陳 旭，鄭 玉，彭 泉，陳 亮，張明金，趙成功，任桂靈

乳腺癌在成年女性中有很高的發(fā)病率，全球每年新增乳腺癌患者約138萬(wàn)，我國(guó)乳腺癌病死率達(dá)到了60%?；瘜W(xué)藥物治療取得了很好的效果，但是化療存在很多毒副作用，給患者帶來(lái)了巨大的痛苦。漢黃芩素為黃酮類(lèi)化合物，同時(shí)還是中藥黃芩的主要活性成分，很多研究表明該化合物不僅可以抗炎、抗過(guò)敏、抗病毒、抗驚厥及血管保護(hù)等多種藥理學(xué)活性，該化合物還表現(xiàn)出一定的抗腫瘤效果，比如誘導(dǎo)皮膚癌細(xì)胞的凋亡,抑制肺癌細(xì)胞黏附和遷移能力。該實(shí)驗(yàn)以mcf-7細(xì)胞為對(duì)象研究漢黃芩素通過(guò)調(diào)控PTEN/PI3K/AKT信號(hào)通路對(duì)乳腺癌細(xì)胞體內(nèi)外增殖的影響，為漢黃芩素治療乳腺癌及其抗腫瘤活性提供新的科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1

細(xì)胞株 人乳腺癌細(xì)胞株mcf-7由中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)院細(xì)胞庫(kù)提供。

1.1.2

實(shí)驗(yàn)材料 漢黃芩素購(gòu)于美國(guó)Sigma-Aldrich公司；DMSO購(gòu)于上海生工；PRMI-1640培養(yǎng)基、胎牛血清以及雙抗購(gòu)于美國(guó)Gibco公司；CCK-8增殖檢測(cè)試劑盒、蛋白定量檢測(cè)試劑盒、Annexin V-FITC/PI細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒、細(xì)胞周期檢測(cè)試劑盒及ROS檢測(cè)試劑盒購(gòu)于上海貝博生物有限公司；小鼠抗β-actin抗體(ab8226)、兔抗PCNA抗體(ab92552)、兔抗Caspase-3抗體(ab13847)、兔抗Cleaved-Caspase-3抗體(ab2302)、兔抗PTEN抗體(ab32199)、兔抗Ki67抗體(ab16667)、兔抗p-PI3K抗體(ab32089)以及兔抗p-AKT抗體(ab8805)購(gòu)于英國(guó) Abcam公司，所有抗體稀釋比例均為1∶1 000。

1.1.3

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 12只SPF級(jí)BALB/c雌性裸鼠，3～5周齡，體質(zhì)量(15～20) g，購(gòu)自南京大學(xué)模式動(dòng)物研究所動(dòng)物中心，于安徽醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心SPF級(jí)環(huán)境下飼養(yǎng)。

1.1.4

儀器 CO恒溫培養(yǎng)箱 (美國(guó)Thermo公司)；全波長(zhǎng)多功能酶標(biāo)儀(瑞士 Tecan公司)；流式細(xì)胞儀(美國(guó)Beckman公司)；FUSION-FX5-820多功能成像系統(tǒng) (法國(guó)VILBER公司)。

1.2 方法

1.2.1

細(xì)胞培養(yǎng)及藥物處理 常規(guī)方法復(fù)蘇凍存于液氮罐中的乳腺癌細(xì)胞株mcf-7，將其接種于含10% FCS的RPMI-1640培養(yǎng)液的培養(yǎng)瓶中，置于培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng) (37 ℃、5% CO、飽和濕度)，24 h后首次換液，去掉未貼壁細(xì)胞，每隔3 d換液，待細(xì)胞生長(zhǎng)融合達(dá)80%～90%時(shí)，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。將試驗(yàn)細(xì)胞分為4組，每組按照1×10個(gè)/ml的密度接種，并用不同濃度漢黃芩素 (0、20、50、100 μmol/L) 分別處理各組細(xì)胞并用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.2

流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期 將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的mcf-7細(xì)胞接種于6孔板中，待細(xì)胞貼壁后，用不同濃度的漢黃芩素 (0、20、50、100 μmol/L) 作用于乳腺癌細(xì)胞48 h，用胰蛋白酶處理細(xì)胞，收集細(xì)胞，遇冷后，用70%多聚甲醛固定細(xì)胞后，用PBS清洗細(xì)胞，然后用細(xì)胞周期檢測(cè)試劑盒處理，最后用流式細(xì)胞儀檢測(cè)，重復(fù)3次，最后用Modifit軟件處理細(xì)胞，分析細(xì)胞周期分布。

1.2.3

細(xì)胞凋亡檢測(cè) 將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的mcf-7細(xì)胞接種于6孔板中，待細(xì)胞貼壁后，用不同濃度的漢黃芩素(0、20、50、100 μmol/L)作用于乳腺癌細(xì)胞48 h，用胰蛋白酶處理細(xì)胞，收集細(xì)胞，然后根據(jù)凋亡試劑盒說(shuō)明書(shū)，對(duì)細(xì)胞進(jìn)行Annexin V-FITC/PI雙染，最后用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率。

1.2.4

Western blot檢測(cè)蛋白表達(dá) 收集處理好的mcf-7細(xì)胞，加入適當(dāng)?shù)募?xì)胞裂解液，在恒溫?fù)u床上孵育裂解30 min，12 000 r/min 4 ℃離心20 min，然后提取上清液，用蛋白定量試劑盒檢測(cè)蛋白濃度。將蛋白樣品與加樣緩沖液等體積混合后沸水中煮沸10 min，經(jīng)10% SDS-PAGE 凝膠電泳后半干轉(zhuǎn)至 PVDF膜，孵育一抗過(guò)夜，孵育過(guò)夜后室溫孵育二抗，用ECL化學(xué)發(fā)光顯色，曝光。用ImageJ軟件分析蛋白條帶，最后計(jì)算目的條帶和β-actin 的比值。

1.2.5

CCK-8法 將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的mcf-7乳腺癌細(xì)胞采用胰蛋白酶進(jìn)行消化，接種于96孔培養(yǎng)板(1×10/ml)，置于37 ℃、5% CO的培養(yǎng)箱內(nèi)24 h后，對(duì)照組加入0.1% DMSO，用漢黃芩素(0、20、50、100 μmol/L) 處理mcf-7乳腺癌細(xì)胞，分別培養(yǎng)24、48、72 h。然后每孔加入10 μl 10% CCK-8工作液，完畢后于孵化箱中孵育4 h，于波長(zhǎng)為450 nm處的酶標(biāo)儀測(cè)定吸光度(optical density,OD)值。計(jì)算細(xì)胞存活率/%=[(OD-OD)/(OD-OD)]×100%。

1.2.6

裸鼠移植瘤模型 裸鼠適應(yīng)環(huán)境1周后，碘伏消毒裸鼠右側(cè)腋下皮膚，注射200 μl制備好的mcf-7細(xì)胞懸液，含有1×10個(gè)細(xì)胞，接種完后每天觀察腫瘤生長(zhǎng)情況，裸鼠的活動(dòng)狀況。待腫瘤體積達(dá)到50 mm后，將裸鼠隨機(jī)分為2組：對(duì)照組、漢黃芩素組 (10 mg/kg)，每組6只，并采用灌胃方式進(jìn)行給藥， 劑量為100 kg/L，每2 d給藥1次，每次給藥前測(cè)定裸鼠移植瘤體積和裸鼠體質(zhì)量，連續(xù)給藥21 d，頸椎脫臼處死。

1.2.7

轉(zhuǎn)錄組測(cè)序方法 將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的mcf-7細(xì)胞接種于培養(yǎng)瓶中，待細(xì)胞貼壁后，用分別用0 μmol/L和100 μmol/L濃度的漢黃芩素處理乳腺癌細(xì)胞48 h后，用胰蛋白酶處理細(xì)胞，收集細(xì)胞，用PBS清洗細(xì)胞，緊接著進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，提取樣品總RNA并使用DNase消化DNA后，用帶有Oligo (dT) 的磁珠富集真核生物mRNA (若為原核生物，則通過(guò)試劑盒去除rRNA來(lái)富集mRNA)；加入打斷試劑將mRNA打斷成短片段，以打斷后的mRNA為模板，用六堿基隨機(jī)引物合成一鏈cDNA，然后配制二鏈成反應(yīng)體系合成二鏈cDNA，并使用試劑盒純化雙鏈cDNA；純化的雙鏈cDNA再進(jìn)行末端修復(fù)、加A尾并連接測(cè)序接頭，然后進(jìn)行片段大小選擇，最后進(jìn)行PCR擴(kuò)增；構(gòu)建好的文庫(kù)用Agilent 2100 Bioanalyzer質(zhì)檢合格后，使用Illumina HiSeq2500測(cè)序儀進(jìn)行測(cè)序，產(chǎn)生125 bp或150 bp的的雙端數(shù)據(jù)。質(zhì)檢合格后，使用Illumina測(cè)序儀進(jìn)行測(cè)序。

2 結(jié)果

2.1 漢黃芩素對(duì)mcf-7細(xì)胞增殖的影響

漢黃芩素對(duì)乳腺癌mcf-7細(xì)胞增殖活性的抑制效果見(jiàn)圖1。結(jié)果顯示不同濃度(0、20、50、100 μmol /L) 的漢黃芩素作用mcf-7細(xì)胞24、48、72 h后均能抑制乳腺癌細(xì)胞株mcf-7的增殖水平(

F

=22.31，

P

<0.05)，并呈現(xiàn)出濃度和時(shí)間依賴性，即隨著漢黃芩素濃度和時(shí)間的增加，抑制效果增強(qiáng)。

圖1 漢黃芩素對(duì)乳腺癌細(xì)胞mcf-7細(xì)胞增殖活性的影響

2.2 漢黃芩素對(duì)mcf-7細(xì)胞周期的影響

如圖2所示，與對(duì)照組相比，漢黃芩素處理組中細(xì)胞處于G0/G1期的百分比增加(

F

=40.11，

P

<0.01)，且呈濃度依賴性，即漢黃芩素使mcf-7細(xì)胞周期阻滯于G0/G1期。

圖2 漢黃芩素對(duì)乳腺癌細(xì)胞mcf-7細(xì)胞周期的影響

2.3 漢黃芩素對(duì)mcf-7細(xì)胞中PCNA蛋白水平的影響

Western blot結(jié)果(圖3)所示，與對(duì)照組相比，漢黃芩素 (20、50、100 μmol/L) 處理mcf-7細(xì)胞48 h后，增殖標(biāo)志性蛋白PCNA表達(dá)水平降低(

F

=37.64，

P

<0.05)。

2.4 漢黃芩素對(duì)mcf-7細(xì)胞凋亡的影響

與對(duì)照組相比，不同濃度的漢黃芩素(20、50、100 μmol/L) 處理mcf-7細(xì)胞48 h后，Annexin-V FITC /PI雙染結(jié)果如圖4所示，與對(duì)照組相比，隨著漢黃芩素給藥濃度的增加，細(xì)胞凋亡的百分率升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (

F

=49.45，

P

<0.01)。表明漢黃芩素能夠誘導(dǎo)mcf-7細(xì)胞凋亡，并呈劑量依賴性。

圖3 漢黃芩素對(duì)乳腺癌細(xì)胞mcf-7細(xì)胞中PCNA蛋白表達(dá)水平的影響

圖4 漢黃芩素對(duì)乳腺癌細(xì)胞 mcf-7 細(xì)胞凋亡的影響

2.5 漢黃芩素對(duì)mcf-7細(xì)胞中Caspase-3和Cleaved-Caspase-3蛋白水平的影響

與對(duì)照組相比，不同濃度的漢黃芩素(20、50、100 μmol/L)處理mcf-7細(xì)胞48 h后，Cleaved-Caspase-3蛋白表達(dá)水平逐漸升高，Caspase-3蛋白表達(dá)水平逐漸降低(

F

=56.32，

P

<0.01)。見(jiàn)圖5。

圖5 漢黃芩素對(duì)乳腺癌細(xì)胞 mcf-7 細(xì)胞中Caspase 3和Cleaved-Caspase 3蛋白表達(dá)水平的影響

2.6 漢黃芩素對(duì)mcf-7細(xì)胞中PTEN/PI3K/AKT信號(hào)軸的影響

通過(guò)對(duì)漢黃芩素處理的mcf-7細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序分析，分析熱圖如圖6A所示。KEGG通路分析結(jié)果顯示漢黃芩素在乳腺癌治療過(guò)程中主要和PI3K/AKT信號(hào)通路及其關(guān)鍵上游蛋白PTEN有關(guān)(圖6B)。Western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，與對(duì)照組相比，不同濃度漢黃芩素處理mcf-7細(xì)胞48 h后，抑癌蛋白PTEN表達(dá)水平隨著濃度升高逐漸增加，p-PI3K和p-AKT蛋白表達(dá)水平隨著濃度升高降低 (

F

=37.42，

P

<0.05；

F

=48.54，

P

<0.01)(圖6C)。

2.7 漢黃芩素對(duì)體內(nèi)裸鼠移植瘤的影響

如圖7A所示，漢黃芩素可以抑制mcf-7異種移植模型中的腫瘤生長(zhǎng)，給藥21 d后，對(duì)照組的腫瘤質(zhì)量已達(dá)到約2 g以上，但在10 mg/kg漢黃芩素給藥組中，平均腫瘤質(zhì)量只有0.7 g左右 (圖7B)。由此從體內(nèi)驗(yàn)證了漢黃芩素可以抑制移植瘤的增長(zhǎng)。Western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖7C表明，與對(duì)照組相比，漢黃芩素可以抑制增殖標(biāo)志性蛋白PCNA和Ki67的表達(dá)(

F

=30.78，

P

<0.05)。

圖6 漢黃芩素對(duì)乳腺癌細(xì)胞 mcf-7 細(xì)胞 PTEN/PI3K/AKT信號(hào)通路的影響

圖7 漢黃芩素對(duì)體內(nèi)裸鼠移植瘤的影響

3 討論

乳腺癌作為致死率非常高的惡性腫瘤，約占女性腫瘤的1/4，發(fā)病特點(diǎn)是侵襲性強(qiáng)，復(fù)發(fā)率高，且該疾病的進(jìn)展緩慢，已經(jīng)成為國(guó)內(nèi)外研究的熱點(diǎn)。臨床上乳腺癌治療主要采用手術(shù)切除后化療，但是化療的耐藥性和毒副作用是限制其使用的兩大方面。本研究結(jié)果顯示漢黃芩素可以抑制mcf-7細(xì)胞增殖，并且誘導(dǎo)其凋亡。漢黃芩素有很大的潛力被開(kāi)發(fā)成新型的抗腫瘤一線藥物。

腫瘤的發(fā)生主要是不受控制的惡性增殖以及凋亡受阻。很多藥物主要是采用抑制增殖誘導(dǎo)凋亡發(fā)揮作用。該研究中流式細(xì)胞術(shù)和Western blot結(jié)果顯示漢黃芩素可以阻滯細(xì)胞周期、抑制增殖，促進(jìn)細(xì)胞凋亡并且調(diào)節(jié)凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)，例如 Caspase3和Cleaved-Caspase3蛋白。

為了進(jìn)一步探討漢黃芩素調(diào)節(jié)乳腺癌的潛在機(jī)制，運(yùn)用轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，預(yù)測(cè)其可能涉及的信號(hào)通路，結(jié)果顯示，漢黃芩素可能是通過(guò)調(diào)節(jié) PTEN/PI3K/AKT 信號(hào)通路抑制乳腺癌增殖并且誘導(dǎo)凋亡。作為經(jīng)典的抑癌蛋白，PTEN 在細(xì)胞增殖細(xì)胞凋亡等過(guò)程中發(fā)揮重要的作用，PTEN 的表達(dá)異?？赡軙?huì)干擾細(xì)胞凋亡和增殖。本研究結(jié)果顯示漢黃芩素可升高乳腺癌細(xì)胞中 PTEN 的表達(dá)。這提示漢黃芩素對(duì)于增殖和凋亡的調(diào)節(jié)可能是通過(guò)PTEN發(fā)揮作用的。此外，PTEN是PI3K/AKT信號(hào)通路的關(guān)鍵調(diào)節(jié)蛋白，PTEN 和PI3K/AKT呈負(fù)相關(guān)，PTEN的表達(dá)降低可以激活該信號(hào)通路。當(dāng) PTEN/PI3K/AKT 信號(hào)通路被抑制時(shí)，往往可以抑制腫瘤增殖誘導(dǎo)凋亡。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，漢黃芩素可以抑制 p-PI3K 和 p-AKT 蛋白的表達(dá)，同時(shí)促進(jìn) PTEN 的表達(dá)水平。因此，漢黃芩素通過(guò)調(diào)節(jié)PTEN/PI3K/AKT信號(hào)通路來(lái)抑制mcf-7增殖和誘導(dǎo)來(lái)發(fā)揮作用。