韓貴良，石 巖，焦 婷，賈友超，任冠穎

肺癌是當(dāng)前世界上造成癌癥相關(guān)死亡的重要原因，非小細(xì)胞肺癌(non-small cell lung carcinoma，NSCLC)為肺癌中的一大類。NSCLC是一種異質(zhì)性腫瘤，約占全世界所有肺癌病例的85%。當(dāng)前，手術(shù)切除仍是治愈的最有效的選擇。盡管如此，在診斷時(shí)仍有近70%的患者發(fā)展為局部晚期或轉(zhuǎn)移性疾病。因此，有必要尋找新的治療策略和藥物。G蛋白偶聯(lián)受體相關(guān)分選蛋白1(G-protein coupled receptor-associated sorting protein 1，GASP-1)，主要在腫瘤上皮和腦腫瘤轉(zhuǎn)化的膠質(zhì)細(xì)胞中表達(dá)。研究發(fā)現(xiàn)腦癌、肝癌、乳腺癌和肺癌患者血清中GASP-1的表達(dá)比正常健康人的多4～7倍。類似研究將GASP-1鑒定為潛在的幾種癌癥血清和腫瘤生物標(biāo)志物，并推測(cè)GASP-1可能是癌癥治療藥物開發(fā)的新靶標(biāo)。但是GASP-1在肺癌中的研究鮮有報(bào)道。該文研究了GASP-1基因干擾對(duì)NSCLC細(xì)胞侵襲和上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)以及微管形成的影響，希望能為NSCLC的治療提供新策略。

1 材料與方法

1.1 材料

肺癌A549細(xì)胞購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院的細(xì)胞庫(kù)，并用含10%胎牛血清的Dulbecco改良的Eagle培養(yǎng)基(Dulbecco's Modified Eagle Medium，DMEM)于37 ℃進(jìn)行培養(yǎng)生長(zhǎng)。將sh-RNA及其相應(yīng)的陰性對(duì)照克隆到pGPU6 / Neo質(zhì)粒(上海GenePharma公司)中以靶向GASP-1。將前期篩選的GASP-1-shRNA1用于后續(xù)試驗(yàn)。GASP-1抗體購(gòu)自美國(guó)Abcam公司；TRIzol、RT-PCR試劑盒及SYBRGreen RT-PCR試劑盒購(gòu)自日本TaKaRa公司；RPMI-1640培養(yǎng)基購(gòu)自美國(guó)Hyclone公司；胎牛血清購(gòu)自美國(guó)Gibco公司；E-cadherin、N-cadherin、vimentin和GAPDH抗體及二抗來(lái)自美國(guó)CST 公司。

1.2 方法

1.2.1

慢病毒感染 肺癌細(xì)胞以5×10個(gè)/孔接種6孔板，置培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)至融合度為40%時(shí)，以MOI=20分別添加慢病毒，再加入適量的polybrene (終濃度為5 mg/L)；12 h后添加新鮮培養(yǎng)液；培養(yǎng)72 h后熒光顯微鏡下觀察熒光表達(dá)情況，以1 mg/L的嘌呤霉素篩選穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細(xì)胞系。細(xì)胞分組：對(duì)照組不感染慢病毒的細(xì)胞；shRNA組感染陰性對(duì)照慢病毒；GASP-1-shRNA1組感染重組慢病毒的細(xì)胞。

1.2.2

Western blot實(shí)驗(yàn) 3組待測(cè)細(xì)胞分別用PBS洗滌2次，再加入含有PMSF的RIPA裂解溶液，于冰上孵育30 min。以BCA法測(cè)定蛋白樣品濃度，每孔30 μg蛋白樣品，設(shè)置120 V的電壓電泳2 h后從玻璃板中間取出凝膠。將PVDF膜置于新配置的含體積分?jǐn)?shù)0.05牛血清蛋白溶液中，在室溫結(jié)合2 h。把E-cadherin、N-cadherin、Fibronectin和VEGF一抗按1∶800倍稀釋，PVDF膜置于一抗反應(yīng)液中孵育過夜。再將二抗按1∶2 000倍稀釋后，把PVDF膜置于二抗反應(yīng)液內(nèi)孵育2 h。使用ECL發(fā)光。采用Image J分析內(nèi)參Actin和目標(biāo)條帶的灰度值，目標(biāo)條帶蛋白水平=目標(biāo)條帶的灰度值/Actin的灰度值。每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，每次設(shè)3個(gè)復(fù)孔。

1.2.3

Transwell檢測(cè)細(xì)胞侵襲 3組細(xì)胞以不含血清的培養(yǎng)液懸浮，細(xì)胞密度調(diào)整為7×10/ml，分別添加到Transwell小室的上室內(nèi)進(jìn)行侵襲實(shí)驗(yàn)。每組添加200 μl細(xì)胞懸浮液，下室內(nèi)添加500 μl的含血清培養(yǎng)液。24 h后，將小室取出，把沒有穿膜的細(xì)胞擦掉并以PBS洗滌后，分別添加多聚甲醛溶液固定30 min，添加0.1%結(jié)晶紫染色后，在光鏡下選取5個(gè)視野，計(jì)數(shù)細(xì)胞侵襲數(shù)目。每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，每次設(shè)3個(gè)復(fù)孔。

1.2.4

GASP-1誘導(dǎo)細(xì)胞上皮間質(zhì)化 3組細(xì)胞連續(xù)48 h在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)的動(dòng)態(tài)變化至發(fā)現(xiàn)細(xì)胞由原有上皮細(xì)胞的鵝卵石狀變?yōu)樗笮尾⒗^續(xù)變細(xì)長(zhǎng)，部分細(xì)胞可見軸突樣結(jié)構(gòu)，完全演變?yōu)殚g質(zhì)細(xì)胞形態(tài)，提示細(xì)胞發(fā)生了上皮間質(zhì)化。

1.2.5

細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn) 感染后各組A549細(xì)胞以3×10個(gè)/孔接種到6孔板中，放置在37 ℃培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)，待細(xì)胞生長(zhǎng)匯合達(dá)90%以上時(shí)，將培養(yǎng)液更換成低濃度(0.5%)胎牛血清的培養(yǎng)液，使用劃痕儀對(duì)細(xì)胞進(jìn)行劃痕，以PBS洗滌劃掉的細(xì)胞，加入0.5%胎牛血清的培養(yǎng)液，放置在37 ℃培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)24 h，分別在劃痕0、24 h觀察細(xì)胞劃痕寬度，計(jì)算細(xì)胞遷移率=(0 h劃痕寬度-24 h劃痕寬度)/ 0 h劃痕寬度×100%。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取均值。

2 結(jié)果

2.1 GASP-1基因沉默對(duì)A549細(xì)胞侵襲的影響

Transwell實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，shRNA組侵襲細(xì)胞數(shù)目無(wú)明顯變化，GASP-1-shRNA1組侵襲細(xì)胞數(shù)目減少(

F

=13.13，

P

<0.05)。見圖1。

2.2 GASP-1基因沉默對(duì)A549細(xì)胞遷移的影響

劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖2所示，與對(duì)照組相比，shRNA組細(xì)胞遷移率無(wú)明顯變化，GASP-1-shRNA1組細(xì)胞遷移率降低(

F

=54.17，

P

<0.05)。

2.3 GASP-1基因沉默對(duì)A549細(xì)胞EMT的影響

EMT情況如圖3A所示，與對(duì)照組相比，shRNA組細(xì)胞無(wú)明顯變化，GASP-1-shRNA1組細(xì)胞EMT現(xiàn)象被抑制。Western blot檢測(cè)了EMT標(biāo)志物E-cadherin、N-cadherin和Fibronectin的蛋白表達(dá)。檢測(cè)結(jié)果如圖3B、C所示，與對(duì)照組比較，shRNA組細(xì)胞中E-cadherin、N-cadherin和Fibronectin的蛋白表達(dá)水平無(wú)明顯變化，GASP-1-shRNA1組細(xì)胞中E-cadherin蛋白表達(dá)水平上升，而N-cadherin和Fibronectin的蛋白表達(dá)水平下降，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(

F

=95.40，

P

<0.05；

F

=24.82，

P

<0.05；

F

=6.67，

P

<0.05)。

圖1 不同處理組細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果

圖2 不同處理組細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.4 GASP-1基因沉默對(duì)A549細(xì)胞微管形成的影響

微管形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖4A、B所示，與對(duì)照組相比，shRNA組細(xì)胞中微管結(jié)節(jié)數(shù)目變化不明顯，GASP-1-shRNA1組細(xì)胞中微管結(jié)節(jié)數(shù)目減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(

F

=16.33，

P

<0.05)。Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示(如圖4C、D)，與對(duì)照組相比，shRNA組細(xì)胞中VEGF蛋白表達(dá)水平無(wú)變化，GASP-1-shRNA1組細(xì)胞中VEGF蛋白表達(dá)水平降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(

F

=32.43，

P

<0.05)。

3 討論

隨著工業(yè)化發(fā)展和城市現(xiàn)代化的進(jìn)程加快，環(huán)境污染和空氣污染影響日益顯著，肺癌已經(jīng)成為嚴(yán)重威脅人類生命健康的常見惡性腫瘤。當(dāng)前常用的治療手段以切除、放射和化療為主，但由于這些手段的局限性，生物療法成為醫(yī)學(xué)工作者研究的熱點(diǎn)。研究發(fā)現(xiàn)miR-30a-5p與miR-210-3p結(jié)合可區(qū)分癌組織與非癌組織，因而成為NSCLC潛在的診斷性生物標(biāo)志物。程宇 等發(fā)現(xiàn)PEDF可抑制肺癌細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移，因此PEDF可成為治療肺癌的新途徑。GASP-1存在于人體的許多組織中，并且在多種癌癥組織(乳腺癌、胰腺癌)中的含量比正常組織增加了約10倍，而在乳腺癌和肺癌患者的血清中的含量高于正常人約4～7倍, 被作為癌癥診斷生物標(biāo)志物。本文前期研究顯示GASP-1基因的下調(diào)能抑制肺癌細(xì)胞增殖并促進(jìn)細(xì)胞凋亡，抑制腫瘤形成。為進(jìn)一步研究GASP-1基因干擾在肺癌治療中的潛在可能，本文研究了GASP-1基因干擾對(duì)NSCLC細(xì)胞惡性侵襲、EMT及微管形成的影響。

圖3 不同處理組細(xì)胞EMT情況

圖4 不同處理組細(xì)胞微管形成情況

本研究顯示，G蛋白偶聯(lián)受體(G protein-coupled receptors，GPCRs)參與多種生理過程，其下游信號(hào)靶點(diǎn)在癌癥的生長(zhǎng)和發(fā)展中起著重要的作用。GASP-1是常見的與GPCRs相互作用的蛋白。Tuszynski et al發(fā)現(xiàn)乳腺患者血清中存在GASP-1，而正常人群血清中則沒有，并且GASP-1可調(diào)節(jié)神經(jīng)細(xì)胞中各種GPCRs的溶酶體分選和功能。將GASP-1鑒定為潛在的乳腺癌新血清和腫瘤生物標(biāo)志物，并表明GASP-1可能是乳腺癌治療藥物開發(fā)的新靶標(biāo)。

研究發(fā)現(xiàn)下調(diào)腫瘤標(biāo)志物是癌癥預(yù)防和治療的一條有力途徑。Zhou et al研究表明肺癌患者血清miR-520f表達(dá)下調(diào)，并且miR-520f與肺癌TNM stage和肺癌轉(zhuǎn)移有顯著相關(guān)性，被作為肺癌早期診斷生物標(biāo)志物。在本研究中，Transwell實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，GASP-1-shRNA1組中侵襲細(xì)胞數(shù)目顯著減少，細(xì)胞傷口愈合率顯著下降。表明沉默GASP-1基因可顯著抑制A549細(xì)胞侵襲和遷移。

EMT被認(rèn)為是腫瘤細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵和初始環(huán)節(jié)之一，是腫瘤惡化過程中的重要組成部分。在EMT進(jìn)展過程中，細(xì)胞會(huì)失去上皮特性，包括細(xì)胞黏附和極性，并獲得間質(zhì)形態(tài)和遷移能力。從生化角度看，細(xì)胞會(huì)關(guān)閉上皮標(biāo)志物(如黏附連接蛋白E-cadherin)的表達(dá)，并打開包括波形蛋白和纖連蛋白的間質(zhì)標(biāo)志物。本研究表明，GASP-1-shRNA1組中細(xì)胞EMT現(xiàn)象較對(duì)照組有所好轉(zhuǎn)。Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示GASP-1基因干擾可顯著提升細(xì)胞中E-cadherin蛋白表達(dá)水平并降低N-cadherin和Fibronectin的蛋白表達(dá)水平。表明沉默GASP-1基因可顯著抑制A549細(xì)胞EMT。

血管生成對(duì)于癌癥的發(fā)展和生長(zhǎng)至關(guān)重要：在腫瘤長(zhǎng)到1～2 mm之前，它需要血管來(lái)吸收營(yíng)養(yǎng)和氧氣。腫瘤產(chǎn)生的VEGF和其他生長(zhǎng)因子導(dǎo)致“血管生成轉(zhuǎn)換”，在腫瘤內(nèi)和周圍形成新的脈管系統(tǒng)，使其呈指數(shù)增長(zhǎng)。VEGF是高度特異性的促血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子，是癌癥中血管生成的關(guān)鍵介質(zhì)。本研究檢測(cè)了GASP-1基因干擾對(duì)A549細(xì)胞微管形成的影響，結(jié)果顯示，GASP-1基因干擾可顯著減少微管結(jié)節(jié)數(shù)目，同時(shí)下調(diào)VEGF蛋白表達(dá)水平。這一結(jié)果提示沉默GASP-1基因可抑制A549細(xì)胞微管形成。

肺癌是全球公認(rèn)的惡性腫瘤疾病，因其病癥出現(xiàn)晚、治療難度大、預(yù)后結(jié)果差等原因成為醫(yī)學(xué)難題。本研究證明GASP-1基因干擾對(duì)NSCLC細(xì)胞惡性侵襲、EMT及微管形成都有顯著的抑制作用，有望為肺癌的治療提供一定思路。