石傲傲, 鄭 毅,2， 張 坤, 角慈梅, 李鑫圓, 孫仕仙

(1.西南林業(yè)大學(xué)國(guó)家高原濕地研究中心/濕地學(xué)院，云南 昆明 650224；2.云南開放大學(xué)校長(zhǎng)辦公室，云南 昆明 650223;3.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院，云南 昆明 650221；4.西南林業(yè)大學(xué)生態(tài)與環(huán)境學(xué)院，云南 昆明 650224)

撲草凈(4,6-雙異丙胺基-2-甲硫基-1,3,5-三嗪)是一種三嗪類低毒、高選擇的內(nèi)吸性除草劑,其因殺草譜廣、藥效長(zhǎng)等優(yōu)點(diǎn)，被廣泛應(yīng)用于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)和水產(chǎn)養(yǎng)殖中[1].但其在水中溶解度低(25 ℃時(shí)為48 mg·L-1)、化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定、難降解，造成嚴(yán)重水環(huán)境污染，且易經(jīng)生物富集作用通過(guò)食物鏈威脅人體健康[2]；我國(guó)水產(chǎn)品也曾因撲草凈超標(biāo)出現(xiàn)嚴(yán)重貿(mào)易壁壘[3]；撲草凈還是一種環(huán)境內(nèi)分泌干擾物質(zhì)，其進(jìn)入機(jī)體內(nèi)可導(dǎo)致生物體內(nèi)分泌系統(tǒng)、生殖系統(tǒng)、神經(jīng)系統(tǒng)和免疫系統(tǒng)異常，還可引起蛋白質(zhì)重組和構(gòu)像改變，誘發(fā)人體癌變、不育及先天性缺陷[4-7].因此，水體撲草凈污染修復(fù)引起了學(xué)者們的高度重視.

植物修復(fù)因具有經(jīng)濟(jì)、無(wú)二次污染等優(yōu)點(diǎn)，被廣泛用于污染修復(fù)[8].香根草(Vetiveriazizanioides)，又名巖蘭草，是多年生叢生型C4類草本植物，根系發(fā)達(dá)、生物量大，每年干草產(chǎn)量可達(dá)100 t·hm-2，能適應(yīng)旱澇、酸堿等多種環(huán)境，對(duì)有機(jī)和無(wú)機(jī)化學(xué)物質(zhì)都有很強(qiáng)的親和力，已廣泛用于環(huán)境修復(fù)領(lǐng)域[9-10].Ye et al[11]研究發(fā)現(xiàn),香根草可用于修復(fù)復(fù)合污染區(qū)，能有效降解有機(jī)氯農(nóng)藥和富集重金屬；香根草在凈化生活污水和工業(yè)廢水方面也優(yōu)于其他植物，表現(xiàn)出較好的凈化效果和較強(qiáng)的耐污能力[12-13].本項(xiàng)目組前期研究發(fā)現(xiàn)香根草能去除水體中的撲草凈[14].然而，香根草對(duì)撲草凈的耐受性和去除效果尚不明確.因此，本研究通過(guò)溫室水培試驗(yàn)，測(cè)定香根草對(duì)撲草凈脅迫的光合生理響應(yīng)和去除效果，為利用香根草修復(fù)撲草凈污染環(huán)境提供依據(jù).

1 材料與方法

1.1 材料

于2019年5—7月在云南省西南林業(yè)大學(xué)格林溫室進(jìn)行試驗(yàn).供試藥品97%撲草凈標(biāo)準(zhǔn)品購(gòu)自濟(jì)南仁諾化工有限公司；供試材料香根草(分蘗苗)購(gòu)自江西紅壤研究所.選取長(zhǎng)勢(shì)良好、大小一致的香根草植株，先用自來(lái)水清洗干凈，并用0.2%高錳酸鉀溶液消毒，再用去離子水清洗3遍，放入盛有1/2改良Hoagland營(yíng)養(yǎng)液的塑料桶中，適應(yīng)性培養(yǎng)1周.

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

向營(yíng)養(yǎng)液中添加撲草凈，并將營(yíng)養(yǎng)液定容至4 L，撲草凈濃度分別為0(CK)、1、10 mg·L-1，每個(gè)處理設(shè)置3個(gè)重復(fù)，分別于試驗(yàn)1、2、3、5、10、15、25、35 d后測(cè)定香根草葉片葉綠素含量、光合參數(shù)、葉綠素?zé)晒鈪?shù)，并于第0、35天測(cè)定各處理香根草鮮重.考慮到撲草凈存在自然降解情況，設(shè)置只添加撲草凈未種植香根草的處理組，撲草凈濃度同上，分別于第0、35天測(cè)定各處理營(yíng)養(yǎng)液中撲草凈含量.

1.3 項(xiàng)目測(cè)定方法

1.3.1 鮮重測(cè)定 采用稱量法測(cè)定香根草鮮重，并計(jì)算鮮重增長(zhǎng)率.

鮮重增長(zhǎng)率/%=(總鮮重-初始鮮重)/初始鮮重×100

1.3.2 撲草凈含量測(cè)定 根據(jù)質(zhì)量差法，先將營(yíng)養(yǎng)液添加至初始體積4 L，再取水樣50 mL，經(jīng)濾紙過(guò)濾后，量取30 mL至分液漏斗中，加入30 mL乙酸乙酯，振蕩萃取5 min，靜置直至分層.取上清液，40 ℃旋蒸至干，用正己烷定容至3 mL，過(guò)0.45 μm濾膜，轉(zhuǎn)入小棕瓶，用氣相色譜-質(zhì)譜(GC-MS)聯(lián)用儀(Thermo Scientific, USA)進(jìn)行測(cè)定.以撲草凈標(biāo)準(zhǔn)品配制5個(gè)梯度濃度的標(biāo)準(zhǔn)液，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線.

1.3.3 葉綠素含量測(cè)定 采用紫外分光光度計(jì)(Thermometer Evolution 300, USA)測(cè)定各類光合色素質(zhì)量分?jǐn)?shù).分別稱取0.1 g長(zhǎng)勢(shì)一致的香根草中、上部葉片，剪碎后放入10 mL有蓋試管中，加入10 mL 95%乙醇，在60 ℃水浴鍋中加熱2 h至葉片發(fā)白，分別測(cè)定提取液在665、649和470 nm波長(zhǎng)下的光密度D值，并計(jì)算葉綠素a(Chla)、葉綠素b(Chlb)、總?cè)~綠素(Chlt)含量[15].

1.3.4 光合參數(shù)測(cè)定 應(yīng)用Li-6800便攜式光合儀(LI-COR, USA)測(cè)定光合指標(biāo)，選用6800-01F熒光葉室進(jìn)行試驗(yàn)，設(shè)置紅藍(lán)光源，光強(qiáng)1 000 μmol·m-2·s-1，CO2控制為400 μmol·mol-1，濕度控制為50%.選取長(zhǎng)勢(shì)良好的香根草中、上部葉片，于8:30—11:30測(cè)定凈光合速率(net photosynthetic rate, Pn)、胞間CO2濃度(intercellular CO2concentration, Ci)、氣孔導(dǎo)度(stomatal conductance, Gs)、蒸騰速率(transpiration rate, Tr)，并將葉片做好標(biāo)記.

1.3.5 葉綠素?zé)晒鈪?shù)測(cè)定 與光合速率測(cè)定同步，應(yīng)用Li-6800便攜式光合儀(LI-COR, USA)測(cè)定葉綠素?zé)晒鈪?shù)，于8:30—11:30(葉片進(jìn)行充分光適應(yīng))測(cè)定實(shí)際光化學(xué)效率(PSⅡ)，于22:00后(充分暗適應(yīng)狀態(tài))測(cè)定電子傳遞速率(electron transport rate, ETR).確保作用光關(guān)閉的情況下，設(shè)置矩形閃光，飽和脈沖光強(qiáng)為8 000 μmol·m-2·s-1，直接在儀器上讀取PSⅡ最大光化學(xué)效率(maximal photochemical efficiency, Fv/Fm)，潛在光化學(xué)效率(potential photochemical efficiency, Fv/Fo)、光化學(xué)淬滅系數(shù)(photochemical quenching coefficient, qP)、非光化學(xué)淬滅系數(shù)(non-photochemical quenching coefficient, NPQ)均通過(guò)系統(tǒng)自動(dòng)擬合得出.

1.4 數(shù)據(jù)分析

應(yīng)用SPSS 19.0和Excel軟件處理數(shù)據(jù)，采用單因素ANOVA方差分析，并應(yīng)用Duncan′s多重比較進(jìn)行差異顯著性檢驗(yàn)，采用SPSS 19.0中Pearson相關(guān)系數(shù)和雙側(cè)顯著性檢驗(yàn)進(jìn)行相關(guān)性分析，并采用Origin 2018繪圖.

2 結(jié)果與分析

2.1 撲草凈脅迫對(duì)香根草鮮重的影響

與CK相比，1和10 mg·L-1撲草凈處理均顯著降低了香根草總鮮重和鮮重增長(zhǎng)率(P<0.05)，總鮮重分別下降了26.78%和40.82%，鮮重增長(zhǎng)率分別下降了20.49%和38.10%(表1).可見，高濃度處理的降幅大于低濃度處理.

表1 撲草凈脅迫對(duì)香根草鮮重的影響1)Table 1 Effects of prometryn stress on fresh weight of V.zizanioides

2.2 營(yíng)養(yǎng)液中撲草凈的去除率

種植香根草的營(yíng)養(yǎng)液中1和10 mg·L-1撲草凈的去除率分別達(dá)100%和99.37%，分別較未種植香根草的去除率提高了44.68%和53.76%(表2).這表明香根草對(duì)撲草凈具有良好的去除效果.

表2 營(yíng)養(yǎng)液中撲草凈含量及去除率1)Table 2 Content and removal rate of prometryn in nutrient solution

2.3 撲草凈脅迫對(duì)香根草葉綠素含量的影響

1和10 mg·L-1撲草凈處理組香根草葉片葉綠素含量均隨處理天數(shù)的延長(zhǎng)呈先下降后上升的趨勢(shì)(圖1).處理第15天，香根草葉片的Chla、Chlb、Chlt含量及Chla/Chlb值達(dá)到了較低水平，顯著低于CK(P<0.05).在此之后迅速升高，第35天時(shí)，1 mg·L-1撲草凈處理組香根草Chlb含量和Chla/Chlb值分別恢復(fù)到CK的90.79%和106.05%，Chla和Chlt含量恢復(fù)到CK的95.91%和94.54%；10 mg·L-1撲草凈處理組香根草Chla、Chlb、Chlt含量均恢復(fù)到CK的50%以上，但仍與CK差異顯著(P<0.05)，而Chla/Chlb值恢復(fù)到CK的88.97%，差異不顯著(P>0.05).

圖中不同字母表示在0.05水平上的差異顯著性，大寫字母表示相同濃度不同處理天數(shù)的差異，小寫字母表示相同處理天數(shù)不同濃度的差異.圖1 撲草凈脅迫對(duì)香根草葉綠素含量的影響Fig.1 Effects of prometryn stress on chlorophyll content of V.zizanioides

2.4 撲草凈脅迫對(duì)香根草光合參數(shù)的影響

1和10 mg·L-1撲草凈處理均降低了香根草葉片的Pn、Gs、Tr，而升高了Ci(圖2).1 mg·L-1撲草凈處理第5天時(shí)，香根草葉片的Pn、Gs、Tr均恢復(fù)到與CK接近的水平，第15天又下降到較低水平，之后迅速回升，到第35天時(shí)均恢復(fù)到正常水平，與CK無(wú)顯著差異(P>0.05)；而Ci隨處理天數(shù)的延長(zhǎng)呈先上升后下降趨勢(shì)，第15天時(shí)達(dá)到較高水平，比CK高32.28%，此后呈下降趨勢(shì)，第35天時(shí)恢復(fù)到CK的94.25%.10 mg·L-1撲草凈處理第5天時(shí)香根草葉片Pn、Gs、Tr顯著低于CK(P<0.05)，第15天時(shí)Pn和Gs達(dá)到較低水平，分別比CK低86.15%和63.64%，此后緩慢回升，第35天時(shí)Pn、Gs、Tr仍分別比CK低38.82%、33.33%、49.40%(P<0.05)；而Ci在第15天時(shí)比CK高70.45%，之后呈下降趨勢(shì)，但第35天時(shí)仍顯著高于CK(P<0.05).

圖中不同字母表示在0.05水平上的差異顯著性，大寫字母表示相同濃度不同處理天數(shù)的差異，小寫字母表示相同處理天數(shù)不同濃度的差異.圖2 撲草凈脅迫對(duì)香根草光合參數(shù)的影響Fig.2 Effects of prometryn stress on photosynthetic parameters of V.zizanioides

2.5 撲草凈脅迫對(duì)香根草葉綠素?zé)晒鈪?shù)的影響

1和10 mg·L-1撲草凈處理降低了香根草的Fv/Fm、Fv/Fo、ΦPSⅡ、ETR、qP，并隨處理天數(shù)的延長(zhǎng)整體上呈先下降后上升趨勢(shì)，而NPQ在脅迫處理初期明顯高于CK(圖3).與CK相比，1和10 mg·L-1撲草凈處理第15天時(shí)，香根草Fv/Fm分別下降了2.53% 和21.52%，F(xiàn)v/Fo分別下降了10.63%和51.23%，ΦPSⅡ分別下降了57.14%和88.10%，ETR分別下降了57.60%和87.56%，qP分別下降了58.70%和86.96%，NPQ分別下降了63.16%和47.37%.1 mg·L-1撲草凈處理第35天時(shí)，香根草各項(xiàng)葉綠素?zé)晒鈪?shù)均恢復(fù)到CK水平，差異不顯著(P>0.05)；而10 mg·L-1撲草凈處理第35天時(shí)，香根草各項(xiàng)葉綠素?zé)晒鈪?shù)仍低于CK.

圖中不同字母表示在0.05水平上的差異顯著性，大寫字母表示相同濃度不同處理天數(shù)的差異，小寫字母表示相同處理天數(shù)不同濃度的差異.圖3 撲草凈脅迫對(duì)香根草葉綠素?zé)晒鈪?shù)的影響Fig.3 Effects of prometryn stress on chlorophyll fluorescence parameters of V.zizanioides

2.6 撲草凈濃度與各指標(biāo)的相關(guān)性

計(jì)算不同處理天數(shù)香根草Pn、Ci、Gs、Chlt、Fv/Fm、ΦPSⅡ、NPQ及撲草凈濃度平均值，然后分析其相關(guān)性.由表3可知，香根草葉片Pn、Gs、Chlt、Fv/Fm、ΦPSⅡ與撲草凈濃度呈極顯著負(fù)相關(guān)(P<0.01)，Ci與撲草凈濃度呈極顯著正相關(guān)(P<0.01)，NPQ與撲草凈濃度無(wú)顯著相關(guān)性(P>0.05).

表3 撲草凈濃度與各光合生理指標(biāo)的相關(guān)系數(shù)1)Table 3 Correlation coefficients between prometryn concentration and all photosynthetic physiological parameters of V.zizanioides

3 討論

植物會(huì)通過(guò)調(diào)整生理特征及改變生物量來(lái)維持在逆境下的存活與生長(zhǎng)[16].本研究表明，不同濃度撲草凈處理均降低了香根草總鮮重及鮮重增長(zhǎng)率.這可能與撲草凈的除草機(jī)理有關(guān)，撲草凈經(jīng)植物根部吸收并經(jīng)非共質(zhì)體途徑傳導(dǎo)到分生組織和葉面，作用靶標(biāo)是植物光合作用系統(tǒng)Ⅱ的受體蛋白，從而抑制了電子傳遞(Hills反應(yīng))和氧化磷酸化，進(jìn)而強(qiáng)烈抑制了植物的光合作用和養(yǎng)分積累，最終影響香根草的生長(zhǎng)[17].這與劉建霞等[18]用撲草凈處理黃芪幼苗的研究結(jié)果一致.

葉綠素在植株體內(nèi)負(fù)責(zé)光能的吸收、傳遞和轉(zhuǎn)化，植物葉片葉綠素含量的變化與光合強(qiáng)度密切相關(guān)，通常植物生長(zhǎng)狀況可通過(guò)葉綠素含量來(lái)表征[19].本研究表明，不同濃度撲草凈處理均降低了香根草葉片葉綠素含量及Chla/Chlb值，且葉綠素指標(biāo)隨處理天數(shù)的延長(zhǎng)呈先下降后上升的趨勢(shì).下降的原因可能是在撲草凈脅迫環(huán)境下，香根草葉綠體受損，光合色素含量降低，對(duì)光能的捕獲能力下降，葉綠素活性酶比例失調(diào)， 生理平衡被打破，抑制了葉綠素的合成；而各類葉綠素含量均在第15天后回升，可能是由于香根草莖葉中撲草凈隨處理天數(shù)的延長(zhǎng)而降解，脅迫效應(yīng)減弱，也可能是因?yàn)檫m應(yīng)撲草凈脅迫環(huán)境后，香根草體內(nèi)谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶活性增強(qiáng)，降低了撲草凈毒性[20].Burke et al[21]研究發(fā)現(xiàn)，抗除草劑植物傾向于降低Chla/Chlb值以提高光合效率，維持植物的生長(zhǎng)需要，這與本研究中Chla/Chlb值的變化一致.Pn直接反映植物單位葉面積的同化能力，是衡量植物光合能力的重要指標(biāo)[22].氣孔和非氣孔限制都可導(dǎo)致Pn下降，Pn、Gs和Ci同時(shí)下降時(shí)為氣孔限制；Pn下降而Ci升高時(shí)為非氣孔限制[23].本研究中香根草葉片Pn、Gs與Ci呈負(fù)相關(guān),表明Pn下降主要是由于非氣孔限制造成.1 mg·L-1撲草凈處理第5天時(shí)，香根草葉片光合指標(biāo)接近于CK水平，可能與其體內(nèi)抗氧化酶增加，清除活性氧自由基能力增強(qiáng)有關(guān)[24];而在此之后，Pn、Gs、Tr均降低；第15天時(shí)達(dá)到最低，之后逐漸恢復(fù)到CK水平，這可能與香根草葉片中撲草凈含量變化有關(guān).Sun et al[14]研究表明，香根草可吸收溶液中的撲草凈并將其轉(zhuǎn)移到葉片中，在第15天左右撲草凈含量達(dá)到峰值.這與本研究結(jié)果基本相符.

葉綠素?zé)晒馀c光合作用中各個(gè)反應(yīng)過(guò)程緊密相關(guān)，任何逆境對(duì)光合作用各過(guò)程產(chǎn)生的影響都可通過(guò)植物體內(nèi)葉綠素?zé)晒庹T導(dǎo)動(dòng)力學(xué)反映出來(lái)，所以葉綠素?zé)晒鈪?shù)可作為評(píng)價(jià)植物抗逆反應(yīng)的指標(biāo)之一[25].本研究表明，不同濃度撲草凈處理后，香根草Fv/Fm、Fv/Fo、ФPSⅡ和ETR呈先下降后回升趨勢(shì)，可能與體內(nèi)撲草凈含量變化有關(guān).qP能在一定程度上反映PSⅡ反應(yīng)中心的開放程度，qP 愈大，PSⅡ的電子傳遞活性愈強(qiáng)[26-27]；NPQ 反映的是葉片吸收的光能否用于光合電子傳遞而以熱耗散形式散失的部分能量，當(dāng)PSⅡ反應(yīng)中心吸收了過(guò)量的光能時(shí)，如不能及時(shí)耗散將對(duì)光合機(jī)構(gòu)造成破壞，所以非光化學(xué)淬滅是一種自我保護(hù)機(jī)制[28].本研究表明，高濃度撲草凈處理的qP小于低濃度處理，說(shuō)明高濃度撲草凈脅迫使香根草PSⅡ反應(yīng)中心受損嚴(yán)重，阻礙了光合電子的傳遞.從相關(guān)性分析結(jié)果來(lái)看，撲草凈脅迫不會(huì)對(duì)香根草NPQ產(chǎn)生顯著影響，表明PSⅡ反應(yīng)中心主要通過(guò)增加熱形式耗散掉的光能，緩解撲草凈脅迫對(duì)香根草PSⅡ帶來(lái)的傷害.這與申須仁等[29]的研究結(jié)果相符，但具體的調(diào)節(jié)機(jī)制仍待研究.

本研究中，香根草對(duì)高濃度撲草凈具有較強(qiáng)的耐受性.其對(duì)撲草凈脅迫的光合生理響應(yīng)機(jī)制可能表現(xiàn)在2個(gè)方面：一方面，通過(guò)降低體內(nèi)葉綠素含量，調(diào)節(jié)Chla/Chlb值，減少對(duì)光能的捕獲，從而保護(hù)光合機(jī)構(gòu)；另一方面，通過(guò)調(diào)節(jié)熱耗散釋放過(guò)剩能量，保護(hù)PSⅡ系統(tǒng).此外，不同植物對(duì)農(nóng)藥的吸收和降解效果存在差異：Ni et al[30]發(fā)現(xiàn),銅錢草(Hydrocotylevulgaris)對(duì)0.5 mg·L-1撲草凈的去除率為94%;本研究發(fā)現(xiàn),香根草對(duì)1和10 mg·L-1撲草凈的去除率達(dá)100%和99.37%.這表明香根草對(duì)撲草凈的去除效果較銅錢草強(qiáng)，可能與植物的生物量及其根際微環(huán)境有關(guān)[31-32].

綜上所述，香根草能夠長(zhǎng)時(shí)間耐受1 mg·L-1以下的撲草凈脅迫，對(duì)10 mg·L-1撲草凈脅迫也具有較強(qiáng)的耐受性和良好的去除效果，具有修復(fù)撲草凈污染環(huán)境的潛力.