王一帆, 張曉華, 陳清海, 蘇寶川, 連其祥, 鄒雙全, 孫維紅, 邱夢(mèng)媛

(1.福建農(nóng)林大學(xué)林學(xué)院，福建 福州 350002；2.自然生物資源保育利用福建高校工程技術(shù)研究中心，福建福州 350002；3.泉州市林業(yè)局，福建 泉州 362000；4.壽寧縣林業(yè)局種苗站，福建 壽寧 355500)

梔子(GardeniajasminoidesEllis)為茜草科(Rubiaceae)梔子屬(Gardenia)常綠灌木，是極具潛力的觀賞及經(jīng)濟(jì)價(jià)值植物，同時(shí)也是列入國(guó)家植物新品種權(quán)保護(hù)與審定主要林木品種目錄的物種.目前關(guān)于梔子的研究主要集中于化學(xué)成分提取及藥理作用方面[1]，同時(shí)對(duì)梔子培育管理方面也進(jìn)行了相關(guān)研究[2]，但未查閱到有關(guān)梔子品種的《植物新品種DUS測(cè)試指南》，缺少具體的等級(jí)劃分范圍和級(jí)差，這在一定程度上影響了梔子新品種的選育工作.2017年中國(guó)園林網(wǎng)報(bào)道了一種浙江梔子新品種——‘梔香富潤(rùn)’，其枝型緊湊，葉小、花量多、不結(jié)果、味香甜，有枝條生長(zhǎng)就有花苞，花期長(zhǎng)達(dá)180 d以上，從5月中旬開(kāi)至11月底，在大棚暖房?jī)?nèi)的花期可達(dá)250 d以上[3].目前，還沒(méi)有關(guān)于福建梔子新品種的報(bào)道.

植物新品種鑒定的基本原則是：品種具有特異性、一致性和穩(wěn)定性[4].目前關(guān)于品種鑒定常用的方法有形態(tài)學(xué)鑒定法、生化鑒定法和分子標(biāo)記法[5].形態(tài)學(xué)鑒定是通過(guò)植物的外部特征來(lái)區(qū)分不同的植物[6]，如植株葉片大小、葉片顏色、花瓣數(shù)、萼片數(shù)、果實(shí)顏色等.根據(jù)表型性狀來(lái)檢測(cè)遺傳多樣性是最為直接和簡(jiǎn)便易行的方法，這種方法具有簡(jiǎn)便、經(jīng)濟(jì)和高效等特點(diǎn)[7]，是專(zhuān)家學(xué)者們?cè)谥参锓N質(zhì)資源鑒定及育種材料的選擇上廣泛運(yùn)用的一種重要方法.目前，已有采用形態(tài)學(xué)方法鑒別梔子的研究[8]，但形態(tài)學(xué)鑒定易受環(huán)境因素和植物不同發(fā)育時(shí)期的影響，存在一定的局限性，不能真實(shí)反映遺傳變異.而分子標(biāo)記是以個(gè)體間堿基水平的差異作為依據(jù)[9]，能克服形態(tài)標(biāo)記的缺點(diǎn)，因此是研究物種、種間和種內(nèi)遺傳多樣性及品種間親緣關(guān)系鑒定的有效方法.目前對(duì)于梔子親緣關(guān)系的研究主要采用隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA(RAPD)技術(shù)[10]和簡(jiǎn)單重復(fù)序列間擴(kuò)增(ISSR)技術(shù)[11]，但尚未見(jiàn)單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphism, SNP)用于梔子研究的報(bào)道.SNP與其他分子標(biāo)記相比具有更多的優(yōu)點(diǎn)，如SNP在基因組中分布廣、數(shù)量多、穩(wěn)定性強(qiáng)，具有二態(tài)性和等位基因，可通過(guò)測(cè)序直接進(jìn)行不同個(gè)體間的序列對(duì)比[12-13].

2014年本課題組于福建省清流縣發(fā)現(xiàn)一種常年開(kāi)花的梔子新資源，其花期長(zhǎng)達(dá)286 d以上，暫定植物名為四季梔子.目前，國(guó)內(nèi)外還沒(méi)有關(guān)于四季梔子的研究，為了驗(yàn)證四季梔子是否為本地梔子變異種的猜想，以及與‘梔香富潤(rùn)’的區(qū)別，本研究對(duì)四季梔子的生物學(xué)特性以及與相近種的親緣關(guān)系進(jìn)行了分析，希望能為區(qū)別不同梔子資源提供理論支持，也為梔子優(yōu)良性狀的挖掘開(kāi)發(fā)提供參考，這對(duì)促進(jìn)福建梔子新品種選育及具有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的鄉(xiāng)土藥用和觀賞植物的開(kāi)發(fā)具有重要意義.

1 材料與方法

1.1 材料來(lái)源

試驗(yàn)材料為清流10多年生四季梔子母株、2年生四季梔子扦插植株、清流梔子和浙江梔子‘梔香富潤(rùn)’.

試驗(yàn)地位于清流縣南部(北緯25°50′42″，東經(jīng)116°47′50″)，地處中低緯度，四季分明，屬亞熱帶季風(fēng)氣候，晝夜溫差大, 年平均氣溫16.5～18.0 ℃，1月份平均氣溫5.2～5.7 ℃，極端最低氣溫-12.8 ℃，7月份平均氣溫27.1～28.1 ℃， 極端最高氣溫39.9 ℃，年降水量1 700～2 000 mm， 無(wú)霜期230～280 d，年日照時(shí)數(shù)1 720～1 745 h[14].該區(qū)秋冬季多西北風(fēng)，春夏季多東南風(fēng)，全年溫暖濕潤(rùn)；土壤類(lèi)型屬于粗骨性紅壤，pH 4.56，含0.82 g·kg-1全磷、3.60 μg·mL-1全鉀、134 g·kg-1堿解氮、10.79 mg·kg-1有效磷、133 μg·kg-1速效鉀，土壤基礎(chǔ)肥力較低.

1.2 方法

1.2.1 生物學(xué)特性和表型的觀測(cè) 于2017年10月至2018年12月，以四季梔子、清流梔子和‘梔香富潤(rùn)’為研究材料，選擇具有代表性的植株各3株，包括1株四季梔子母株和2株四季梔子扦插植株，共9株，分別掛牌，統(tǒng)一編號(hào)，期間于每月中旬記錄掛果數(shù)、開(kāi)花量、開(kāi)花期、抽梢期和掛果期，觀測(cè)葉片和花的表型性狀，包括葉色、葉長(zhǎng)、葉寬、花朵形態(tài)、葉柄長(zhǎng)度、節(jié)間距等.

于2018年9月，從9株梔子上各選取20片當(dāng)年生生長(zhǎng)良好、無(wú)病蟲(chóng)害的健康葉片，拍照并記錄葉片的顏色和形狀.用葉面積掃描儀測(cè)量葉面積、葉長(zhǎng)和葉寬等指標(biāo)(精確到0.1 cm)，用游標(biāo)卡尺測(cè)量葉柄長(zhǎng)度(精確到0.01 cm).

1.2.2 SNP分子標(biāo)記的測(cè)序 采集9株梔子當(dāng)年生健康無(wú)病蟲(chóng)害的新生嫩葉[15]，采用改良后的CTAB法[16]提取基因組DNA，并進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，檢測(cè)合格的DNA采用簡(jiǎn)化的基因組測(cè)序技術(shù)(genotyping-by-sequencing, GBS)構(gòu)建基因文庫(kù).文庫(kù)構(gòu)建時(shí)采用內(nèi)切酶ApeKⅠ(ApeKⅠ的酶切識(shí)別位點(diǎn)為CWGC，其中，W指A和T的簡(jiǎn)并堿基)對(duì)基因組DNA進(jìn)行酶切.GBS 建庫(kù)流程：(1)利用ApeKⅠ限制性?xún)?nèi)切酶消化基因組DNA；(2)酶切后加入特異設(shè)計(jì)的P1標(biāo)簽接頭和P2常規(guī)接頭進(jìn)行連接反應(yīng)，接頭連接后用Qubit熒光定量?jī)x對(duì)各樣本進(jìn)行定量；(3)將9個(gè)樣本的DNA等量混合后純化產(chǎn)物；(4)不同長(zhǎng)度序列的PCR擴(kuò)增效率不同，通過(guò)PCR擴(kuò)增后，片段大小集中在180～480 bp；(5)文庫(kù)純化，并進(jìn)行質(zhì)檢，合格后上機(jī)測(cè)序.

1.3 數(shù)據(jù)處理

1.3.1 物候期觀察統(tǒng)計(jì) 統(tǒng)計(jì)開(kāi)花期、抽梢期和掛果期，并記錄期間的開(kāi)花量和掛果數(shù)，用Excel 2016軟件整理.開(kāi)花期：記錄每株梔子從第一朵花開(kāi)放到最后一朵花開(kāi)畢的日期.抽梢期：記錄從葉芽抽新梢到封頂形成休眠芽的日期.掛果期：記錄從開(kāi)始坐果到果實(shí)進(jìn)入完熟期的日期.

1.3.2 葉表型數(shù)據(jù)處理 葉表型的所有原始數(shù)據(jù)(葉色、葉面積、葉長(zhǎng)、葉寬)用Excel 2016軟件整理，SPSS 18.0軟件進(jìn)行主成分和聚類(lèi)分析.本研究選用標(biāo)準(zhǔn)差對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化，在此基礎(chǔ)上作進(jìn)一步分析.為探討不同種質(zhì)間表型性狀的整體相似性，采用Q型聚類(lèi)法和類(lèi)平均鏈鎖法，距離為歐式距離，構(gòu)建樹(shù)狀聚類(lèi)圖.

1.3.3 SNP標(biāo)記數(shù)據(jù)處理 SNP分子標(biāo)記測(cè)序得到的原始數(shù)據(jù)可能包含低質(zhì)量序列和接頭序列等.為了保證信息分析結(jié)果的可靠性，需要進(jìn)行一系列數(shù)據(jù)處理來(lái)過(guò)濾原始數(shù)據(jù)，得到干凈數(shù)據(jù).具體步驟如下：(1)去除原始數(shù)據(jù)中序列5′端未包含樣本標(biāo)簽(4～8 bp)信息的測(cè)序片段(一個(gè)樣本對(duì)應(yīng)一個(gè)標(biāo)簽)；(2)將上述片段剪切掉5′端標(biāo)簽后，進(jìn)行酶切識(shí)別位點(diǎn)的過(guò)濾，如果剪切掉標(biāo)簽的片段5′端未含酶切識(shí)別位點(diǎn)，則去除該片段；(3)拆分后的數(shù)據(jù)去除含接頭的片段；(4)拆分后的數(shù)據(jù)去除含低質(zhì)量的片段(質(zhì)量值≤15的堿基數(shù)占整條測(cè)序片段的40%以上)；(5)拆分后的數(shù)據(jù)去除含N(表示無(wú)法確定堿基信息)比例>10%的片段.

通過(guò)以上步驟得到干凈數(shù)據(jù)，從中篩選出適合的SNP序列，并使用Treebest NJ軟件作圖.

2 結(jié)果與分析

2.1 四季梔子與其他梔子的生物學(xué)特性和表型特征比較

2.1.1 四季梔子的特異性 特異性指通過(guò)長(zhǎng)期選育的品種與原生種具有明顯區(qū)別，如果一個(gè)品種的性狀差異恒定且明顯，則認(rèn)為該品種具有明顯差異[17].通過(guò)比較四季梔子與清流梔子兩份種質(zhì)資源的表型特征和物候期(表1、圖1)得出以下結(jié)果.(1)花期：四季梔子扦插植株與清流梔子的花期差異明顯，清流梔子花期在5—8月，四季梔子扦插植株花期在3—12月，四季梔子母株的花期長(zhǎng)達(dá)12個(gè)月；(2)掛果期：四季梔子掛果期為10—12月，清流梔子的掛果期為8—10月；(3)抽梢期：四季梔子全年抽梢，清流梔子抽梢期為3—7月；(4)花的形態(tài)特征：四季梔子具有單瓣和重瓣花，清流梔子的花朵僅為單瓣；(5)葉在枝條上的著生方式：四季梔子的葉為3葉輪生，清流梔子的葉為對(duì)生.綜上，四季梔子與清流梔子相比具有明顯的特異性.

圖1 不同梔子材料的表型特征Fig.1 Phenotypic characteristics of different gardenia materials

表1 試驗(yàn)材料的編號(hào)、來(lái)源、表型特征和物候期Table 1 Number, origin and phenotypic characteristics of the experimental materials

2.1.2 四季梔子的一致性和穩(wěn)定性 一致性是指新品種經(jīng)過(guò)繁殖，其子代除可以預(yù)見(jiàn)的變異外，其相關(guān)的特征或者特性保持一致[17].穩(wěn)定性是指新品種經(jīng)過(guò)反復(fù)繁殖后或者在特定繁殖周期結(jié)束時(shí)，其相關(guān)的特征或者特性保持不變[18].在兩個(gè)測(cè)試周期內(nèi)，分別對(duì)四季梔子扦插繁育子代的花和葉片的表現(xiàn)性狀及花期等多個(gè)性狀進(jìn)行統(tǒng)計(jì).結(jié)果(表2)顯示：各扦插植株開(kāi)花量為5.67～6.15朵，差異不顯著；花瓣長(zhǎng)寬比為1.6～1.9，花期286～317 d，葉長(zhǎng)4.7～4.9 cm，葉寬2.1～2.3 cm，各植株的花期均不小于286 d.各性狀的變異系數(shù)為1.66%～7.64%，均小于10%，表明四季梔子扦插繁育子代表型差異的幅度小.可見(jiàn)，四季梔子經(jīng)過(guò)無(wú)性繁育，其后代的表型性狀具備一致性和穩(wěn)定性.

表2 四季梔子扦插植株的性狀Table 2 Traits of four-season gardenia cuttings

2.2 梔子葉表型標(biāo)記

2.2.1 梔子葉表型的變異特征 對(duì)四季梔子、清流梔子和‘梔香富潤(rùn)’的葉面積、葉長(zhǎng)、葉寬、葉片長(zhǎng)寬比、節(jié)間距和葉柄長(zhǎng)度 6個(gè)性狀進(jìn)行描述性統(tǒng)計(jì).結(jié)果(表3)顯示，不同梔子材料表型性狀的變異系數(shù)為15.93%～89.42%，表明群體間的表型性狀差異幅度大.葉柄長(zhǎng)度為0.20～2.39 cm，變異系數(shù)達(dá)到89.42%，節(jié)間距為0.56～7.10 cm，變異系數(shù)達(dá)到61.11%，表明群體間的葉柄長(zhǎng)度和節(jié)間距差異顯著；葉面積為8.46～14.98 cm2，變異系數(shù)達(dá)到21.67% ，表明群體間的葉片大小差異明顯；葉長(zhǎng)、葉寬和葉面積的變異系數(shù)明顯大于葉片長(zhǎng)寬比的變異系數(shù)，表明雖然群體間的葉片大小存在差異，但葉形較為穩(wěn)定.

表3 試驗(yàn)材料的表型性狀Table 3 Phenotypic traits of the experimental materials

2.2.2 梔子葉的表型特征 主成分分析可以較準(zhǔn)確地反映梔子的表型特征，主成分的特征值和貢獻(xiàn)率是選擇主成分的依據(jù)，其各變量的特征值越大，則表明此成分的貢獻(xiàn)率越大[19].分析結(jié)果(表4)表明，通過(guò)主成分分析共提取2個(gè)主成分，性狀特征值分別為3.516和1.335，均大于1，主成分2的累計(jì)貢獻(xiàn)率為80.8379%(≥70%).其中，主成分1主要是反映梔子生長(zhǎng)情況的指標(biāo)，以葉長(zhǎng)和葉片長(zhǎng)寬比為主分量；主成分2是反映葉柄長(zhǎng)度形態(tài)的指標(biāo).表明葉長(zhǎng)、葉片長(zhǎng)寬比和葉柄長(zhǎng)度3個(gè)性狀對(duì)梔子的表型分類(lèi)比較重要，其余性狀的貢獻(xiàn)率較低.

表4 兩個(gè)主成分的負(fù)荷量、特征值、貢獻(xiàn)率和累計(jì)貢獻(xiàn)率Table 4 Factor loading, eigen value, contribution rate and cumulative contribution rate of the 2 principal components

2.3 梔子的SNP標(biāo)記

SNP指的是由單個(gè)核苷酸——A、T、C、G的改變而引起的DNA序列的改變，造成物種之間基因組的多樣性.為揭示四季梔子單核苷酸變異的信息，應(yīng)用Stacks軟件對(duì)SNP位點(diǎn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析.結(jié)果(表5)顯示：9個(gè)樣本測(cè)得的SNP總數(shù)以雜合型SNP為主，雜合率>50%，只有QS-2和QS-3純合型較多，分別占60.12%、69.23%；SNP總數(shù)最大的是QL-1，為179 653個(gè)，其次是ZJ-2，為15 660個(gè)，QS-2的總數(shù)最小，為23 514個(gè)；雜合型SNP占SNP總數(shù)比例最高的是ZJ-2，達(dá)到86.24%，比例最低的是QL-3，為30.77%.

表5 試驗(yàn)材料SNP結(jié)果的統(tǒng)計(jì)表Table 5 Statistics on the SNP results of the experimental materials

2.4 梔子的聚類(lèi)分析

圖2b表明，當(dāng)標(biāo)尺值為20時(shí)，基于葉表型性狀的聚類(lèi)結(jié)果可以將9個(gè)不同來(lái)源的梔子分為Ⅰ和Ⅱ類(lèi)兩大類(lèi).Ⅰ類(lèi)為清流梔子(QL-1、QL-2、QL-3)，Ⅱ類(lèi)為浙江采集的‘梔香富潤(rùn)’(ZJ-1、ZJ-2、ZJ-3)和清流采集的四季梔子(QS-1、QS-2、QS-3)，基于葉表型的Q型聚類(lèi)能將浙江和清流采集的種質(zhì)給區(qū)分開(kāi).基于SNP位點(diǎn)的聚類(lèi)也能將浙江和清流采集的種質(zhì)區(qū)分開(kāi)(圖2a)，然而與基于葉表型的聚類(lèi)結(jié)果(圖2b)不同的是，QL-3與QL-1、QL-2并不是如圖2b所示的分開(kāi)聚為一小類(lèi)，而是QL-3位于QS-1和QS-3之外，單獨(dú)聚為一支；而QS-2則是位于QL-1和QL-2之外，單獨(dú)聚為一支.

a：基于SNP位點(diǎn)的樹(shù)狀聚類(lèi)圖；b：基于葉表型Q型聚類(lèi)分析的樹(shù)狀聚類(lèi)圖.圖2 不同梔子材料種間的親緣關(guān)系Fig.2 Phylogenetic map of different gardenia materials

3 討論與結(jié)論

本研究鑒定了四季梔子是否具有特異性、一致性和穩(wěn)定性，結(jié)果表明，四季梔子與清流梔子在花的形態(tài)特征、花期、掛果期和抽梢期等方面存在明顯差異.其中，花期差異最大，四季梔子的花期長(zhǎng)達(dá)286～317 d，與清流梔子60 d左右的花期相比，花期長(zhǎng)度的特異性極其顯著，表明四季梔子具備品種特異性.四季梔子無(wú)性系子代與母株的表型和生物學(xué)特性無(wú)明顯差異，花朵均為白色單瓣花，偶爾出現(xiàn)重瓣花.初步認(rèn)定四季梔子具備植物新品種的一致性和穩(wěn)定性，是極具開(kāi)發(fā)應(yīng)用的新資源.

本研究對(duì)9個(gè)樣本中差異較為明顯的葉表型進(jìn)行分析的結(jié)果顯示，樣本各性狀指標(biāo)的變異系數(shù)為15.93%～89.42% ，表明樣本內(nèi)表型差異的幅度大.葉柄長(zhǎng)度的變異系數(shù)最大(89.42%)，葉片長(zhǎng)寬比的變異系數(shù)最小(15.93%)，表明葉形較為穩(wěn)定.從6個(gè)葉表型性狀中提取2個(gè)主成分，性狀的特征值均大于1，主成分2的累計(jì)貢獻(xiàn)率為80.838%(≥70%).反映了葉長(zhǎng)、葉片長(zhǎng)寬比和葉柄長(zhǎng)度3個(gè)性狀對(duì)梔子的表型分類(lèi)比較重要.

表型聚類(lèi)能夠?qū)⑶辶鞯谋镜胤N、四季梔子和浙江采集的‘梔香富潤(rùn)’區(qū)分開(kāi)來(lái).在基于SNP位點(diǎn)的聚類(lèi)圖中，浙江和清流兩地的種質(zhì)被清楚地區(qū)分開(kāi)，而清流梔子和四季梔子并不像表型聚類(lèi)圖那樣被明顯地區(qū)分開(kāi)，表明清流本地野生梔子與四季梔子具有更近的親源關(guān)系.兩種聚類(lèi)結(jié)果的差異，表明表型鑒定對(duì)親緣關(guān)系的鑒定具有一定的參考價(jià)值，但表型性狀易受到植物生境等多方面的影響產(chǎn)生變異.

綜上，初步認(rèn)定四季梔子具有特異性、一致性和穩(wěn)定性，且相對(duì)于‘梔香富潤(rùn)’，與清流梔子的親緣關(guān)系更近，初步推定為清流當(dāng)?shù)貤d子變種.本研究在基于前人研究的基礎(chǔ)上，對(duì)四季梔子和清流梔子的12個(gè)數(shù)量性狀進(jìn)行了測(cè)定，對(duì)梔子新品種測(cè)試具有一定的指導(dǎo)意義，但因栽培條件、年份、品種內(nèi)變異、氣候環(huán)境變化等因素存在的不確定性，應(yīng)將大量的年度間數(shù)據(jù)進(jìn)行集中分析，同時(shí)選擇穩(wěn)定且具有典型性狀特征的標(biāo)準(zhǔn)品種作為參照，對(duì)年度間的數(shù)據(jù)進(jìn)行校對(duì)和修訂，從而確保品種測(cè)試的客觀性與合理性.