎo)EGR1表達(dá)及轉(zhuǎn)錄，EGR1通過(guò)轉(zhuǎn)錄激活下游MMP-2和MMP-9基因表達(dá)從而促進(jìn)HCC細(xì)胞遷移和侵襲。本研究證明IGFBP2與IGF-1聯(lián)合刺激HepG2細(xì)胞可以上調(diào)EGR1的表達(dá)，增強(qiáng)細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲能力，為探究HCC分子機(jī)制提供新的方向。