羅 婧，楊絲雨，吳 宇，王雨萌，鄭煜芳,

(1.復旦大學 生命科學學院 發(fā)育生物學研究所, 上海 200433; 2.復旦大學附屬婦產(chǎn)科醫(yī)院, 上海 200011)

microRNA最早在1993年被報道發(fā)現(xiàn)[1]，是一類長度為19～25nt的非編碼小RNA.通常microRNA通過與靶基因mRNA的3’UTR互補配對抑制靶基因的翻譯，降低其穩(wěn)定性.已有研究表明，microRNA 5’端的種子序列(seed sequence)會和靶基因mRNA的3’UTR通過完全堿基互補配對形成microRNA誘導的沉默復合物(microRNA-Induced Silencing Complex, miRISC)，該復合物會介導mRNA的切割和降解[2].而microRNA與3’UTR區(qū)段不完全的堿基配對則主要導致mRNA的翻譯沉默[3].除了與3’UTR的常規(guī)相互作用外，最近的研究表明在轉錄后調控中microRNA也可以與靶基因mRNA的5’UTR區(qū)[4]或編碼區(qū)(CDS)結合[5-6].

microRNA介導的基因調節(jié)在發(fā)育和疾病調控中都發(fā)揮了重要的作用.我們實驗室前期工作發(fā)現(xiàn)，MECP2復制會上調miR-197，并促進大腦皮質發(fā)育中的神經(jīng)發(fā)生[7].hsa-miR-197從1p13.3染色體轉錄，成熟的miR-197-3p具有22個核苷酸[8].miR-197直系同源基因僅在一些靈長類動物(人、恒河猴、西部大猩猩、侏儒黑猩猩、黑猩猩)和部分其他哺乳動物，包括牛、狗、馬，山羊和兔子中被鑒定出，表明其在靈長類動物和這些哺乳動物中具有重要的作用.此外，miR-197還是包括人膠質母細胞瘤[9]在內的幾種癌癥的生物標志物[10].因此，我們在幾種人類細胞中尋找hsa-miR-197-3p的潛在靶基因，包括人誘導多能干細胞hiPSC，人髓核細胞hNPC，人神經(jīng)元，人胚胎腎細胞293T和人神經(jīng)膠質瘤細胞U251.我們一共鑒定出9個在這些細胞中均高表達的潛在靶基因，qRT-PCR結果顯示過表達miR-197的確可以下調大多數(shù)靶基因的表達，但是miR-197對異質核糖核蛋白D0基因(HNRNPD)的表達卻有顯著的上調作用.

HNRNPD也被稱為富含AU的元件RNA結合蛋白1(AUF1)，能結合許多原癌基因和細胞因子mRNA的3’UTR上的AU-Rich Elements(AREs)[11-12].由于在2號外顯子或7號外顯子上的可變剪接，HNRNPD有4種亞型，其分子量分別為p37，p40，p42和p45.這4種亞型具有不同的亞細胞定位: p37和p40可以在細胞核與細胞質間穿梭，但在細胞質中含量較多，而其他兩個亞型僅分布在細胞核[11].所有4種亞型都可以通過與AREs結合介導mRNA的快速降解，其中p37具有最高的結合親和力[13].此外，HNRNPD還可以通過結合靶基因的3’UTR區(qū)影響其翻譯水平.小鼠核心生物鐘基因Cry1的3’UTR區(qū)可以與HNRNPD結合，后者通過與翻譯起始因子相互作用并募集40S核糖體亞基來啟動Cry1的翻譯[14].根據(jù)近期數(shù)據(jù)庫的預測結果，人類基因組中約22%的基因在其3’UTR上包含至少一個ARE[15].因此，HNRNPD可能影響許多基因的表達.

在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)miR-197不調控HNRNPD的3’UTR，而是通過5’UTR上調HNRNPD的表達.同時我們還發(fā)現(xiàn)，神經(jīng)發(fā)育障礙(如自閉癥和嚴重的智力障礙)相關基因中含有比全基因組中更高比例的ARE-mRNA.所以miR-197和HNRNPD在調節(jié)神經(jīng)發(fā)育和相關疾病中可能具有重要作用.

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 細胞、miRNA mimics、抑制劑及引物

293T和U251細胞系均從中國科學院上海細胞庫獲得.miR-197 mimics及其對照，miR-197抑制劑及其對照均購自Genepharma.在1 OD單鏈RNA oligo中加入125μL不含RNase的水制成20mmol/L溶液進行儲存，工作濃度為50nmol/L.miR-197的引物和內參U6引物均購自Qiagen.

1.1.2 Ago2 shRNA

根據(jù)Ago2序列一共設計了3種shRNA，由和元生物有限公司將shRNA裝入過表達載體并用慢病毒包裝.具體5’-3’ shRNA序列如表1所示.

表1 Ago2 shRNA序列

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)

在DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)293T和U251細胞，該培養(yǎng)基中添加了10%的胎牛血清(Gibco)和1%的青霉素-鏈霉素溶液(Beyotime Biotechnology).將細胞在37℃含5%CO2的潮濕培養(yǎng)箱中培養(yǎng).

1.2.2 5種細胞miR-197潛在靶基因的GEO數(shù)據(jù)提取

從GEO數(shù)據(jù)庫(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo)中提取了人誘導多能干細胞(hiPSC)，人神經(jīng)祖細胞(hNPC)，人神經(jīng)元，U251細胞和293T細胞的RNA-seq數(shù)據(jù)集.對每個數(shù)據(jù)集的前1000個富集基因進行提取，然后將每個細胞的靶基因的交集列表進行進一步分析.

GSM號碼如下:

人iPSC: GSM2884932，GSM2884933，GSM2884934，GSM2884935，GSM2884968，GSM2884969，GSM2884970，GSM2884971.人NPC: GSM2127240，GSM2127241，GSM2127242，GSM2127245，GSM2127246，GSM2127247，GSM2127248.人神經(jīng)元: GSM2884974，GSM2884975，GSM2884976，GSM2884986.U251細胞: GSM1681972，GSM1681973，GSM1681974.293T細胞: GSM3753369，GSM3755570.

1.2.3 細胞轉染

1.2.3.1 脂質體轉染

轉染前一天將細胞傳代后接種到10cm細胞培養(yǎng)皿中，待細胞密度到70%左右進行脂質體轉染.將轉染試劑和工作濃度為50nmol/L的miRNA或4μg質粒按照2∶1的比例混合并用500μL opti-MEM進行稀釋，靜置20min后，將上述混合溶液均勻滴加到細胞培養(yǎng)皿中.24h后收細胞.實驗中涉及兩種脂質體轉染試劑: 單獨轉染miR-197 mimics或抑制劑及其對照時，用Lipofectamine RNAiMAX(Thermo fisher Scientific)；共轉染miR-197mimics或抑制劑及其對照和HNRNPD基因相關質粒時使用X-tremeGENE siRNA轉染試劑(Roche).

1.2.3.2 病毒轉染

轉染前一天將細胞傳代后接種到12孔板中，待細胞密度達到30%左右進行病毒轉染，轉染時根據(jù)不同病毒的滴度按MOI=10在細胞中加入對應的病毒，72h后收細胞.

1.2.4 RNA抽提和qRT-PCR

使用RNeasy Mini Kit(Qiagen)提取293T或U251細胞的總RNA.使用All-in-One TM miRNA qRT-PCR檢測試劑盒(GeneCopoeia)進行miRNA逆轉錄和miR-197的qRT-PCR.使用帶有gDNA Remover的ReverTraAce?qPCR RT預混液(Toyobo)進行mRNA反轉錄，并用SYBR?Green Realtime PCR預混液(Toyobo)進行mRNA的qRT-PCR.由于HNRNPD的所有4個轉錄本都具有相同的3’UTR和5’UTR區(qū)，因此設計的qRT-PCR引物對應所有4個轉錄本的共享序列.引物序列如表2所示.

表2 qRT-PCR引物列表

1.2.5 熒光素酶報告基因檢測

將全長的HNRNPDmRNA 5’UTR或3’UTR序列克隆到質粒載體pGL3中以生成熒光素酶報告基因質粒.使用Q5聚合酶(NEB)通過定點誘變生成不同位點的突變體，并通過Sanger測序進行證實.通常microRNAs上存在一段連續(xù)的7～8mer種子序列，該序列可以與其靶基因通過堿基互補配對結合[16].因此，我們通過將HNRNPD上與miR-197種子序列互補配對的7mer區(qū)段突變了3～4個堿基獲得了HNRNPD的突變型質粒.并注意避免產(chǎn)生其他microRNA新的結合位點.轉染前一天將U251細胞以每孔1×105個細胞的數(shù)量接種在24孔板上，當細胞密度達到70%左右時進行miRNA、熒光素酶報告基因質粒以及Renilla表達載體的共轉染.轉染試劑為X-tremeGENE siRNA轉染試劑(Roche)，miRNA的作用終濃度為50nmol/L，每孔所加熒光素酶報告基因質粒和Renilla表達質粒分別為0.5μg和0.1μg.轉染24h后檢測熒光素酶活性(Dual-Luciferase?Reporter Assay System，Promega).熒光素酶信號通過Renilla進行標準化.

1.2.6 Western blot

提取6孔板內細胞時每孔加入150μL含有完整蛋白酶抑制劑(Roche)的RIPA(中等)蛋白裂解液(Beyotime)提取細胞蛋白，裂解處理后通過10%SDS-PAGE(Beyotime Biotechnology)進行電泳分離.一抗來自Abcam，包括Vinculin抗體(ab129002)，HNRNPD抗體(ab61193)和Ago2抗體(ab186733).二抗為HRP標記的山羊抗兔IgG(Beyotime Biotechnology).計算蛋白相對表達量時用Vinculin作內參進行標準化，并用Image J量化蛋白表達水平.

1.2.7 Biotin-miRNA pull down

轉染前一天將U251細胞傳代后接種到10cm細胞培養(yǎng)皿中，待細胞密度到70%左右進行脂質體轉染.每皿轉染工作濃度為50nmol/L的帶生物素(biotin)修飾的miRNA-197mimics.轉染24h后收集全細胞裂解液，并添加磁珠以下拉帶生物素標簽的miR-197以及與其結合的RNA.洗脫后，通過qRT-PCR測定內源HNRNPD的mRNA表達水平.通過以下公式計算miRNA的富集: 相對mRNA結合倍數(shù)=(Bio miR-197 pull-down/Bio scramble pull-down)/(Bio miR-197 input/Bio scramble input).每個數(shù)據(jù)至少進行3組獨立重復實驗.熒光素酶mRNA引物從Genewiz訂購，引物序列見表3.

表3 Luciferase引物列表

1.2.8 疾病相關基因提取

從以下幾個數(shù)據(jù)庫中提取不同疾病的相關基因: 自閉癥相關基因來自AutDB的4星及5星基因[17-18].高血壓相關基因來自http://bws.iis.sinica.edu.tw/THOD/.精神分裂癥相關基因來自SZDB[19].癲癇相關基因來自http://carpedb.ua.edu/.所有其他與疾病相關的基因均來自OMIM(https://omim.org/).通過ARED-PLUS[15]篩選所有疾病相關基因的AREs mRNA百分比，并用卡方檢驗確定疾病和整個基因組中AREs mRNA的百分比是否有顯著差異.

2 結果與分析

2.1 9個潛在靶基因中miR-197僅上調HNRNPD的表達

我們首先從miRDB[20]和targetscan[21]兩個數(shù)據(jù)庫中各自預測了miR-197的潛在靶基因，然后取交集.由于miR-197在神經(jīng)干細胞分化和癌癥中的作用，我們檢查了預測的靶基因中有多少基因在hiPSC，hNPC，人神經(jīng)元，U251細胞和293T細胞中是在前1000高表達的基因(圖1(a)).我們將5種細胞分為兩組，將各細胞中上述高表達基因中的預測靶基因取交集，每組獲得了10個共有的高表達基因.這兩組中有9個基因是5種細胞共有且高表達的.因此，我們將這9個基因作為的miR-197靶基因的候選基因，分別是APL6IP1，CAPRIN1，CBX3，HNRNPD，HNRNPR，NCL，PGK1，RAN，ST13(圖1(b)).接著，我們用miR-197mimics或其對照轉染293T細胞，轉染24h后通過qRT-PCR檢測miR-197對293T細胞中這些基因的影響.如圖2所示，除了HNRNPD，所有這些靶基因的mRNA表達量都在miR-197mimics的作用下顯著降低，只有HNRNPD的表達水平被miR-197上調.

圖1 miR-197靶基因的預測

圖2 miR-197潛在靶基因在293T細胞中表達的驗證

2.2 miR-197可以在mRNA和蛋白水平顯著上調HNRNPD的表達

我們用miR-197mimics或抑制劑(i-197)轉染U251細胞以進一步確認miR-197對HNRNPD的作用.qRT-PCR結果表明在U251細胞中miR-197mimics顯著提高了miR-197的表達水平，而i-197則對其進行了抑制(圖3(a,b)，第52頁).隨后，用qRT-PCR檢測轉染了miR-197mimics或抑制劑后U251細胞中HNRNPD的mRNA表達水平.結果表明，miR-197mimics可以上調HNRNPD的表達水平約3.5倍(圖3(c)，第52頁).接著，我們用蛋白質印跡實驗檢測了細胞質中HNRNPD的蛋白質水平.與以前的報道類似，在細胞質中檢測到HNRNPD p37和HNRNPD p40，而HNRNPD p37在U251細胞中的蛋白表達水平高于HNRNPD p40(圖3(d)，第52頁).因此，我們統(tǒng)計了HNRNPD p37的蛋白表達水平.結果表明，miR-197mimics顯著上調了HNRNPD p37的蛋白水平，而i-197則下調了HNRNPD p37的蛋白水平(圖3(d)).

圖3 miR-197在mRNA和蛋白水平上均上調HNRNPD的表達

2.3 miR-197通過5’UTR區(qū)上調HNRNPD表達

根據(jù)TargetScan數(shù)據(jù)庫(7.2版)的預測，miR-197在HNRNPD的3’UTR上有一個8-mer的靶向結合位點(圖4(a)，第52頁).因此，我們構建了包含3’UTR全長的野生型(3’UTR-WT)或突變型(3’UTR-MUT)熒光素酶報告質粒.突變型3’UTR在預測位點包含3個點突變(圖4(a)).將miR-197mimics或抑制劑i-197與含HNRNPD3’UTR-WT或3’UTR-MUT的熒光素酶報告質粒共轉染，結果顯示miR-197mimics或者i-197對于含HNRNPD3’UTR野生型和突變型報告質粒的熒光素酶表達水平都沒有顯著影響(圖4(b)，第52頁).因此，HNRNPD的3’UTR很可能不是miR-197的作用靶點.

圖4 HNRNPD的3’UTR不是miR-197的作用靶點

據(jù)前言中所述，已有報道表明microRNA也可能與靶基因的5’UTR相互作用[20].因此，我們檢查了HNRNPD的5’UTR序列，并根據(jù)RNAhybrid[22]中的自由能計算發(fā)現(xiàn)了4個可能的結合位點(圖5(a)，第53頁).根據(jù)預測的結果，我們構建帶有5’UTR全長的野生型5’UTR-WT和4種突變型5’UTR-MUT1～4(序列如圖5(b～e)，第53頁)的熒光素酶報告質粒.將這些熒光素酶報告質粒和miR-197mimics或陰性對照共轉染U251細胞.同樣，miR-197顯著上調了5’UTR-WT的熒光素酶相對表達水平(圖5(f)).與5’UTR-WT相比，miR-197對HNRNPD的上調作用在MUT1中丟失(圖5(f))，其他3個位點的突變對于上調作用有一定程度的削弱，但是沒有MUT1顯著.因此，熒光素酶檢測結果表明miR-197是通過5’UTR而不是預測的3’UTR區(qū)和HNRNPD結合，而位點1是最重要的調控位點.

圖5 miR-197作用于HNRNPD mRNA的5’UTR

2.4 miR-197通過互補配對直接結合HNRNPD mRNA的5’UTR區(qū)

為了驗證miR-197是否能與HNRNPD的mRNA直接結合，我們利用帶生物素標記的miR-197mimics(miR-197*)進行RNA pull-down實驗，然后用miR-197*結合的RNA作為模板進行qRT-PCR實驗.我們首先利用U251細胞的內源性RNA進行實驗，結果表明，被miR-197mimics拉下的內源性HNRNPDmRNA為對照組的2.36倍(圖6(a)).

為進一步確認HNRNPD與miR-197的結合位點，將HNRNPD3’UTR和5’UTR的熒光素酶報告基因在U251細胞過表達，然后進行RNA pull-down和qRT-PCR實驗.這次qRT-PCR驗證的是含有熒光素酶的mRNA，結果顯示miR-197*只與含5’UTR的報告基因mRNA結合(圖6(b))，而不與3’UTR報告基因的mRNA結合(圖6(c)).為了驗證之前5’UTR的位點一是否對于HNRNPD和miR-197的結合也很重要，我們進一步利用突變型熒光素酶報告質粒(5’UTR WT，5’UTR MUT1)與帶生物素標簽的miR-197 mimics共轉染后進行RNA pull-down和qRT-PCR實驗.結果表明，當HNRNPD的5’UTR位點1發(fā)生突變時，5’UTR MUT1喪失了與miR-197結合的能力(圖6(b)).上述結果提示，miR-197是通過互補配對的方式直接結合HNRNPDmRNA的5’UTR.

圖6 miR-197通過互補配對直接結合HNRNPD mRNA的 5’UTR

2.5 miR-197對HNRNPD蛋白的上調依賴于Ago2

在miRNA介導的基因激活中，Ago2是必不可少的[23].我們首先用3種不同的Ago2 shRNA轉染U251細胞，發(fā)現(xiàn)均能顯著下調AGO2的表達水平(圖7(a，b)).

然后，我們使用其中Ago2-sh1和Ago2-sh2與miR-197mimics進行共轉染.Western blot結果顯示，此時只有Ago2-sh1對Ago2依然有下調作用(圖7(c),(d)).有趣的是，當Ago2表達量顯著降低時，miR-197失去了對HNRNPD的上調作用(圖7(c),(e)).因此，miR-197對HNRNPD的上調是依賴于Ago2的.

3 討 論

本項工作中，我們發(fā)現(xiàn)miR-197結合的是HNRNPD的5’-UTR序列.盡管有越來越多的生物信息學工具預測miRNA與5’UTR的相互作用[24]，但通過實驗證實microRNA通過5’UTR對靶向mRNA起上調作用的報道依然較少.在本研究之前，miRNA只通過5’UTR上調靶基因的報道僅有4例.除miR-122對丙型肝炎病毒的調控外[25-27]，僅有miR-10a，miR-346和miR196b 3個miRNA被證實能夠通過靶向結合5’UTR激活翻譯.miR-10a通過與5’UTR結合來刺激核糖體蛋白mRNA的翻譯[28].miR-346可以通過5’UTR上調RIP140的表達[29].miR-196b通過5’UTR上調Insulin2的表達[30].上述4個miRNA的這些報告均是miRNA通過5’UTR對靶基因mRNA進行翻譯水平的調控.此外，只有一例報道證明miRNA可以同時下調靶基因的轉錄和翻譯: miR-103a-3p可以靶向結合GPRC5A的5’UTR以下調其mRNA和蛋白質水平[31].我們的結果證明了miR-197可以同時上調HNRNPD的轉錄和翻譯水平，并且miR-197對于HNRNPD翻譯的上調是依賴于Ago2的.已知在RNA介導的基因沉默中，Ago2蛋白是沉默復合體(RISC)的核心組成部分.而在RNA介導的基因激活中，Ago2蛋白同樣起到識別、招募小RNA形成復合物的作用[32].如受dsRNA上調的E-cadherin，p21和VEGF在敲除Ago2后，原有的RNA激活效應幾乎被完全抑制[23].另一方面，對比不同哺乳動物(人、恒河猴、狗、馬、山羊等)HNRNPD的5’-UTR序列，HNRNPD的5’-UTR區(qū)域在這些物種中具有高保守性，且miR-197靶向結合HNRNPD的5’-UTR位點1也相對保守，提示在這些物種中miR-197均可能對HNRNPD有調控作用.具體miR-197是如何上調HNRNPD的RNA水平的，則有待進一步深入研究.

另一個挑戰(zhàn)是要了解HNRNPD和miRNA之間復雜的調控網(wǎng)絡.HNRNPD不僅參與ARE-mRNA的降解，還參與調控miRNA的合成和其他功能.據(jù)報道，HNRNPD可以調節(jié)關鍵miRNA加工者DICER1的mRNA[33].此外，HNRNPD可通過幫助miRNA加載至Ago2來促進miRNA介導的基因沉默[34].但是，HNRNPD也可以與miRNA競爭結合3’UTR中的ARE，從而阻斷miRNA的功能[35].研究中，我們證實miR-197可以上調HNRNPD，但HNRNPD是否可以對miR-197進行反饋調節(jié)，以及miR-197對其他mRNA和miRNA的影響有待進一步研究.

HNRNPD的生理功能目前還不是特別清楚.HNRNPD在胚胎的腦部有高表達[38-39]，特別是在大鼠的大腦皮層發(fā)育高峰期[38].因此，HNRNPD很可能也參與了神經(jīng)發(fā)育和相關疾病的調控.我們搜索了人遺傳疾病公共數(shù)據(jù)庫DECIPHER[40]，發(fā)現(xiàn)其中共記錄了34個攜帶HNRNPD的拷貝數(shù)變異(CNV)的臨床樣本，在這些樣本中有23例(67.6%)患有嚴重的智力障礙、自閉癥、整體發(fā)育遲緩或語言發(fā)育遲緩.

此外，已有研究發(fā)現(xiàn)HNRNPD可以促進mRNA快速降解[36]，這一作用主要是通過與富含AU元件(AREs)的mRNA結合實現(xiàn)的[11,37].因此，我們還探索分析了一些主要神經(jīng)發(fā)育障礙疾病的相關基因是否含有AREs以及含有AREs的基因所占的比例.我們從多個數(shù)據(jù)庫AutDB[17-18]、SZDB[19]和OMIM中提取了與自閉癥，嚴重智力障礙，語言發(fā)育遲滯，精神分裂癥，癲癇病，神經(jīng)管缺陷，先天性心臟病和高血壓相關的核心基因.上述所有疾病相關核心基因均通過ARED-PLUS[15]篩查AREs mRNA的百分比，結果如表4所示.按ARED-PLUS之前的分析，全基因組中約有22%的基因含有AREs[15].而在119個自閉癥相關基因中，有52個(43.7%)含有ARE，幾乎是全基因組水平的2倍.此外，在其他幾種神經(jīng)發(fā)育障礙中，包括嚴重智力障礙、語言發(fā)育遲滯相關基因中，含有AREs的基因比例也顯著高于全基因組.

表4 AREs-mRNA在各疾病相關基因中所占的比例

因此，HNRNPD基因異常和其調控異常很可能與神經(jīng)發(fā)育障礙疾病相關.雖然HNRNPD基因敲除的小鼠模型表型為炎癥反應失調，而沒有明顯的神經(jīng)系統(tǒng)缺陷[41].但是，DECIPHER數(shù)據(jù)庫中大多數(shù)攜帶HNRNPD的CNV的人類患者具有嚴重的神經(jīng)發(fā)育障礙.這種差異可能是由于動物模型不夠準確以及人腦的結構和功能比小鼠更復雜導致的.因此，后續(xù)需要對人群的HNRNPD進行更多的遺傳學研究，以充分了解其在人腦發(fā)育中的功能.