程 敏, 顧 鋼, 肖 順, 周 挺, 劉國坤

(1.福建農(nóng)林大學植物保護學院，福建 福州 350002;2.福建省煙草公司煙草科學研究所，福建 福州 350003)

土傳病害是指病原體可隨病殘體在土壤中長期存活，并在合適條件下侵染植物根部或莖部的一類病害[1].長期以來煙草土傳病害是阻礙煙草產(chǎn)業(yè)發(fā)展的重大問題，該類病害包括青枯拉爾氏菌(Ralstoniasolanacearum)引起的煙草青枯病、胡蘿卜軟腐果膠桿菌(Pectobacteriumcarotovorum)引起的煙草空腔病、鐮刀菌(Fusariumspp.)引起的煙草枯萎病、疫霉菌(Phytophthoraparasitica)引起的煙草黑脛病等[2].化學藥劑對于土傳病害的防治效果有限，且易導致農(nóng)藥殘留、環(huán)境污染、根際微生物種群失調(diào)和有益微生物種群數(shù)量下降等問題[3].利用生防菌抑制土傳病原菌和調(diào)控植物根系的微生態(tài)環(huán)境是目前研究的熱點[3-5].芽孢桿菌(Bacillus)因其分布廣泛、抗逆性強、易分離培養(yǎng)、繁殖快和防效穩(wěn)定等優(yōu)點而備受關(guān)注，是植物病害生防領(lǐng)域研究與應用最多的細菌之一[3-9].但目前對于芽孢桿菌拮抗菌的篩選，多數(shù)只針對單一的靶標土傳病原菌.本研究從土傳病害根部分離篩選到1株對多種土傳病原菌具有拮抗效果的芽孢桿菌FJSC01，通過鑒定及盆栽試驗，為開發(fā)和研制高效生防制劑或菌肥提供理論依據(jù).

1 材料與方法

1.1 供試病原菌

尖鐮孢菌(F.oxysporum)、膠孢炭疽菌(Colletotrichumgloeosporioides)、立枯絲核菌(Rhizoctoniasolani)、疫霉菌、灰葡萄孢菌(Botrytiscinerea)由福建農(nóng)林大學線蟲實驗室提供；病原細菌青枯拉爾氏菌和胡蘿卜軟腐果膠桿菌由福建農(nóng)林大學細菌實驗室提供.

1.2 芽孢桿菌FJSC01的分離與篩選

從福建青枯病發(fā)生嚴重的番茄田塊的輕病株根際土壤中分離到芽孢桿菌FJSC01.分離方法：取土樣10 g放入100 mL無菌水中, 在振蕩器上振蕩40 min， 然后100 ℃水浴3 min，逐級稀釋10-1～10-7倍，取0.1 mL涂布NA培養(yǎng)基，28 ℃培養(yǎng)24～48 h后，挑取單一菌落，分離、純化、編號，在試管NA斜面培養(yǎng)基上保存菌株備用.經(jīng)初步測試，該菌株對多種靶標土傳病原菌具有較好的拮抗效果.

1.3 芽孢桿菌FJSC01平板拮抗效果測定

1.3.1 對5種病原菌的拮抗試驗 采用濾紙片法[10]測定芽孢桿菌FJSC01對5種病原菌的拮抗效果：將菌株FJSC01用滅菌蒸餾水配制成濃度為107～108CFU·mL-1的菌懸液，直徑6 mm的圓形濾紙片置于直徑9 cm的PDA培養(yǎng)基平板中心，吸取6 μL FJSC01菌液點接彌散于濾紙上；然后用消毒后的打孔器(內(nèi)直徑5 mm)打取生長旺盛的5種供試病原菌(尖鐮孢菌、膠孢炭疽菌、立枯絲核菌、疫霉菌、灰葡萄孢菌)菌落邊緣，將2個菌餅轉(zhuǎn)接于距待測菌液中心2 cm的對稱處.每個培養(yǎng)皿放置2個菌餅；以無菌水濾紙片上接種病原菌菌餅為對照，試驗重復5次.接種后置于28 ℃培養(yǎng)，待對照組菌落長至培養(yǎng)皿中心點時，測定芽孢桿菌FJSC01對病原菌的抑制率.

1.3.2 對病原細菌的拮抗試驗 將分離到的芽孢桿菌FJSC01用滅菌蒸餾水配制成濃度為107～108CFU·mL-1的菌懸液，直徑6 mm的圓形濾紙片置于直徑9 cm的PDA平板中，以平板中心點為中心，呈3 cm等邊三角形狀放置，用移液槍吸取6 μL FJSC01菌液點接彌散于濾紙上.分別將濃度為2×108CFU·mL-1的青枯拉爾氏菌和胡蘿卜軟腐果膠桿菌菌懸液用無菌噴霧器噴于平板上，以只有無菌水的濾紙片噴灑細菌菌液為對照.28 ℃恒溫條件下黑暗培養(yǎng)，24 h后觀察FJSC01對胡蘿卜軟腐果膠桿菌的抑菌效果，48 h后觀察FJSC01對青枯拉爾氏菌的抑菌效果.用十字交叉法測量抑菌圈直徑[10].

1.4 芽孢桿菌FJSC01對煙草青枯病的防治試驗

1.4.1 菌液制備 煙草青枯菌菌液制備：將TCC培養(yǎng)基平板篩選的致病性強的青枯菌菌落挑取至NA液體培養(yǎng)基內(nèi)，在180 r·min-1、28 ℃的搖床中培養(yǎng)48 h，得到發(fā)酵菌液.芽孢桿菌FJSC01發(fā)酵液的制備：將在NA培養(yǎng)基活化好的菌株FJSC01接種至NA液體培養(yǎng)基內(nèi)，180 r·min-1、30 ℃搖床培養(yǎng)3 d，得到芽孢桿菌FJSC01的發(fā)酵液.

1.4.2 防治效果測定 將煙草包衣種子(福建省煙草總公司提供，品種為K326)播于滅菌的無菌砂土(砂與土的比例1∶1)中，25 ℃溫室育苗至3～4片真葉后，將幼苗移栽至直徑為20 cm的花盆中，每盆1株，繼續(xù)溫室培養(yǎng)至5～7片真葉時進行接種.期間適時澆施煙草專用肥.

將芽孢桿菌FJSC01發(fā)酵液和青枯菌發(fā)酵液用無菌水稀釋成濃度為3×108CFU·mL-1的菌液，采用灌根法接種于煙草植株：先將芽孢桿菌FJSC01菌液澆灌于煙草植株，每株澆灌50 mL，30 ℃溫室培養(yǎng)7 d，然后接種青枯菌菌液50 mL.每個處理重復8次，分別以只接種青枯菌菌液和只接種清水作為陽性和陰性對照.接種完成后，放置在30 ℃的溫室中培養(yǎng)，定期澆水以保持濕度，逐日觀察并記錄植株發(fā)病情況，1個月后計算病情指數(shù)和防治效果[11].

1.5 芽孢桿菌FJSC01的鑒定

1.5.1 形態(tài)特征 參照文獻[12-13]的方法進行革蘭氏染色和芽孢染色，Nikon顯微鏡(Eclipse Ni-U 931609)下觀察菌體形態(tài).

1.5.2 生理生化特征 采用專用培養(yǎng)基分別開展甲基紅、V.P.、檸檬酸鹽利用、硝酸鹽利用、尿素利用、接觸酶產(chǎn)生和吲哚產(chǎn)生等試驗[10,12-13].每個處理均設(shè)3次重復.

1.5.3 16S rDNA序列分析 用菌懸液沸水浴法提取菌株FJSC01基因組DNA[14]，采用通用引物27F(5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′)和1492R(5′-TACGGYTACCTTGTTACGACTT-3′)[15]進行16S rDNA的PCR擴增. DNA模板1 μL，上、下游引物各1 μL，Taq聚合酶12.5 μL，ddH2O補足至25 μL.PCR反應條件：94 ℃預變性5 min；94 ℃變性1 min，55 ℃退火1 min，72 ℃延伸3 min，共30個循環(huán)；72 ℃后延伸10 min.擴增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測.測序由上海鉑尚生物工程技術(shù)服務有限公司完成.

將完成測序的菌株FJSC01序列提交至GenBank數(shù)據(jù)庫獲得序列號，并利用Blast搜索軟件進行同源性分析.采用Seaview軟件中的Muscle模型進行多序列比對分析，對序列的頭尾進行修飾.將獲得的FASTA格式文件在http://sing.ei.uvigo.es/ALTER/中使用Alignment Transformation Environment的Mrbayes模型轉(zhuǎn)化為NEXUS格式.在CIPRES Science Gateway[16]運算平臺(www.pholy.org)上進行大數(shù)據(jù)分析.使用MrBayes(3.2.6)on XSEDE[17]進行貝葉斯法(Bayesian inference, BI)分析；采用Figtree V1.4.3和Adobe Illustrator CS5在貝葉斯樹上標注后驗概率.

2 結(jié)果與分析

2.1 芽孢桿菌FJSC01對病原菌的拮抗效果

芽孢桿菌FJSC01對7種病原菌均有明顯的抑制效果(表1、圖1).其中，對青枯拉爾氏菌和胡蘿卜軟腐果膠桿菌的抑菌圈平均直徑為(12.4±0.22)和(11.2±0.18) mm.

表1 菌株FJSC01對5種病原菌的抑制率1)Table 1 Inhibitory rates of strain FJSC01 on 5 pathogens

A.疫霉菌；B.膠孢炭疽菌；C.灰葡萄孢菌；D.立枯絲核菌；E.尖鐮孢菌；F.胡蘿卜軟腐果膠桿菌；G.青枯拉爾氏菌.圖1 菌株FJSC01對7種病原菌的抑制效果Fig.1 Inhibitory effects of strain FJSC01 on 7 pathogens

2.2 菌株FJSC01對煙草青枯病的防治效果

只接種清水的煙草植株生長正常，無任何發(fā)病癥狀(圖2A)；只接種青枯菌時，煙草植株的平均發(fā)病率達100%，病情指數(shù)為93.8(表2)，植株完全萎蔫，維管束變褐且變空腔(圖2B)；提前接種芽孢桿菌FJSC01后再接種青枯菌，植株發(fā)病率為75%，病情指數(shù)為62.5(表2)，植株延遲5 d發(fā)病，主要表現(xiàn)為下部葉片萎蔫,維管束變褐不明顯(圖2C).

A.陰性對照(只接種清水)；B.陽性對照(只接青枯菌)；C.先接種FJSC01再接種青枯菌.圖2 芽孢桿菌FJSC01對煙草青枯病的室內(nèi)防效Fig.2 Control effects of Bacillus FJSC01 on tobacco bacterial wilt in the laboratory

表2 芽孢桿菌FJSC01對煙草青枯病的室內(nèi)防治率1)Table 2 Control rates of Bacillus FJSC01 on tobacco bacterial wilt in the laboratory

2.3 菌株FJSC01的鑒定

2.3.1 菌落和菌體形態(tài)特征 菌株FJSC01在NA培養(yǎng)基平板上生長的單菌落呈近圓形，濕潤，微黃色，不透明，表面光滑，扁平，中部褶皺，邊緣整齊(圖3A).在光學顯微鏡下觀察菌體FJSC01革蘭氏染色為陽性，菌體為桿狀，菌體中部有芽孢形態(tài)(圖3B-C).

A.菌落；B.菌體革蘭氏染色(標尺：5 μm)；C.菌體芽孢形態(tài)(標尺：5 μm).圖3 菌株FJSC01菌落和菌體形態(tài)特征Fig.3 Colony and morphological characteristics of strain FJSC01

2.3.2 生理生化特征 菌株FJSC01能促使淀粉水解、硝酸鹽還原、明膠液化、酪蛋白水解、纖維素分解，能利用檸檬酸鹽，接觸酶、V.P.試驗呈陽性反應，尿素酶試驗、甲基紅試驗、產(chǎn)氨試驗呈陰性反應；不能產(chǎn)生黑色素、硫化氫、吲哚，可利用α乳糖、葡萄糖、蔗糖、甘露醇、甘油、山梨醇、木糖.

2.3.3 16S rDNA序列分析 擴增菌株FJSC01的16S rDNA片段，產(chǎn)生一條1 500 bp左右的條帶，測序、拼接得到該片段的核苷酸序列，全長為1 419 bp.在GenBank中提交序列，得到菌株FJSC01 16S rDNA片段的序列號為MF973065，該序列與已知的Bacillusmethylotrophicus16S rDNA序列相似性均在99%以上.用MrBayes構(gòu)建菌株FJSC01與其相似性較高的20個菌株16S rDNA序列的系統(tǒng)進化樹，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)JSC01與Bacillusmethylotrophicus16S rDNA的序列處于同一個分支(圖4).

圖4 基于菌株FJSC01和其他20個菌株16S rDNA序列構(gòu)建的系統(tǒng)進化樹Fig.4 The phylogenetic tree of strain FJSC01 and 20 strains of Bacillus spp. based on 16S rDNA sequences

綜合形態(tài)特征、生理生化特征及16S rDNA分析結(jié)果，將FJSC01鑒定為甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌(Bacillusmethylotrophicus).

3 討論

本試驗從作物根系分離到對煙草重要土傳病原菌胡蘿卜軟腐果膠桿菌、青枯拉爾氏菌、尖鐮孢菌等具有良好拮抗作用的芽孢桿菌FJSC01，通過形態(tài)特征、生理生化特征以及16S rDNA序列分析，將該菌株鑒定為甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌.甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌最早是由Madhaiyan et al[18]從水稻根系土壤中分離獲得，并證明其對作物具有促生作用；隨后該菌在多種生境中被分離到，并被發(fā)現(xiàn)具有良好的生防潛質(zhì).例如：馮云利等[19]發(fā)現(xiàn)甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌是烤煙品種NC297內(nèi)生細菌的優(yōu)勢種群，對煙草黑脛病菌有抑制作用；陳新春等[20]從蔬菜根際分離到的一株甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌，對水稻白葉枯病菌、水稻細條病菌和尖孢鐮刀菌均具有一定抑制作用；李祖紅等[21]從水稻根際土壤中分離到的一株甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌，對煙草疫霉菌有較好的抑制作用；周登博等[22]研究發(fā)現(xiàn)，甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌4-L-16發(fā)酵液對香蕉枯萎病具有良好防效，可誘導苯丙氨酸解氨酶等4種抗病酶活性；此外，多項研究表明甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌對青枯菌具有良好的抑制效果[23-25].本研究篩選的甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌FJSC01對多種重要土傳病原菌具有拮抗效果；盆栽接種試驗表明，預先灌根FJSC01菌液可明顯降低煙草青枯病的發(fā)生率與病情指數(shù).但其田間防效還有待進一步研究.