馮華夷，張曉威，陸航

(1.上海市徐匯區(qū)中心醫(yī)院 普通外科，上海 200031；2.錦州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院 普通外科，遼寧 錦州 121000)

作為最常見的消化系統(tǒng)惡性腫瘤之一，胃癌在我國(guó)消化道惡性腫瘤中位居第二。胃癌同一些惡性腫瘤一樣具有早期診斷率低和死亡率高的特征[1]。在世界范圍內(nèi)每年有成千上萬的新增病例和相關(guān)死亡病例，因此胃癌是一種嚴(yán)重威脅人類健康的疾病。而目前針對(duì)這種嚴(yán)重威脅人類生命健康的疾病只有根治性手術(shù)是有效的治療手段。但是，許多患者在診斷時(shí)已經(jīng)進(jìn)展到不可切除的階段或已有遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。雖然新輔助化療能夠延長(zhǎng)進(jìn)展期胃癌患者的生存期，但是其中位生存率依然較低。對(duì)于那些不能切除或已發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的患者，姑息性化療能夠提高患者的生存率和生活質(zhì)量。然而，包括氟尿嘧啶和順鉑在內(nèi)的作為進(jìn)展期胃癌治療標(biāo)準(zhǔn)的化療藥物對(duì)進(jìn)展期胃癌最終的治療效果仍然不佳。因此，進(jìn)一步從分子水平上更好地了解這種疾病以及探索新的更有效的治療藥物是非常必要的。近年來，針對(duì)惡性腫瘤的分子靶向治療成為研究的熱門領(lǐng)域，其中一些分子靶向藥物獲得了預(yù)期的臨床治療效果[2-3]。辛二酰苯胺異羥肟酸(suberoylanilide hydroxamic acid，SAHA)作為一種新型的組蛋白去乙?；敢种苿?histone deacetylase inhibitor，HDACI)，能夠改變包括腫瘤細(xì)胞的增殖和基因表達(dá)的調(diào)節(jié)等相關(guān)過程中的組蛋白和非組蛋白的乙?；健Ｖ暗难芯堪l(fā)現(xiàn)，HDACI能夠通過翻譯后修飾導(dǎo)致與腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)抑制、分化、凋亡和自噬相關(guān)的細(xì)胞死亡[4]。此外，當(dāng)與其他藥物聯(lián)合使用時(shí)，HDACI具有協(xié)同效應(yīng)[5]?，F(xiàn)在，SAHA已經(jīng)應(yīng)用于難治性皮膚淋巴瘤的治療，因?yàn)槠淠軌蛲ㄟ^誘導(dǎo)細(xì)胞調(diào)節(jié)和分化使細(xì)胞周期阻滯[6]。最近，許多組織機(jī)構(gòu)研究其在治療其他腫瘤方面的效應(yīng)[7-8]。近些年，SAHA在治療胃腸道腫瘤方面獲得了良好的效果[9]。然而，SAHA對(duì)胃癌的抗癌效應(yīng)分子機(jī)制尚不清晰。所以，我們通過研究胃癌細(xì)胞株MKN-28暴露于SAHA后細(xì)胞增殖、衰老及凋亡的變化，希望對(duì)于胃癌的分子靶向治療提供一種理論和實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)以及對(duì)胃癌臨床治療的新理解。

1 材料與方法

1.1 材料實(shí)驗(yàn)材料包括胃癌MKN-28(上海細(xì)胞庫(kù))細(xì)胞株、二甲亞砜 (DMSO)、四甲基偶氮唑藍(lán) (MTT)、RPMI-1640培養(yǎng)基、胰蛋白酶、小牛血清、Triton X-100及碘化丙啶PI(美國(guó)Sigma公司)，檢測(cè)細(xì)胞周期、細(xì)胞凋亡的試劑盒(南京凱基生物科技發(fā)展有限公司)?？贵w包括乙?；M蛋白H3(actylation-histone 3，AC-H3)抗體、乙?；M蛋白H4(actylation-histone 4，AC-H4)抗體、細(xì)胞周期蛋白(cyclin D1)、β-actin抗體、兔Ⅱ抗、鼠Ⅱ抗(Santa Cruz公司)。SAHA(20 mg)先以DMSO溶解后，再以培養(yǎng)基RPMI-1640稀釋至1 mmol·L-1，作為母液備用。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)在RPMI-1640培養(yǎng)基內(nèi)(其中含體積分?jǐn)?shù)為10%的小牛血清)，37 ℃ ，體積分?jǐn)?shù)為5%的CO2的孵箱內(nèi)培養(yǎng)細(xì)胞，每48～72 h 傳代，2.5 g·L-1胰酶消化。選取對(duì)數(shù)期的細(xì)胞實(shí)施后續(xù)的實(shí)驗(yàn)。

1.3 MTT比色法檢測(cè)細(xì)胞的增殖選用處于對(duì)數(shù)期的細(xì)胞，依照大約每孔1×10個(gè)接種到96孔板，實(shí)驗(yàn)組分別加入藥物，且使SAHA終濃度為0.5、1.0、1.5、2.0、3.0、5.0、10.0 μmol·L-1，而將同等量的DMSO加在對(duì)照組中，每個(gè)實(shí)驗(yàn)組設(shè)5個(gè)重復(fù)孔。完全培養(yǎng)基中，37 ℃，體積分?jǐn)?shù)為5%的CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)24、48、72 h后，每孔加20 μL MTT，繼續(xù)孵育4 h，丟棄上清液，然后將150 μL DMSO加入其中溶解，震蕩混合均勻，用酶標(biāo)儀測(cè)定在490 nm處樣品的吸光度值，并取其平均值后繪制生長(zhǎng)曲線。對(duì)照組與實(shí)驗(yàn)組吸光度的差值占對(duì)照組吸光度值的百分比為細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制率。

1.4 細(xì)胞衰老檢測(cè)按照細(xì)胞衰老β-半乳糖苷酶染色試劑盒說明書中的實(shí)驗(yàn)步驟檢測(cè)與β-半乳糖苷酶相關(guān)的細(xì)胞衰老。首先，丟棄細(xì)胞培養(yǎng)液后用磷酸鹽緩沖液(PBS)對(duì)MKN-28細(xì)胞進(jìn)行3次清洗，然后用40 g·L-1多聚甲醛對(duì)MKN-28細(xì)胞進(jìn)行固定15 min。再對(duì)MKN-28細(xì)胞使用PBS清洗3次，在其中加入0.05 g·L-1X-gal后將樣品放在37 ℃溫度且避光的培養(yǎng)箱內(nèi)孵育過夜。最后，在顯微鏡(Olympus，Tokyo，Japan)下(400×)觀察細(xì)胞并拍照。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.5 凋亡實(shí)驗(yàn)細(xì)胞培養(yǎng)及處理如前述。使用流式細(xì)胞儀測(cè)定碘化丙啶(PI)染色和熒光素(FTIC)標(biāo)記的Annexin Ⅴ，從而檢測(cè)MKN-28細(xì)胞的凋亡。簡(jiǎn)言之，用PBS清洗細(xì)胞后重懸細(xì)胞于1× Binding Buffer中，然后加入5 μL PI和5 μL Annexin Ⅴ FITC孵育。輕輕渦旋混合后將樣品在黑暗中孵育15 min，然后向每管中加入400 μL 1× Binding Buffer。最后，在孵育后的1 h的時(shí)間內(nèi)對(duì)樣品進(jìn)行流式細(xì)胞儀檢測(cè)。MKN-28細(xì)胞的早期凋亡細(xì)胞率即Annexin Ⅴ FITC+/PI-的細(xì)胞百分率，而其晚期凋亡細(xì)胞率為Annexin Ⅴ FITC+/PI+的細(xì)胞百分率，二者之和為總凋亡率。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.6 Western blotting檢測(cè)蛋白表達(dá)收集生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)期且經(jīng)暴露于終濃度為1.0、2.0 μmol·L-1SAHA處理36 h后的MKN-28細(xì)胞，然后將每個(gè)樣品中加入適量的RIPA蛋白裂解液(含蛋白酶抑制劑)，渦旋混勻，靜置于冰上10 min，進(jìn)行充分裂解，然后在13 000 r·min-14 ℃溫度條件下離心20 min。取上清液，棄去沉淀。用牛血清白蛋白(BSA)作為參照的Bio-Rad公司的蛋白實(shí)驗(yàn)試劑盒對(duì)對(duì)照組及實(shí)驗(yàn)組的蛋白濃度進(jìn)行定量。通過運(yùn)用聚丙烯酰胺凝膠電泳對(duì)不同大小的蛋白進(jìn)行分離，然后將蛋白轉(zhuǎn)印至聚偏二氟乙烯膜(PVDF膜)，對(duì)于膜內(nèi)非特異性抗體運(yùn)用體積分?jǐn)?shù)為5%的脫脂牛奶進(jìn)行封閉。然后加入相應(yīng)的一抗使其與PVDF膜上的目的蛋白相反應(yīng)，在4 ℃的條件下孵育2 h。用等滲緩沖鹽溶液(TBST)對(duì)膜進(jìn)行洗滌，在室溫環(huán)境下加入相應(yīng)二抗并孵育1 h，最后再次用TBST對(duì)孵育后的PVDF膜進(jìn)行3次洗滌。在PVDF膜上滴加化學(xué)發(fā)光試劑后通過X射線曝光、顯像，并記錄。用β-actin作為內(nèi)參，觀察各組MKN-28細(xì)胞內(nèi)AC-H3及AC-H4、凋亡誘導(dǎo)因子(apoptosis-inducing factor，AIF)蛋白的表達(dá)情況。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

2 結(jié)果

2.1 SAHA對(duì)胃癌細(xì)胞MKN-28增殖及衰老的效應(yīng)將胃癌MKN-28細(xì)胞暴露于不同藥物濃度的SAHA后，觀察到SAHA能夠通過劑量依賴和時(shí)間依賴的方式抑制MKN-28細(xì)胞的增殖?；谶@種結(jié)果，從中選取用SAHA處理72 h抑制率為(64.26±1.02)%的藥物濃度1.0 μmol·L-1及(79.55±0.94)%的藥物濃度2.0 μmol·L-1進(jìn)行后續(xù)的實(shí)驗(yàn)(P<0.05)(圖1)。同樣觀察到相對(duì)于對(duì)照組，用SAHA處理的實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞衰老相關(guān)的β-半乳糖苷酶染色率較高(圖2)。

圖1 SAHA對(duì)MKN-28細(xì)胞增殖的影響(P<0.05)

A為對(duì)照組；B為SAHA 1 μmol·L-1處理組；C為SAHA 2 μmol·L-1處理組。

2.2 SAHA對(duì)胃癌細(xì)胞MKN-28細(xì)胞凋亡的影響凋亡實(shí)驗(yàn)顯示SAHA能夠通過劑量依賴方式誘導(dǎo)MKN-28細(xì)胞凋亡。用SAHA處理細(xì)胞48 h后，MKN-28細(xì)胞凋亡中細(xì)胞總凋亡率百分比由(11.69±0.17)%增至(15.37±0.51)%(SAHA 1.0 μmol·L-1)及(19.93±0.36)%(SAHA 2.0 μmol·L-1)，相對(duì)于對(duì)照組差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖3、4)。

A為對(duì)照組；B為SAHA 1 μmol·L-1處理組；C為SAHA 2 μmol·L-1處理組。

圖4 SAHA對(duì)MKN-28細(xì)胞凋亡的影響柱狀圖(P<0.01)

2.3 SAHA對(duì)胃癌細(xì)胞MKN-28相關(guān)蛋白表達(dá)的影響作為一種組蛋白去乙?；敢种苿?，SAHA應(yīng)該使暴露于其中的細(xì)胞的乙?；M蛋白增加。Western blotting結(jié)果顯示SAHA可以通過劑量依賴的方式使AC-H3、AC-H4的表達(dá)水平增加(圖5)。Western blotting結(jié)果顯示SAHA通過劑量依賴的方式使AC-H3、AC-H4、AIF蛋白表達(dá)水平上調(diào)(圖6)。

GAPDH為甘油醛-3-磷酸脫氫酶；AC-H3為乙?；M蛋白H3；AC-H4為乙?；M蛋白H4；AIF為凋亡誘導(dǎo)因子。

AC-H3為乙?；M蛋白H3；AC-H4為乙?；M蛋白H4；AIF為凋亡誘導(dǎo)因子。

3 討論

SAHA作為新型的組蛋白去乙酰化酶抑制劑之一，可以通過干擾去乙?；竵硖岣咭职┗虻谋磉_(dá)水平，從而抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)并導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞凋亡[4,10-11]。之前的研究顯示SAHA對(duì)胃腸道腫瘤具有抗腫瘤效應(yīng)[9,12]。近年來，SAHA對(duì)胃癌抗腫瘤的效應(yīng)引起人們關(guān)注，但其機(jī)制尚不清晰。在本研究中，用MKN-28細(xì)胞研究SAHA對(duì)胃癌細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制作用。MTT實(shí)驗(yàn)顯示SAHA通過劑量依賴方式明顯抑制MKN-28細(xì)胞生長(zhǎng)。SAHA同樣提高M(jìn)KN-28細(xì)胞的衰老率。

細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示SAHA同樣可以誘導(dǎo)胃癌MKN-28細(xì)胞凋亡。為了進(jìn)一步深入探究SAHA對(duì)胃癌細(xì)胞凋亡的影響的相關(guān)分子機(jī)制，本研究進(jìn)行了Western blotting實(shí)驗(yàn)。和先前研究的結(jié)果相同，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果也證明了SAHA明顯增加乙酰化組蛋白H3和H4的水平[13-15]。通過乙?；D(zhuǎn)移酶的作用將一個(gè)乙?；肿蛹藿釉诘鞍踪|(zhì)分子鏈內(nèi)的氨基酸上的過程即蛋白質(zhì)乙?；?。組蛋白乙?；傅闹饕δ苁谴龠M(jìn)基因轉(zhuǎn)錄，而去蛋白去乙?；竸t是抑制基因轉(zhuǎn)錄。而這種主要發(fā)生在賴氨酸上的乙酰化修飾調(diào)節(jié)是維持細(xì)胞正常功能的重要途徑[16]。先前的相關(guān)研究證實(shí)蛋白乙?；叭ヒ阴；漠惓?dǎo)致其結(jié)構(gòu)及功能異常，通過升高組蛋白H3及H4乙?；?，組蛋白去乙酰化酶抑制劑能夠?qū)е录?xì)胞內(nèi)凋亡程序啟動(dòng)，從而誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生凋亡[17-18]。AIF是一種線粒體蛋白，其具有氧化還原酶和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡兩種活性。AIF從線粒體到細(xì)胞核的轉(zhuǎn)位足以介導(dǎo)以非caspases依賴的體外細(xì)胞凋亡的發(fā)生[19-20]。SAHA通過劑量依賴的方式使AIF蛋白表達(dá)水平上調(diào)。綜上，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示SAHA能夠通過上調(diào)AIF蛋白表達(dá)，從而誘導(dǎo)MKN-28細(xì)胞的凋亡。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示SAHA在體外抑制MKN-28細(xì)胞增殖及誘導(dǎo)MKN-28細(xì)胞衰老、凋亡的機(jī)制可能是通過上調(diào)相關(guān)基因表達(dá)實(shí)現(xiàn)的，而其中的具體分子機(jī)制有待進(jìn)一步研究。