楊利，李小健，李朝軍

作者單位：唐山市豐潤區(qū)第二人民醫(yī)院骨科，河北 唐山064000

骨肉瘤是常見的原發(fā)性惡性骨腫瘤，常發(fā)生于青少年，每年發(fā)病率多達1～3 人/100 萬人，惡性程度較高，早期即可發(fā)生肺轉(zhuǎn)移。目前對于骨肉瘤的治療主要為手術切除輔以化療，但效果并不理想，30%～40%的病人在診斷后5年內(nèi)死亡，因此亟需尋求新的治療方法。澳洲茄胺是一種來源于茄屬植物的甾體生物堿，在我國主要存在于中草藥龍葵中，具有免疫調(diào)節(jié)、抑制基因合成、誘導細胞分化等作用，在一系列腫瘤中發(fā)現(xiàn)具有治療效應，包括宮頸癌、腸癌、肺癌、甲狀腺鱗癌等，如崔煥波、艾金霞使用澳洲茄胺處理人宮頸癌ME180 細胞24 h，發(fā)現(xiàn)細胞存活率降低，細胞周期阻滯于G1 期，呈現(xiàn)出典型的細胞凋亡結(jié)構(gòu)。但是，目前澳洲茄胺對人骨肉瘤細胞增殖是否具有抑制作用并未得到實驗驗證，作用機制也尚不清楚。因此，本研究通過構(gòu)建人骨肉瘤細胞移植瘤裸鼠模型，觀察澳洲茄胺對移植瘤生長是否具有抑制效應以及對細胞凋亡、血管生成相關因子表達的影響，并且初步探討其作用機制，本研究于2018年1月至2019年3月完成。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

40 只健康雌性的Balb/c 裸鼠購于北京維通利華實驗動物有限公司，生產(chǎn)許可證號SCXK（京）2012-0001，年齡范圍4～5 周，體質(zhì)量范圍16～18 g，按照SPF（Specific pathogen free）級別飼養(yǎng)。本研究符合一般動物實驗倫理學原則。

1.2 主要試劑與儀器

澳洲茄胺購自成都曼思特生物科技有限公司，人骨肉瘤MG63 細胞株購于中科院上海細胞庫；胎牛血清、Dulbecco 改良的Eagle培養(yǎng)基（DMEM）購于Gibco公司；一步法原位末端標記（TUNEL）細胞凋亡檢測試劑盒購于北京索萊寶；4'，6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）購于北京中杉金橋；蛋白裂解液、蛋白酶抑制劑、磷酸酶抑制劑、二喹啉甲酸（BCA）蛋白定量試劑盒和增強化學發(fā)光（ECL）顯色液購于上海碧云天；抗B 細胞淋巴瘤/白血病-2 相關X 蛋白（Bax）抗體、抗B 細胞淋巴瘤/白血病-2（Bcl-2）抗體、抗活化的半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3（Cleaved caspase-3）抗體、抗活化的半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-9（Cleaved caspase-9）抗體購于Abcam 公司；抗磷酸化磷脂酰肌醇3-激酶（p-PI3K）抗體、抗磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）抗體、抗磷酸化蛋白激酶B（p-AKT）抗體、抗蛋白激酶B（AKT）抗體購于Cell Signaling Technology 公司；抗血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）抗體、抗凝血酶敏感蛋白1（TSP-1）抗體購于Santa Cruz 公司；抗甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）抗體購于Proteintech 公司；辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔二抗購于武漢博士德；凝膠成像儀Gel Doc XR購于Bio-Rad公司。

1.3 動物模型的構(gòu)建與分組

MG63細胞培養(yǎng)于含有10%胎牛血清、1×10U/L青霉素、100 mg/L鏈霉素的DMEM 培養(yǎng)液中，放置于細胞培養(yǎng)箱中（37 ℃，5%二氧化碳）。將總體積為0.2 mL 的2×10個細胞懸液注射于裸鼠右側(cè)腋窩皮下，3 d后出現(xiàn)皮下結(jié)節(jié)。參照文獻中澳洲茄胺的使用劑量，將40只裸鼠隨機分為4組，即對照組、低劑量組（10 mg/kg）、中劑量組（20 mg/kg）、高劑量組（40 mg/kg），每組10只。低劑量組、中劑量組、高劑量組裸鼠分別按照10 mg/kg、20 mg/kg、40 mg/kg 的劑量腹腔注射給藥，分組后第1 天開始給藥，隔日給藥一次，連續(xù)4 周，對照組腹腔注射相同體積的磷酸鹽緩沖液（PBS）。

1.4 移植瘤質(zhì)量和體積的測量

觀察各組裸鼠的飲食、行為、精神狀態(tài)等一般表現(xiàn)。分組后每7天測量一次移植瘤的長度和寬度，計算移植瘤的體積=（長度×寬度）/2。在末次給藥的次日，即分組后第28 天，對移植瘤的長度和寬度進行測量后，頸椎脫臼法處死裸鼠，將移植瘤完整剝離后稱重。

1.5 TUNEL 染色

取移植瘤組織放置于4%的多聚甲醛中固定48 h，30%的蔗糖溶液脫水24 h，包埋后使用冰凍切片機制作厚度約為10 μm的切片。按照一步法TUNEL 細胞凋亡檢測試劑盒說明書進行染色：PBS 洗滌2 次，在樣品中加入50 μL 帶有FITC標簽的TUNEL 檢測液，37 ℃避光孵育60 min。PBS洗滌3 次，DAPI 復染后封片，使用倒置熒光顯微鏡觀察和拍照。

1.6 蛋白質(zhì)印跡法（Western blotting，WB）

將移植瘤置于液氮中，用研磨缽充分搗碎，每100 mg 的組織加入100 μL 蛋白裂解液，加入1%的蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑，冰上裂解2 h，期間每30 分鐘斡旋1 min。待組織裂解充分，12 000 g 離心10 min，取上清液獲得總蛋白，進行BCA 蛋白定量。取40 μg 的總蛋白與上樣緩沖液混勻，100 ℃高溫變性5 min，按照每孔20 μL 上樣進行聚丙烯酰胺凝膠電泳，隨后轉(zhuǎn)印聚偏二氟乙烯（PVDF）膜，5%的脫脂牛奶室溫封閉2 h 后，孵育抗Bax 抗體（1∶1 000）、抗Bcl-2 抗體（1∶1 000）、抗Cleaved caspase-3 抗體（1∶1 000）、抗Cleaved caspase-9 抗 體（1∶1 000）、抗VEGF 抗體（1∶1 000）、抗TSP-1 抗體（1∶500）、抗p-PI3K 抗體（1∶500）、抗PI3K 抗體（1∶1 000）、抗p-AKT 抗體（1∶500）、抗AKT 抗體（1∶1 000）和抗GAPDH抗體（1∶3 000）4 ℃過夜。次日取出膜，漂洗后室溫孵育辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔二抗2 h。漂洗后，滴加ECL 顯色液，使用凝膠成像儀曝光和拍照。使用Image Pro Plus 6.0 軟件測量各條帶的灰度值，將對照組中目的蛋白條帶和內(nèi)參蛋白GAPDH條帶的灰度值之比作為1。

2 結(jié)果

2.1 澳洲茄胺抑制腫瘤的生長

四組裸鼠的飲食、行為、精神狀態(tài)等一般情況無明顯異常和差異。10 mg/kg 組、20 mg/kg 組、40 mg/kg 組的移植瘤質(zhì)量低于對照組，且40 mg/kg 組的移植瘤質(zhì)量低于10 mg/kg組、20 mg/kg 組，差異有統(tǒng)計學意義（

P

＜0.05）。10 mg/kg 組、20 mg/kg 組、40 mg/kg 組的移植瘤體積在21 d 和28 d 時低于對照組，且40 mg/kg 組的移植瘤體積在21 d 和28 d 時低于10 mg/kg 組、20 mg/kg 組，差異有統(tǒng)計學意義（

P

＜0.05），見表1。

表1 40只人骨肉瘤移植瘤模型裸鼠移植瘤質(zhì)量和體積的比較/±s

2.2 TUNEL 染

色

10 mg/kg 組、20 mg/kg 組、40 mg/kg 組的TUNEL-FITC 的熒光強度高于對照組，且40 mg/kg 組的TUNEL-FITC 的熒光強度高于10 mg/kg組、20 mg/kg組。

2.3 澳洲茄胺對凋亡相關蛋白表達的影響

10 mg/kg 組、20 mg/kg 組、40 mg/kg 組 移 植 瘤 中Bax、Cleaved caspase-3、Cleaved caspase-9 蛋白的表達量高于對照組，Bcl-2 蛋白的表達量低于對照組，且40 mg/kg 組 移 植 瘤 中Bax、Cleaved caspase-3、Cleaved caspase-9 蛋白的表達量高于10 mg/kg 組、20 mg/kg組，Bcl-2 蛋白的表達量低于10 mg/kg 組、20 mg/kg組，差異有統(tǒng)計學意義（

P

＜0.05），見圖1A和表2。

表2 40只人骨肉瘤移植瘤模型裸鼠移植瘤組織中凋亡相關蛋白表達量的比較/±s

2.4 澳洲茄胺對VEGF 和TSP

-

1 表達的影響

10 mg/kg 組、20 mg/kg 組、40 mg/kg 組移植瘤中VEGF 蛋白的表達量低于對照組，TSP-1 蛋白的表達量高于對照組，且40 mg/kg 組移植瘤中VEGF 蛋白的表達量低于10 mg/kg 組、20 mg/kg 組，TSP-1 蛋白的表達量高于10 mg/kg 組、20 mg/kg 組，差異有統(tǒng)計學意義（

P

＜0.05），見圖1B和表3。

2.5 澳洲茄胺對PI3K/AKT 信號通路的影響

10 mg/kg 組、20 mg/kg 組、40 mg/kg 組移植瘤中p-PI3K和p-AKT 蛋白的表達量低于對照組，且40 mg/kg 組移植瘤中p-PI3K和p-AKT蛋白的表達量低于10 mg/kg 組、20 mg/kg 組，差異有統(tǒng)計學意義（

P

＜0.05），但是四組移植瘤中PI3K 和AKT 蛋白的表達量差異無統(tǒng)計學意義，見圖1C和表4。

3 結(jié)論

澳洲茄胺具有顯著的抗腫瘤活性，是一種十分具有應用前景的天然藥物，如李富仁、劉良發(fā)現(xiàn)，澳洲茄胺對于宮頸癌海拉細胞的生長具有顯著的抑制作用。

本研究將處于對數(shù)生長期的MG63 細胞注射于裸鼠皮下構(gòu)建動物模型，然后腹腔注射澳洲茄胺鹽溶液，觀察澳洲茄胺對移植瘤生長的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，澳洲茄胺處理組小鼠的移植瘤質(zhì)量低于對照組，腫瘤體積增加程度也小于對照組，而且40 mg/kg組的移植瘤體積在21 d 和28 d 時低于10 mg/kg 組、20 mg/kg 組，移植瘤質(zhì)量也低于10 mg/kg 組、20 mg/kg 組，表明給予澳洲茄胺的小鼠其移植瘤的生長受到顯著抑制，而且具有劑量依賴效應。同時，給予澳洲茄胺干預的小鼠，在飲食、行為和精神狀態(tài)等方面的表現(xiàn)同對照組無顯著差異，體現(xiàn)出澳洲茄胺良好的生物安全性。

表3 40只人骨肉瘤移植瘤模型裸鼠移植瘤組織中VEGF和TSP-1表達量的比較/±s

表4 40只人骨肉瘤移植瘤模型裸鼠移植瘤組織中PI3K/AKT信號通路相關蛋白表達量的比較/±s

圖1 WB檢測40只人骨肉瘤移植瘤模型裸鼠細胞凋亡與相關蛋白的表達情況：A為對凋亡相關蛋白表達的影響，B為對VEGF和TSP-1表達的影響，C為對PI3K/AKT信號通路的影響

腫瘤的發(fā)生發(fā)展，往往是由于多種不同的生理功能紊亂導致，其中抗凋亡作為其十分重要的生理特性之一，使得腫瘤細胞不斷增殖且不受凋亡信號控制。我們推測，澳洲茄胺抑制MG63 細胞成瘤的具體機制可能通過促進腫瘤細胞凋亡，因此我們將小鼠移植瘤取下后制成冰凍切片觀察，發(fā)現(xiàn)在給予澳洲茄胺的小鼠移植瘤中，凋亡的腫瘤細胞高于對照組，而且隨著給藥濃度的升高，凋亡的細胞越多。該結(jié)果表明，澳洲茄胺能夠促進MG63 細胞凋亡，從而抑制其在裸鼠體內(nèi)呈瘤，具有劑量依賴效應。

細胞凋亡受到多種蛋白的調(diào)控，其中Caspase家族在介導細胞凋亡中扮演著重要作用。當細胞發(fā)生凋亡時，上游多種凋亡活性物質(zhì)釋放，從而激活Caspase-9，進而活化Caspase-3 產(chǎn)生級聯(lián)效應，引起細胞凋亡。另一方面，Bcl-2家族眾中的Bax和Bcl-2 蛋白對細胞凋亡也具有重要的調(diào)控作用。其中，Bcl-2可以抑制Caspase 家族相關蛋白的活性從而抑制凋亡，而Bax能夠激活Caspase相關蛋白，從而促進細胞凋亡。通過對移植瘤中凋亡相關蛋白進行檢測，發(fā)現(xiàn)Caspase-9、Caspase-3以及Bax的表達在給予澳洲茄胺的移植瘤中均顯著增加，但Bcl-2的表達降低，而且以40mg/kg組的效應最為顯著。該結(jié)果表明在給予澳洲茄胺的小鼠中，促進凋亡的相關蛋白發(fā)生激活，然而抑制凋亡的蛋白受到抑制，使得MG63細胞的凋亡增加，導致移植瘤的生長受到抑制。

VEGF 參與調(diào)節(jié)皮膚、肺、腦、心臟、脊髓等一系列組織的修復和再生。VEGF 與骨肉瘤的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移也有密切的關系，如張黎明發(fā)現(xiàn)VEGF在骨肉瘤組織中呈高表達，可用于骨肉瘤臨床病理的輔助診斷和預后評價。本研究對移植瘤組織的VEGF 表達進行檢測，發(fā)現(xiàn)與對照組相比，澳洲茄胺處理組裸鼠的移植瘤中VEGF 的表達量顯著降低，而且劑量越高VEGF 的表達量越低，表明澳洲茄胺可以抑制VEGF 的表達，具有劑量依賴效應。TSP-1 是一種強有力的內(nèi)源性抗血管生成因子，具有抑制內(nèi)皮細胞增殖、誘導內(nèi)皮細胞凋亡、抑制血管生成因子與受體結(jié)合等生物學效應，通過抑制血管生成對多種腫瘤的生長具有抑制效應。本研究結(jié)果顯示，與對照組相比，澳洲茄胺處理組裸鼠的移植瘤中TSP-1 的表達量顯著升高，而且劑量越高TSP-1 的表達量越高，表明澳洲茄胺可以上調(diào)TSP-1的表達，具有劑量依賴效應。

作為目前腫瘤相關研究的重要通路之一，PI3K/AKT 通路在多種腫瘤發(fā)展機制中均扮演重要角色，其中便包括抗腫瘤凋亡。PI3K 是一種磷脂酰肌醇激酶，具有絲氨酸/蘇氨酸激酶的活性，其下游的AKT 是原癌基因c-akt 編碼的一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，活化的AKT 能夠影響下游多種效應分子，從而發(fā)揮多種重要的作用。大量研究表明，當PI3K/AKT 的過度活化后，能夠通過各種轉(zhuǎn)錄因子，調(diào)節(jié)下游Bcl-2、Bax、Caspase-9、Caspase-3 等多種凋亡相關蛋白，發(fā)揮抗凋亡作用。我們對移植瘤中PI3K/AKT 的相關蛋白進行檢測發(fā)現(xiàn)，在給予澳洲茄胺后，該通路的PI3K和AKT蛋白表達差異無統(tǒng)計學意義，但是其磷酸化激活程度發(fā)生顯著減弱，表明澳洲茄胺能夠影響PI3K和AKT蛋白的活性，但具體影響其活性的方式還有待繼續(xù)研究。

本研究的不足和展望：給予澳洲茄胺的濃度梯度不夠，不能明確反應藥物的濃度-藥效關系；本研究僅檢測了PI3K/AKT信號通路的表達變化，并認為其可能與澳洲茄胺誘導細胞凋亡、下調(diào)VEGF 表達、上調(diào)TSP-1表達等治療效應有關，但是未進行基因敲減或過表達的實驗，相關結(jié)論仍然缺乏足夠的證據(jù)支持；目前，已有龍葵或其合劑應用于肝癌、骨髓瘤等腫瘤病人的報道，但是尚無龍葵在骨肉瘤病人中應用的報道，而且其活性成分澳洲茄胺也無臨床應用的報道，本研究對于明確龍葵的抗腫瘤活性成分以及下一步澳洲茄胺的臨床應用提供了理論基礎。

綜上所述，澳洲茄胺可以抑制MG63 細胞皮下移植瘤的生長，誘導細胞凋亡，下調(diào)VEGF 的表達，上調(diào)TSP-1 的表達，其作用機制可能與PI3K/AKT 信號通路的抑制有關。