吳坤，張建剛，孫科，朱金釗

作者單位：安陽市人民醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，河南 安陽455000

缺氧（hypoxia）可導(dǎo)致機(jī)體器官功能障礙，誘導(dǎo)很多病理過程的發(fā)生，如氧化應(yīng)激、炎癥等。缺氧性腦病是一個(gè)嚴(yán)重的臨床問題，造成許多病人的運(yùn)動障礙、認(rèn)知功能障礙和死亡。從干燥根莖和虎杖根中提取的大黃素（Emodin）具有抗氧化作用和抗腫瘤作用。越來越多的證據(jù)表明，大黃素具有神經(jīng)保護(hù)作用，可以減少活性氧、白細(xì)胞介素-8（IL-8）和單核細(xì)胞趨化蛋白1的產(chǎn)生來防止動脈粥樣硬化斑塊的形成。但是，大黃素在神經(jīng)損傷中的保護(hù)作用的機(jī)制尚未十分清楚。微小RNA（miRNA）指一組長度為21～25 nt 的非編碼RNA，它通過調(diào)節(jié)特定基因參與多種生物學(xué)過程，包括細(xì)胞增殖、分化和代謝。研究表明，miRNA在多種類型的疾病中異常表達(dá)，包括心臟病、炎性疾病和癌癥。微小RNA-206（miR-206）在神經(jīng)損傷病人中的表達(dá)水平出現(xiàn)異常，其是否參與大黃素的作用機(jī)制尚未清晰。于2018年6月至2019年6月，以大鼠腎上腺嗜鉻細(xì)胞瘤PC12細(xì)胞為對象，進(jìn)行本研究，旨在探索大黃保護(hù)缺氧誘導(dǎo)神經(jīng)損傷的功能機(jī)制與miR-206的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 材料

PC12細(xì)胞購自上海中科院細(xì)胞庫；大黃素購自Sigma 公司；二甲基亞砜（DMSO）購自上海鈺博生物科技有限公司；兔抗人裂解的半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3（Cleaved-caspase-3）單克隆抗體購自碧云天；辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔二抗購自Abbkine；聚偏二氟乙烯（PVDF）膜（0.45μm）購自Millipore公司；膜聯(lián)蛋白/異硫氰酸熒光素-碘化丙啶（Annexin V-FITC/PI）凋亡檢測試劑盒購自Solarbio；丙二醛（MDA）檢測試劑盒、超氧化物歧化酶（SOD）試劑盒購自南京建成生物工程研究所；活性氧（ROS）檢測試劑盒、腫瘤壞死因子α（TNF-α）檢測試劑盒、人白細(xì)胞介素-1β（IL-1β）檢測試劑盒購自北京中生北控公司；RNA 試劑盒、實(shí)時(shí)熒光定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（qRT-PCR）試劑盒均購自TaKaRa公司。

1.2 方法

1.2.1

細(xì)胞的培養(yǎng) 用10%胎牛血清的達(dá)爾伯克改良伊格爾培養(yǎng)基（DMEM）培養(yǎng)基培養(yǎng)PC12細(xì)胞，用細(xì)胞培養(yǎng)箱進(jìn)行37 ℃、5%二氧化碳的條件下培養(yǎng)傳代。

1.2.2

細(xì)胞的分組與處理 將正常培養(yǎng)的PC12細(xì)胞標(biāo)記為對照（NC）組；參照張開明的方法將氣體調(diào)至1%氧氣、5%二氧化碳、94%氮?dú)膺M(jìn)行缺氧處理，用大鼠神經(jīng)生長因子NGF處理2 h再置于氣體中培養(yǎng)，以此法建立缺氧PC12 細(xì)胞，將其標(biāo)記為hypoxia 組。將0.1%DMSO處理的缺氧PC細(xì)胞標(biāo)記為DMSO組。用0.1%的DMSO稀釋大黃素Emodin（2、4、6 μg/mL），然后處理hypoxia組細(xì)胞48 h，分別標(biāo)記為hypoxia+2 μg/mL Emodin組、hypoxia+4 μg/mL Emodin組、hypoxia+6 μg/mL Emodin組，從中篩選最適濃度組hypoxia+4 μg/mL Emodin組，將其標(biāo)記為hypoxia+Emodin組。用脂質(zhì)體法，取4倍量的脂質(zhì)體與DNA混合，將miRNA陰性對照（miR-con）、miR-206、4 μg/mL Emodin+抗-miRcon（anti-miR-con）、4 μg/mL Emodin+抗-miR-206（antimiR-206）轉(zhuǎn)染至hypoxia組細(xì)胞，轉(zhuǎn)染4 h后，更換新鮮培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)48 h，用qRT-PCR檢測轉(zhuǎn)染的效率，將轉(zhuǎn)染成功的組標(biāo)記為hypoxia+miR-con 組、hypoxia+miR-206組、hypoxia+Emodin+anti-miR-con組、hypoxia+Emodin+anti-miR-206組。

1.2.3

Annexin V-FITC/PI雙染檢測細(xì)胞凋亡 收集細(xì)胞，用結(jié)合緩沖液重懸細(xì)胞，然后取500 μL細(xì)胞加入離心管，再取5 μL的Annexin V-/FITC，避光反應(yīng)15 min，結(jié)束后再加入5 μL的PI，避光反應(yīng)10 min，迅速上流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測分析。細(xì)胞凋亡率=早期凋亡率+晚期凋亡率。每個(gè)樣品重復(fù)3次，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.4

Western blotting 檢測細(xì)胞中Cleaved-caspase-3 的蛋白表達(dá) 收集細(xì)胞，用裂解液裂解后提取總蛋白，并進(jìn)行蛋白定量，再用上樣緩沖液混懸細(xì)胞后進(jìn)行沸水浴變性10 min，取上清進(jìn)行蛋白電泳上樣。電泳結(jié)束后，用轉(zhuǎn)膜儀將蛋白從膠上轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，轉(zhuǎn)磨過程要在4 ℃冰箱中完成。結(jié)束后，用5%脫脂奶粉進(jìn)行封閉，然后將膜轉(zhuǎn)移至稀釋好的一抗溶液中，4 ℃冰箱中孵育過夜。取出膜，將其轉(zhuǎn)移至二抗稀釋液中，室溫孵育2 h，洗膜。用ECL 發(fā)光液進(jìn)行曝光，然后用Image J 分析條帶的灰度值，以β-actin 為內(nèi)參，以目的條帶灰度值與β-actin灰度值的比值表示目的蛋白的表達(dá)。

1.2.5

ELISA 實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞中MDA、SOD、ROS、TNF-α、IL-1β 的含量 檢測細(xì)胞上清液中MDA、SOD、ROS、TNF-α、IL-1β的含量。

1.2.6

qRT-PCR 法檢測細(xì)胞中miR-206 mRNA 的表達(dá) 收集細(xì)胞，用RNA 抽提試劑盒提取細(xì)胞的總RNA，再用反轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行cDNA 的合成。用qRT-PCR 試劑盒按照94 ℃變性2 min；然后94 ℃，30 min；58 ℃，30 s；72 ℃，30 s 進(jìn)行循環(huán)擴(kuò)增，后延伸溫度72 ℃，2 min，45 個(gè)循環(huán)的條件進(jìn)行擴(kuò)增，以U6為內(nèi)參，2法計(jì)算miR-206 mRNA 表 達(dá)。miR-206 的正向引物為5'-CGTCAGAAGGAATGATGCACAG-3'，反向引物為 5'-ACCTGCGTAGGTAGTTTCATGT-3'。 U6的正向引物為5'-CTCGCTTCGGCAGCACA-3'，反向引物為 5'-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3'。

2 結(jié)果

2.1 不同濃度Emodin 對缺氧處理的PC12 凋亡的影響

與NC 組（4.29±0.43）%相比，0.1%DMSO 組細(xì)胞中的凋亡率（4.37±0.44）%差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（

P

＞0.05），見圖1。與NC 組相比，hypoxia 組細(xì)胞凋亡率顯著升高，Cleaved-caspase-3 蛋白表達(dá)量顯著升高，與hypoxia 組相比，hypoxia+2 μg/mL Emodin 組、hypoxia+4 μg/mL Emodin 組、hypoxia+6 μg/mL Emodin組細(xì)胞凋亡率均顯著降低，Cleaved-caspase-3 蛋白表達(dá)量顯著降低（

P

＜0.001）。見表1、圖2、圖3。

表1 不同濃度Emodin對缺氧處理的PC12凋亡的影響（重復(fù)次數(shù)=3，n=9）/±s

圖3 不同濃度Emodin的條件下Western blotting檢測Cleaved-caspase-3蛋白的表達(dá)

2.2 Emodin 對缺氧處理的PC12 氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)的影響

與NC 組相比，hypoxia 組細(xì)胞MDA、ROS、TNF-α、IL-1β 的含量均顯著升高，SOD 的含量顯著降低，與hypoxia 組相比，Hypoxia+Emodin 組細(xì)胞MDA、ROS、TNF-α、IL-1β 的含量均顯著降低，SOD的含量顯著升高（

P

＜0.001），見表2。

2.3 Emodin 對miR

-

206 表

達(dá)

的

影

響

與NC 組（1.00±0.12）相比，hypoxia 組細(xì)胞miR-206 的表達(dá)量（1.00±0.12）顯著降低，與hypoxia 組（0.30±0.03）相比，Hypoxia+Emodin 組 細(xì) 胞miR-206 的 表 達(dá) 量（0.90±0.09）顯著升高（

P

＜0.001）。

2.4 高表達(dá)miR

-

206對hypoxia處理的PC12凋亡，氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)的影響

與NC組相比，hypoxia組細(xì)胞miR-206 的表達(dá)量（顯著降低，Cleaved-caspase-3 蛋白表達(dá)顯著升高，MDA、ROS、TNF-α、IL-1β的含量均顯著升高，SOD的含量顯著降低，細(xì)胞凋亡率顯著升高；與hypoxia+miR-con 組相比，hypoxia+miR-206組細(xì)胞miR-206的表達(dá)量顯著升高，Cleavedcaspase-3蛋白表達(dá)顯著降低，MDA、ROS、TNF-α、IL-1β的含量均顯著降低，SOD的含量顯著升高，細(xì)胞凋亡率顯著降低（

P

＜0.001）。見表3、圖4。

圖4 高表達(dá)miR-206條件下Western blotting檢測Cleaved-caspase-3表達(dá)

2.5 低表達(dá)miR

-

206可以減輕Emodin 對缺氧處理的PC12 凋亡，氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)的影響

與hypoxia 組相比，hypoxia+ Emodin 組細(xì)胞中miR-206 的表達(dá)量顯著升高，Cleaved-caspase-3 蛋白表達(dá)顯著降低，MDA、ROS、TNF-α、IL-1β 的含量均顯著降低，SOD 的含量顯著升高，細(xì)胞凋亡率顯著降低；與hypoxia+ Emodin 組 相 比，hypoxia+ Emodin+anti-miR-206 組細(xì)胞中miR-206 的表達(dá)量顯著降低，Cleavedcaspase-3蛋白表達(dá)顯著升高，MDA、ROS、TNF-α、IL-1β 的含量均顯著升高，SOD 的含量顯著降低，細(xì)胞凋亡率顯著升高（

P

＜0.001）。見圖5、表4。

圖5 低表達(dá)miR-206條件下Western blotting檢測Cleaved-caspase-3表達(dá)

3 討論

表2 Emodin對缺氧處理的PC12中MDA、SOD、ROS活性和TNF-α、IL-1β含量的影響（重復(fù)次數(shù)=3，n=9）/±s

表3 高表達(dá)miR-206對hypoxia處理的PC12凋亡，氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)的影響（重復(fù)次數(shù)=3，n=9）/±s

表4 低表達(dá)miR-206可以減輕Emodin對缺氧處理的PC12凋亡，氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)的影響（重復(fù)次數(shù)=3，n=9）/±s

大黃素是一種提取自干燥根莖和虎杖根的提取物，可以保護(hù)神經(jīng)元免受缺氧缺血腦損傷。Guo等發(fā)現(xiàn)，在缺血缺氧環(huán)境下培養(yǎng)的神經(jīng)元樣細(xì)胞的活力降低，而細(xì)胞中激活素A和caspase-3的表達(dá)增加，大黃素處理后提高了缺氧葡萄糖的神經(jīng)元樣細(xì)胞的存活率，增加了激活素A的表達(dá)，并降低了caspase-3的表達(dá)，表明大黃素可通過激活素A信號通路抑制神經(jīng)元凋亡并減輕神經(jīng)細(xì)胞的損傷。曾歡歡等在研究中發(fā)現(xiàn)，大黃素治療后，大鼠的自噬小體融合減輕，脊髓神經(jīng)纖維脫髓鞘明顯減輕，炎性因子TNF-α、IL-6明顯降低，Nrf2-ARE信號通路活性明顯升高，揭示大黃素發(fā)揮神經(jīng)損傷保護(hù)作用的機(jī)制與Nrf2-ARE信號通路的活化程度緊密相關(guān)。本研究建立了NGF誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞損傷模型，用流式細(xì)胞術(shù)檢測大黃素處理的受損細(xì)胞的凋亡率，發(fā)現(xiàn)大黃素可呈濃度依賴性抑制細(xì)胞的凋亡，并下調(diào)Cleaved-caspase-3表達(dá)，進(jìn)一步用ELISA實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞中氧化應(yīng)激因子MDA、SOD、ROS和炎性因子TNF-α、IL-1β的含量，發(fā)現(xiàn)大黃素可下調(diào)細(xì)胞中MDA、ROS、TNF-α、IL-1β的含量，上調(diào)SOD的含量，說明大黃素具有明顯的抗氧化應(yīng)激、抗炎作用，這些實(shí)驗(yàn)結(jié)果均與前人的研究結(jié)果相吻合，再次證實(shí)了大黃素在神經(jīng)損傷疾病中的保護(hù)作用。通過qRTPCR法檢測細(xì)胞中miR-206的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)大黃素可恢復(fù)缺氧誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞中miR-206的下調(diào)，由此推測大黃素在神經(jīng)損傷中的保護(hù)作用機(jī)制可能與miR-206的表達(dá)水平具有相關(guān)性。不足之處在于，這個(gè)結(jié)果未在動物實(shí)驗(yàn)中進(jìn)行進(jìn)一步的驗(yàn)證。

miRNA在神經(jīng)疾病中起著至關(guān)重要的作用。在缺氧缺血性腦損傷（HIBD）引起的海馬神經(jīng)元中，miR-592-5p水平降低。miR-592-5p模擬物給藥通過靶向前列腺素DP受體（PTGDR）來預(yù)防HIBD引起的海馬神經(jīng)元損傷。腦室內(nèi)注射miR-126-3p模擬物通過抑制腦血管內(nèi)皮細(xì)胞中的PIK3R2和Akt信號通路來減輕血腦屏障破壞、腦水腫和神經(jīng)元損傷。Xu等在神經(jīng)性疼痛的研究中通過微陣列分析、qRTPCR法分析miRNA表達(dá)譜發(fā)現(xiàn)，miR-206是其中表達(dá)異常降低的5個(gè)miRNA之一，說明血清中miRNA是神經(jīng)性疼痛的潛在預(yù)測因子。Wen等在研究中報(bào)道，miR-206-3p在慢性坐骨神經(jīng)損傷大鼠的背根神經(jīng)節(jié)中降低，上調(diào)miR-206-3p可以緩解神經(jīng)性疼痛并降低組蛋白脫乙酰基酶4（HDAC4，miR-206-3p 的預(yù)期靶標(biāo)）水平，HDAC4的過表達(dá)可減弱miR-206-3p對神經(jīng)性疼痛的作用，顯示，miR-206-3p-HDAC4信號通路在慢性坐骨神經(jīng)損傷誘發(fā)的神經(jīng)性疼痛中具有潛在的重要作用。Sun等發(fā)現(xiàn)，miR-206在慢性收縮性損傷的大鼠背根神經(jīng)節(jié)損傷中的表達(dá)水平異常下調(diào)，過表達(dá)miR-206后，大鼠血清中TNF-α、IL-1β和IL-6的水平降低，以時(shí)間依賴性方式減輕慢性收縮性損傷大鼠的機(jī)械性異常疼痛和熱痛覺過敏，這提示miR-206可能充當(dāng)神經(jīng)性疼痛治療的潛在靶標(biāo)。本研究通過qRT-PCR法檢測了NGF誘導(dǎo)的PC12損傷細(xì)胞中miR-206的表達(dá)發(fā)現(xiàn)，其中miR-206異常降低，氧化應(yīng)激水平明顯升高，炎性水平明顯升高，細(xì)胞凋亡率顯著升高，過表達(dá)miR-206后，能夠明顯的減輕NGF誘導(dǎo)的PC12 細(xì)胞的上述損傷，這個(gè)結(jié)果揭示了miR-206 對NGF誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞具有抗氧化應(yīng)激、抗炎和抗凋亡功能，提示miR-206在缺氧誘導(dǎo)的神經(jīng)損傷中的潛在治療價(jià)值。深入研究發(fā)現(xiàn)，抑制miR-206明顯地減弱大黃素對缺氧誘導(dǎo)的PC12細(xì)胞損傷的保護(hù)作用，這更說明大黃素在神經(jīng)損傷中的保護(hù)作用的機(jī)制與上調(diào)miR-206的表達(dá)具有明顯相關(guān)性，兩者具有協(xié)同作用。

綜上所述，大黃素對缺氧誘導(dǎo)的神經(jīng)損傷具有抗氧化應(yīng)激、抗炎和抗凋亡的作用，其機(jī)制與協(xié)同miR-206相關(guān)。這個(gè)實(shí)驗(yàn)結(jié)果為中藥的功能機(jī)制的探索開辟了新道路，也為大黃素在神經(jīng)損傷疾病中的治療價(jià)值研究奠定基礎(chǔ)。