楊盼，成林杰，單瑋碧，艾孜買(mǎi)提·肉孜江，姚巧玲

作者單位：新疆醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，新疆維吾爾自治區(qū) 烏魯木齊830011

睡眠呼吸暫停綜合征（Obstructive sleep apnea，OSA）是一種以睡眠中反復(fù)發(fā)生的上呼吸道完全或部分塌陷而造成的通氣中斷為特征的睡眠障礙性疾病?？蓪?dǎo)致多個(gè)臟器的損害，包括心血管系統(tǒng)損害，代謝功能損害及大腦認(rèn)知功能障礙，可嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量和壽命。其中間歇性缺氧（Intermittent hypoxia，IH）是OSA的主要標(biāo)志和特征。

將動(dòng)物暴露于IH 是一種常見(jiàn)的OSA 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?，有研究表明IH可促進(jìn)腫瘤的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移。Akt／mTOR（蛋白激酶B/哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白）信號(hào)通路作為腫瘤領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)，被證明在多種腫瘤中異常激活，調(diào)控腫瘤細(xì)胞的存活、增殖及遷移。研究發(fā)現(xiàn)Akt／mTOR信號(hào)通路的活化可為細(xì)胞的生長(zhǎng)、蛋白質(zhì)的合成提供有利條件，進(jìn)而為細(xì)胞的抗凋亡提供途徑。Akt/mTOR 信號(hào)通路和凋亡是否在OSA 合并腫瘤的發(fā)生和進(jìn)展中發(fā)揮調(diào)控作用，目前國(guó)內(nèi)外均沒(méi)有報(bào)道。2018年3—5月，選用在新疆醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物房購(gòu)買(mǎi)的8 周齡清潔級(jí)昆明鼠制備IHS180實(shí)體瘤模型，探討Akt／mTOR信號(hào)通路及凋亡在OSA合并腫瘤發(fā)病機(jī)制中的作用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

8 周齡的昆明小鼠（雄性）16 只，體質(zhì)量（21±2）g，購(gòu)自新疆醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心[許可證號(hào)SCXK（新）2018-0001）］。實(shí)驗(yàn)期間，室溫在22 ℃左右，照明時(shí)間為9：00-21：00，小鼠自由飲水和喂食，本研究符合一般動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理學(xué)原則。

1.2 實(shí)驗(yàn)儀器及試劑

S180實(shí)體瘤（贈(zèng)送），胎牛血清（10091-148），美國(guó)Gibco，0.25%胰酶（J112861）、雙抗（SV30010）、DMEM 高糖（SH30022.0）購(gòu)置于美國(guó)Hyclone，TUNEL 試劑盒（MK1028）購(gòu)于博士德生物，BCA 蛋白定量試劑盒（UB276927）、RIPA 裂解液（TK274910）購(gòu)置于美國(guó)Thermo，蛋白激酶B（Akt、#4865）、磷酸化Akt（p-Akt、#4060）、哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白（mTOR、#2983）、磷酸化mTOR（p-mTOR、#5536）兔來(lái)源的單克隆抗體購(gòu)置于美國(guó)CST公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1

細(xì)胞培養(yǎng)及處理 將S180 實(shí)體瘤放于含10%胎牛血清及DMEM 高糖的完全培養(yǎng)基中，置于37 ℃5%二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，根據(jù)細(xì)胞生長(zhǎng)情況進(jìn)行傳代，離心去上清，加入完全培養(yǎng)液吹打，使細(xì)胞懸浮于完全培養(yǎng)液中，并進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，調(diào)整濃度為1×10/mL，取3 只正常的小鼠，每只鼠腹腔打0.2 mL 的細(xì)胞懸液，制備惡性腹水瘤小鼠模型。10 d 后，選取生長(zhǎng)良好的S180 荷瘤小鼠（腹水型）無(wú)菌條件下抽取腹水，以完全培養(yǎng)液1∶1 稀釋成瘤細(xì)胞懸液，制成1×10/mL 的細(xì)胞懸液備用，每只小鼠接種0.2 mL（細(xì)胞數(shù)2×10個(gè)）。

1.3.2

動(dòng)物模型的建立 腫瘤接種：用75%乙醇消毒小鼠腋下，細(xì)胞懸液在使用前用槍混勻，然后用1 mL無(wú)菌注射器吸取0.2 mL的懸液，并將其接種于小鼠左前肢腋下部皮下，形成圓形小皮丘，注射完停10 s，出針。

缺氧的暴露：把接種S180實(shí)體瘤的小鼠采用隨機(jī)數(shù)字表法隨機(jī)分為RA 組和IH 組。IH 按照本課題組以往的造模方式進(jìn)行，小鼠放到缺氧箱中，IH循環(huán)由30 s 氮?dú)夂?0 s 氧氣組成，每個(gè)IH 循環(huán)是1 min，氧的最低濃度為（7±1）%，IH 暴露時(shí)間為9：00～21：00，連續(xù)2 周。RA 組小鼠在普通鼠籠進(jìn)行飼養(yǎng)，IH 組和RA 組小鼠在同一房間，實(shí)驗(yàn)期間，所有小鼠自由飲水和進(jìn)食。IH 暴露兩周后，小鼠稱(chēng)體質(zhì)量，用4%水合氯醛麻醉，取腫瘤組織稱(chēng)重，一半組織液氮速凍，保存于-80 ℃?zhèn)溆?；另一半組織浸泡在4%甲醛里面，用于石蠟切片。

1.3.3

腫瘤組織細(xì)胞凋亡檢測(cè) 4%甲醛固定后，腫瘤組織常規(guī)脫水、透明、浸蠟、包埋、切片；取石蠟切片，按照TUNEL 檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行凋亡檢測(cè)，每組隨機(jī)選擇5個(gè)視野，計(jì)數(shù)凋亡小體，取均數(shù)。

1.3.4

Western blotting 檢測(cè)蛋白表達(dá) 取適量腫瘤組織，加入已配好的含蛋白酶和磷酸酶抑制劑的RIPA裂解液，充分混勻，剪碎，超聲。冰上裂解30 min，裂解完成后，在4 ℃，12 000 r/min條件下離心20 min，收集上清，BCA法測(cè)定蛋白濃度。配膠，依次進(jìn)行電泳和轉(zhuǎn)膜，隨后用1%的BSA進(jìn)行封閉1 h，一抗孵育，4 ℃過(guò)夜（Akt、p-Akt的抗體稀釋比為1∶1 000，mTOR、p-mTOR及β-actin抗體稀釋比為1∶2 000），TBST洗3次，每次5 min。二抗孵育1 h 后，TBST 洗3 次，采用ECL法顯色，將條帶置于成像儀中，拍照并保存。蛋白條帶灰度值用Image J計(jì)算、分析。

2 結(jié)果

2.1 腫瘤組織質(zhì)量占比情況

小鼠瘤質(zhì)量RA組和IH 組小鼠腫瘤組織的質(zhì)量分別為0.22（0.15，2.30）和2.76（1.93，4.14），IH 組腫瘤組織質(zhì)量高于RA 組（

Z

=-2.143，

P＜

0.05）。RA 組和IH 組腫瘤組織質(zhì)量占小鼠體質(zhì)量的比例分別為2.46%和8.87%，IH 組腫瘤組織質(zhì)量占小鼠體質(zhì)量的百分比高于RA 組，兩組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（

Z

=-2.429，

P＜

0.05）。

2.2 腫瘤組織細(xì)胞凋亡情況

RA組腫瘤組織切片中相應(yīng)凋亡小體個(gè)數(shù)為（129.75±20.20）個(gè)，IH組腫瘤組織切片中凋亡小體個(gè)數(shù)為（81.18±8.92）個(gè)；IH組腫瘤組織切片中凋亡小體個(gè)數(shù)低于RA組（

t

=2.424，

P＜

0.05）。

2.3 Western blotting 檢測(cè)Akt、p

-

Akt 在IH 和RA腫瘤組織中的表達(dá)

RA 組和IH 組腫瘤組織中Akt的相對(duì)表達(dá)量分別為（0.79±0.03）、（0.80±0.03），兩組表達(dá)量差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（

t

=-0.128，

P＞

0.05）。IH 組腫瘤組織中p-AKT 的相對(duì)表達(dá)量（0.62±0.02）高于RA組（0.50±0.04）（

t

=-2.604，

P＜

0.05）。見(jiàn)圖1。

2.4 mTOR、p

-

mTOR 在IH 組和RA組腫瘤組織中的表達(dá)

RA 組和IH 組腫瘤組織中mTOR 的相對(duì)表達(dá)量分別為（0.64±0.04）、（0.62±0.06），兩組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（

t

=0.243，

P＞

0.05）。IH 組中p-mTOR 的相對(duì)表達(dá)量（0.35±0.02）高于RA 組（0.26±0.03）（

t

=-2.711，

P＜

0.05）。見(jiàn)圖2。

圖1 常氧組（RA）與間歇性缺氧組（IH）Western blotting 檢測(cè)Akt、p-Akt及β-actin的表達(dá)

圖2 Western blotting檢測(cè)mTOR、p-mTOR及β-actin的表達(dá)

3 討論

近幾年的研究發(fā)現(xiàn)OSA模式的間歇性缺氧可以促進(jìn)腫瘤的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移。2012年西班牙學(xué)者Almendros發(fā)現(xiàn)暴露在間歇性環(huán)境2周的小鼠與正常組比較其黑色素實(shí)體瘤的體積、質(zhì)量均增加。Huang也發(fā)現(xiàn)暴露在間歇性環(huán)境5周的小鼠與正常組比較其腫瘤的體積、質(zhì)量均增加。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證明OSA 模式間歇低氧不僅與腫瘤發(fā)生有關(guān)，且與腫瘤的生長(zhǎng)有關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)間歇性缺氧環(huán)境暴露2周后，IH組S180腫瘤的質(zhì)量明顯高于RA組（

P＜

0.05），IH組S180腫瘤質(zhì)量占小鼠體質(zhì)量的百分比高于RA組（

P＜

0.05），說(shuō)明間歇性缺氧可促進(jìn)實(shí)體瘤的生長(zhǎng)。腫瘤在生長(zhǎng)過(guò)程中存在著細(xì)胞增殖與凋亡的失衡，細(xì)胞凋亡受到抑制會(huì)使細(xì)胞死亡率下降，將導(dǎo)致細(xì)胞數(shù)目不斷增加，表現(xiàn)出生長(zhǎng)的優(yōu)勢(shì)。因此，我們檢測(cè)了腫瘤組織中的細(xì)胞凋亡情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)IH 組S180 腫瘤組織切片中相應(yīng)凋亡小體個(gè)數(shù)低于RA 組（

P＜

0.05）。說(shuō)明IH 所致的腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)加速與IH條件下細(xì)胞的凋亡減少有關(guān)。mTOR 信號(hào)通路與凋亡、炎癥和自噬等多種腫瘤的發(fā)病機(jī)制有關(guān)。研究表明，胰腺癌、白血病、膀胱癌等腫瘤可通過(guò)抑制mTOR活化促進(jìn)細(xì)胞凋亡進(jìn)程。我們的研究發(fā)現(xiàn)IH 組S180 腫瘤組織切片中凋亡小體個(gè)數(shù)低于RA 組（

P＜

0.05）。說(shuō)明在本實(shí)驗(yàn)條件下，磷酸化mTOR 的激活可能抑制了細(xì)胞的凋亡進(jìn)程，從而促進(jìn)了腫瘤組織的生長(zhǎng)。

mTOR 可被PI3K/Akt 途徑激活?；罨牧字＜〈?-激酶（phosphatidylinositol-3-kinase，PI3K）可在3-磷酸肌醇依賴(lài)蛋白激酶1（3-phosphoinositidedependent protein kinase1，PDK1）的協(xié)同下磷酸化Akt 使其被激活。活化的Akt 磷酸化結(jié)節(jié)性腦硬化復(fù)合物-2（Tuberous sclerosis complex-2，TSC2），而被磷酸化的TSC2 將從負(fù)向調(diào)控腦內(nèi)Ras 同系物（Ras homolog enriched in brain，Rheb）的結(jié)節(jié)性腦硬化復(fù)合物-1（Tuberous sclerosis complex-1，TSC1）/TSC2 復(fù)合物中解聚，使Rheb 活性增強(qiáng)，正向調(diào)控mTOR 的活性。磷酸化Akt 的增加，mTOR 也增加，因此，Akt與mTOR 可構(gòu)成Akt/mTOR 通路，Akt 由480 個(gè)氨基酸殘基組成，具有可催化及可調(diào)節(jié)活性區(qū)域，該區(qū)域可使Akt 磷酸化成p-Akt 而發(fā)揮各種生理功能。mTOR 是Akt 的下游底物，活化的Akt 可直接激活mTOR 而發(fā)揮調(diào)控細(xì)胞的周期、生長(zhǎng)增殖等作用。大量研究表明，多種實(shí)體瘤組織中均有Akt、mTOR 蛋白的異常表達(dá)。有研究表明Akt、mTOR 磷酸化水平增加可使腫瘤細(xì)胞凋亡減少，在我們的研究中，p-mTOR 上調(diào)的同時(shí)Akt的磷酸化被激活，說(shuō)明Akt/mTOR 通路被激活，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞凋亡減少，這可能是腫瘤細(xì)胞凋亡減少的原因。

Akt／mTOR 信號(hào)通路不僅與腫瘤的凋亡有關(guān)，還可能與腫瘤的預(yù)后關(guān)系密切，張剛等發(fā)現(xiàn)宮頸癌、肺癌和胃癌的發(fā)生發(fā)展及預(yù)后變差與Akt／mTOR信號(hào)通路的激活關(guān)系密切。我們的結(jié)果表明IH暴露后，S180 實(shí)體瘤腫瘤組織Akt/mTOR 通路上調(diào)，提示IH可能是OSA 導(dǎo)致實(shí)體瘤預(yù)后變差的原因之一。

綜上所述，IH 可促進(jìn)腫瘤的生長(zhǎng)，導(dǎo)致缺氧小鼠腫瘤重量增加，其機(jī)制可能同Akt-mTOR 通路在腫瘤組織中的激活，減少腫瘤組織凋亡小體的數(shù)量，抑制了腫瘤細(xì)胞凋亡有關(guān)。