何克喆，皮 妍，郭 蘇

(1.復(fù)旦大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院, 上海 200438; 2.加州大學(xué)舊金山分校 生物工程與治療科學(xué)系 加利福尼亞, 美國 94143-2811)

人類dia1r(delete-in-autism 1 related gene)基因，又名dipk2b(divergent protein kinase domain 2B)，位于人類基因組的X染色體上[1]，是孤獨(dú)癥譜系障礙相關(guān)基因.dia1r是DIA1家族同源基因[2]，這個(gè)家族有3個(gè)基因，分別是dia1a，dia1b，dia1r，他們共同包含了FAM69蛋白激酶結(jié)構(gòu)域[3-4].

dia1r基因只存在于脊椎動(dòng)物中，與脊椎動(dòng)物的全基因組重復(fù)事件(Genome Wide Repeat events, WGD)和動(dòng)物進(jìn)化出高級(jí)神經(jīng)系統(tǒng)的時(shí)間高度吻合.通過對(duì)多種魚類進(jìn)行基因組測(cè)序并對(duì)比后發(fā)現(xiàn)，dia1r只存在于群居性魚類的基因組中，而更加獨(dú)居性的魚類基因組中則沒有發(fā)現(xiàn)[2].目前，已經(jīng)有兩例脆性X染色體綜合征(Fragile X Syndrome, FXS)患者中發(fā)現(xiàn)了dia1r的非同義突變[5-6].還有一些文獻(xiàn)報(bào)導(dǎo)了包含dia1r基因在內(nèi)的Xp11.3染色體區(qū)域與神經(jīng)系統(tǒng)的疾病相關(guān)[7]，此區(qū)域的缺失導(dǎo)致了一例男性孤獨(dú)癥高易感性[8]和一例先天性Kaburi綜合征[9].另一項(xiàng)臨床病例發(fā)現(xiàn)，缺失dia1r可能會(huì)導(dǎo)致患者出現(xiàn)面部畸形、智力障礙和語言發(fā)育遲緩等癥狀[10].對(duì)雛雞發(fā)育過程中cdia1r表達(dá)的分析表明，該基因在卵黃囊血管母細(xì)胞、血島和背主動(dòng)脈、心內(nèi)膜和頭部血管內(nèi)皮細(xì)胞中表達(dá)[11]，這些區(qū)域的共同特征是都具有造血能力.進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)，cdia1r在血源性內(nèi)皮細(xì)胞中的表達(dá)量更高，在腦神經(jīng)上皮中的血管內(nèi)皮和類似小膠質(zhì)細(xì)胞的分離細(xì)胞中也有表達(dá)[11].其他模式生物中的研究也發(fā)現(xiàn)dia1r在造血細(xì)胞和神經(jīng)系統(tǒng)中表達(dá)，在斑馬魚胚胎的造血祖細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞(cc058基因)[12]、胚胎和成年小鼠大腦的內(nèi)皮細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞(4930578C19Rik基因)[13]以及人內(nèi)皮細(xì)胞中都檢測(cè)到了dia1r同源基因的轉(zhuǎn)錄本[14].這些進(jìn)化及臨床證據(jù)均暗示dia1r與神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育及孤獨(dú)癥譜系障礙的產(chǎn)生有著密切的聯(lián)系.

孤獨(dú)癥譜系障礙(Autism Spectrum Disorders, ASDs)是一種由遺傳因素影響的神經(jīng)系統(tǒng)疾病，臨床上主要有3個(gè)診斷依據(jù): 語言障礙、社交障礙和重復(fù)刻板的行為[15].因此，相比于解剖學(xué)、生理學(xué)等檢測(cè)方法，行為檢測(cè)方法往往能夠提供與人類ASDs的核心癥狀更相關(guān)的數(shù)據(jù)[16]，而行為學(xué)實(shí)驗(yàn)也成為了在動(dòng)物模型中鑒定ASDs的重要依據(jù).近年來，越來越多的研究人員使用斑馬魚作為ASDs的動(dòng)物模型.與小鼠不同，斑馬魚在白天活躍，對(duì)光暗周期的偏好更類似于人類[17]，再加上體積小、繁殖能力強(qiáng)、胚胎期透明、行為學(xué)表型豐富等優(yōu)點(diǎn)[18-19]，斑馬魚在高通量行為學(xué)實(shí)驗(yàn)中有著巨大的優(yōu)勢(shì)，目前已越來越廣泛地用于ASDs的研究之中.

本研究通過CRISPR/Cas9系統(tǒng)構(gòu)建斑馬魚的dia1r基因敲除突變體，成功獲得了穩(wěn)定遺傳的純合突變體.同時(shí)本研究也檢測(cè)了dia1r敲除突變體的行為學(xué)表型，對(duì)純合突變體幼魚進(jìn)行了自發(fā)運(yùn)動(dòng)能力分析、趨觸性分析、光暗交替刺激分析，對(duì)純合突變體成魚進(jìn)行了新缸實(shí)驗(yàn)分析、社交偏好分析.

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和菌株

野生型斑馬魚(AB品系)由復(fù)旦大學(xué)遺傳學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室斑馬魚研究中心提供.養(yǎng)殖系統(tǒng)由上海海圣生物實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司提供，斑馬魚喂養(yǎng)及產(chǎn)卵方案依據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)建立，并按照Kimmel等人描述對(duì)胚胎進(jìn)行發(fā)育階段分期[20].本研究中斑馬魚的相關(guān)實(shí)驗(yàn)全部按照復(fù)旦大學(xué)動(dòng)物倫理委員會(huì)的規(guī)定進(jìn)行.載有pT7-gRNA的E.coliDH5α菌株和載有pGH-T7-zCas9的E.coliDH5α菌株均由范德堡大學(xué)分子生理學(xué)與生物物理學(xué)系陳文標(biāo)教授實(shí)驗(yàn)室提供.

1.2 方法

1.2.1 構(gòu)建斑馬魚CRISPR/Cas9基因敲除系統(tǒng)

從Ensembl網(wǎng)站(http://asia.ensembl.org/index.html)下載dia1r基因序列(ENSDARG00000061747)，選取其進(jìn)化最保守的區(qū)域蛋白激酶結(jié)構(gòu)域所對(duì)應(yīng)的序列設(shè)計(jì)gRNA(guide RNA)，通過CCTop網(wǎng)站(https://crispr.cos.uni-heidelberg.de/)[21]、麻省理工學(xué)院張鋒實(shí)驗(yàn)室網(wǎng)站(https://zlab.bio/guide-design-resources)[22]和CHOPCHOP網(wǎng)站(http://chopchop.cbu.uib.no/)[23]分別設(shè)計(jì)評(píng)分，根據(jù)三者反饋的列表綜合選取最優(yōu)的gRNA序列，其靶標(biāo)位點(diǎn)為GAGAGGAAAACAGGGTCCTGAGG(表1，已用下劃線標(biāo)出)，其中AGG為PAM序列.

表1 實(shí)驗(yàn)所用引物

將pT7-gRNA作為模板，以gRNA引物和載體通用引物分別作為正反向引物，擴(kuò)增gRNA體外轉(zhuǎn)錄線性化模板.回收純化后再使用MEGAscriptTMT7 Transcription Kit(Invitrogen,AM1333)體外轉(zhuǎn)錄gRNA，轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物使用Spin Sequencing Reaction Clean-Up試劑盒回收純化，經(jīng)Nanodrop測(cè)定濃度后，置于-80℃保存.

pGH-T7-zCas9載體[24]上的Cas9序列針對(duì)斑馬魚進(jìn)行過密碼子優(yōu)化，因此更適用于本實(shí)驗(yàn).擴(kuò)增培養(yǎng)載有pGH-T7-zCas9的E.coliDH5α菌株并獲得質(zhì)粒pGH-T7-zCas9，使用限制性內(nèi)切酶XbaⅠ對(duì)載體進(jìn)行酶切，將酶切產(chǎn)物進(jìn)行凝膠電泳分離，使用膠回收試劑盒回收線性化質(zhì)粒片段.將回收的線性化質(zhì)粒片段作為模板，使用T7 mMESSAGE mMACHINE Kit(Ambion, AM1344)體外轉(zhuǎn)錄獲得Cas9 mRNA.使用Poly(A)Tailing Kit(invitrogen, AM1350)為Cas9 mRNA進(jìn)行3’末端加Poly A尾反應(yīng).所得的反應(yīng)產(chǎn)物使用MEGAclear Transcription Clean-Up Kit(Invitrogen, AM1908)回收.回收產(chǎn)物經(jīng)Nanodrop儀器測(cè)定濃度后，保存于-80℃.

1.2.2 構(gòu)建dia1r基因斑馬魚敲除突變體

將Cas9 mRNA和gRNA分別用RNase free water稀釋，并配置顯微注射緩沖液，緩沖液中Cas9 mRNA終濃度為300ng/μL，gRNA終濃度為20ng/μL.在斑馬魚胚胎受精后的單細(xì)胞期對(duì)細(xì)胞進(jìn)行顯微注射，注射的斑馬魚胚胎數(shù)量應(yīng)不少于100顆，并留下至少30顆同批未注射胚胎作為對(duì)照組.

等到胚胎發(fā)育至1dpf(days post fertilization)時(shí)，取實(shí)驗(yàn)組斑馬魚胚胎和對(duì)照組斑馬魚胚胎分組提取基因組DNA.設(shè)計(jì)引物以基因組DNA為模板PCR擴(kuò)增gRNA靶標(biāo)位點(diǎn)上下游序列(flanking sequence)，使用PpumⅠ對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行酶切，檢測(cè)gRNA靶標(biāo)位點(diǎn)的基因編輯效率.將檢測(cè)結(jié)果為陽性的PCR產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序確認(rèn)是否發(fā)生基因編輯.根據(jù)測(cè)序結(jié)果，把發(fā)生基因編輯的斑馬魚胚胎培養(yǎng)至成魚，稱為F0代突變體.

1.2.3 篩選獲得穩(wěn)定遺傳的純合敲除突變體

將F0代成魚與野生型成魚外交(out cross)，取10顆所得胚胎于1dpf時(shí)期抽提基因組，PCR擴(kuò)增靶標(biāo)位點(diǎn)上下游序列后，測(cè)序確認(rèn)是否產(chǎn)生堿基移碼突變.但由于此時(shí)無法單胚胎檢測(cè)基因組，所以要將F0代成魚與野生型成魚外交獲得的F1代胚胎培養(yǎng)至成魚，通過剪尾測(cè)序的方法檢測(cè)F1代成魚基因型.F1代成魚為雜合敲除突變體，為防止gRNA探針脫靶對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果產(chǎn)生影響，將F1代雜合敲除突變體與野生型外交，獲得的胚胎養(yǎng)大至成魚后剪尾檢測(cè)基因型，篩選獲得F2代雜合敲除突變體.

將獲得的F2代雜合敲除突變體養(yǎng)至成魚，自交后獲得F3代胚胎，將胚胎培養(yǎng)至成魚，剪尾檢測(cè)基因型，檢測(cè)完成后分缸培養(yǎng).將F3代純合突變體自交，收集F4代胚胎并養(yǎng)至成魚.F4代斑馬魚均為無母源表達(dá)的純合突變體，即穩(wěn)定遺傳的dia1r純合突變體.

1.2.4 行為學(xué)實(shí)驗(yàn)

將獲得的斑馬魚dia1r-/-突變體自交，所繁殖的同一批胚胎放入培養(yǎng)箱中養(yǎng)至7d.以同批次野生型幼魚作為對(duì)照組，在24孔板中每孔加入1mL藍(lán)水，放入一條7dpf幼魚.做好標(biāo)記后將24孔板放入Noduls行為學(xué)分析儀箱體內(nèi)，視頻記錄實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，使用graphpad軟件進(jìn)行實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的分析與作圖.實(shí)驗(yàn)過程中，溫度保持在28.5℃左右.記錄斑馬魚行為時(shí)，周圍保持安靜，以排除噪音對(duì)實(shí)驗(yàn)的干擾.

1.2.4.1 曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)

斑馬魚在24孔板中自由游動(dòng)(圖1(a))，箱體內(nèi)的攝像機(jī)可以記錄其運(yùn)動(dòng)軌跡，根據(jù)運(yùn)動(dòng)軌跡統(tǒng)計(jì)運(yùn)動(dòng)距離、平均速度、活躍程度、角速度等參數(shù)[25-26].

圖1 行為學(xué)實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｊ綀D

趨觸性是指在一個(gè)新奇的環(huán)境中，斑馬魚是否會(huì)自發(fā)的接近容器的邊緣地帶的特性.趨觸性可以衡量斑馬魚對(duì)一個(gè)陌生環(huán)境的焦慮程度[27].將24孔板中的每個(gè)孔劃分為中心區(qū)和外周區(qū)這兩個(gè)面積相同的觀察區(qū)(圖1(a))，通過計(jì)算斑馬魚幼魚在兩個(gè)觀察區(qū)內(nèi)游動(dòng)的距離比值來考查趨觸性.計(jì)算公式為: 趨觸值=(外周區(qū)游動(dòng)距離-中心區(qū)游動(dòng)距離)/(外周區(qū)游動(dòng)距離+中心區(qū)游動(dòng)距離).

1.2.4.2 光暗交替實(shí)驗(yàn)

為了檢測(cè)突變體斑馬魚在不同光照條件下自發(fā)運(yùn)動(dòng)能力、趨觸性等特征，通過控制行為學(xué)實(shí)驗(yàn)儀器的光照強(qiáng)度，可以考察dia1r-/-幼魚對(duì)光暗交替刺激的反應(yīng).首先將斑馬魚幼魚放入明場(chǎng)環(huán)境下適應(yīng)30min，再以5min的頻率進(jìn)行光暗交替刺激.以10s為單位統(tǒng)計(jì)幼魚在細(xì)分時(shí)間內(nèi)的平均運(yùn)動(dòng)速度和趨觸值，觀察斑馬魚突變體與野生型的區(qū)別.

1.2.4.3 新缸實(shí)驗(yàn)

使用新缸實(shí)驗(yàn)分析斑馬魚成魚的焦慮程度.將斑馬魚成魚放置在一個(gè)長(zhǎng)30cm、寬為10cm、高為15cm的透明魚缸中觀察10min.透明魚缸從上到下等分為3個(gè)區(qū)域，分別為頂部區(qū)(upper zone)，中間區(qū)(middle zone)和底部區(qū)(bottom zone)，使用攝像機(jī)記錄斑馬魚成魚在這3個(gè)區(qū)域所持續(xù)的時(shí)間(圖1(b)).實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，將使用的斑馬魚放回到斑馬魚系統(tǒng)中.

1.2.4.4 成魚社交偏好實(shí)驗(yàn)

將斑馬魚放入成魚社交偏好實(shí)驗(yàn)裝置(圖1(c))中.在缸的一側(cè)放入5～6條斑馬魚，另一側(cè)則不放任何物體，通過斑馬魚在社交區(qū)(conspecific arm)與空箱區(qū)(empty arm)的游動(dòng)時(shí)間比值來計(jì)算斑馬魚社交偏好值[28].計(jì)算公式為: 社交偏好值=(社交區(qū)游動(dòng)時(shí)間-空箱區(qū)游動(dòng)時(shí)間)/(社交區(qū)游動(dòng)時(shí)間+空箱區(qū)游動(dòng)時(shí)間)×100%.

2 結(jié)果與分析

2.1 檢測(cè)CRISPR/Cas9系統(tǒng)定點(diǎn)基因編輯效率

將合成的gRNA和Cas9 mRNA混勻后，顯微注射進(jìn)單細(xì)胞期胚胎中，以5顆為一組，選取3組注射后24h的斑馬魚胚胎擴(kuò)增其上下游序列(引物見表1)，檢測(cè)基因編輯效率.研究發(fā)現(xiàn)所選取的3組胚胎均被限制性內(nèi)切酶PpumⅠ切割，但都沒有切割完全(圖2)，說明注射組斑馬魚的確發(fā)生了基因編輯.考慮到PpumⅠ酶切效率低，無法準(zhǔn)確反映基因編輯效率，同時(shí)也使用TA克隆對(duì)突變效率進(jìn)行了檢測(cè)，結(jié)果表明: 3組中突變效率分別為6/8,7/8,6/8，平均效率為79%，其中包括4種缺失突變，-1bp占比50%，-2bp占比4%，-13bp占比15%，-15bp占比10%，均為有義突變.

圖2 檢測(cè)gRNA效率

2.2 鑒定穩(wěn)定遺傳的dia1r基因敲除突變體斑馬魚

F0代成魚與野生型魚進(jìn)行1∶1交配，收集獲得的F1代胚胎養(yǎng)至性成熟，剪尾鑒定其基因型.F1代中共檢測(cè)了32條成魚，其中有12條出現(xiàn)雙峰，說明這12條F1代成魚為雜合突變體，突變效率為37.5%.使用TA克隆檢測(cè)雜合突變體的突變類型，其中5條雌魚和3條雄魚出現(xiàn)單拷貝1bp缺失，1條雄魚和1條雌魚出現(xiàn)單拷貝13bp缺失，2條雄魚出現(xiàn)單拷貝15bp缺失，具體缺失堿基位置見圖3(a)(第40頁).所獲得的F1代雜合突變體分別為dia1rΔ1/wt(單拷貝缺失1bp)，dia1rΔ13/wt(單拷貝缺失13bp)，dia1rΔ15/wt(單拷貝缺失15bp).其中dia1rΔ15/wt會(huì)導(dǎo)致DIA1R蛋白缺失5個(gè)氨基酸，并不發(fā)生移碼突變，而dia1rΔ1/wt和dia1rΔ13/wt則為同一個(gè)閱讀框，會(huì)發(fā)生同樣的無義突變導(dǎo)致蛋白翻譯提前終止，dia1rΔ13/wt會(huì)比dia1rΔ1/wt多缺失4個(gè)氨基酸(圖3(b)，第40頁).3個(gè)突變體都破壞了DIA1R蛋白的功能結(jié)構(gòu)域FAM69蛋白激酶結(jié)構(gòu)域.

將F1代成魚中dia1rΔ1/wt與野生型斑馬魚雜交，所產(chǎn)的F2代胚胎培養(yǎng)至成魚后剪尾鑒定基因型，共鑒定30條F2代成魚，其中雜合突變體13條，5條雌魚8條雄魚，野生型17條.將F2代雜合突變體雌雄魚自交，獲得F3代胚胎，長(zhǎng)至性成熟后鑒定其基因型，共鑒定34條，其中純合突變體8條，雜合突變體19條，野生型7條(圖3(c)，第40頁).為了去除母源攜帶的dia1rmRNA的影響，將F3代純合突變體自交，收集F4代胚胎并養(yǎng)至成魚.F4代斑馬魚均為無母源表達(dá)的純合突變體，即穩(wěn)定遺傳的dia1r-/-純合突變體.

圖3 F1雜合突變體及F3代成魚基因型的鑒定

2.3 持續(xù)光照條件下dia1r-/-幼魚自發(fā)運(yùn)動(dòng)能力降低

獲得dia1r-/-純合突變體后，我們觀察其對(duì)斑馬魚的死亡率、發(fā)育、形態(tài)、致畸率等基本表型有無影響，發(fā)現(xiàn)其與野生型對(duì)照組無差異(數(shù)據(jù)未顯示).為了進(jìn)一步觀察dia1r突變對(duì)斑馬魚的影響，我們進(jìn)行了行為學(xué)分析.以野生型幼魚為對(duì)照組，分析dia1r-/-幼魚的自發(fā)運(yùn)動(dòng)能力.結(jié)果表明，相對(duì)于野生型幼魚，dia1r-/-幼魚自發(fā)運(yùn)動(dòng)速度顯著降低(圖4(a，c)).將斑馬魚運(yùn)動(dòng)速度超過0.4cm/s時(shí)定義為狂躁?duì)顟B(tài)[25]，dia1r-/-幼魚在10min內(nèi)出現(xiàn)狂躁?duì)顟B(tài)的次數(shù)較野生型幼魚顯著下降(圖4(b)).這兩個(gè)指標(biāo)都說明dia1r-/-幼魚自發(fā)運(yùn)動(dòng)能力較野生型有所降低.

圖4 持續(xù)光照條件下dia1r-/-幼魚自發(fā)運(yùn)動(dòng)降低

2.4 持續(xù)光照條件下dia1r-/-幼魚趨觸性減弱

趨觸性能夠反映斑馬魚在陌生環(huán)境中的焦慮程度，趨觸性強(qiáng)的幼魚在24孔板中會(huì)緊貼孔壁游動(dòng)(如圖5(a)，左側(cè)趨觸性強(qiáng)于右側(cè))[25].在對(duì)dia1r-/-幼魚的進(jìn)行趨觸性分析時(shí)發(fā)現(xiàn)，相較于野生型斑馬魚，dia1r-/-幼魚在外周區(qū)和中心區(qū)的游動(dòng)速度有顯著差異，在外周區(qū)的游動(dòng)速度更快(圖5(b)).而且，對(duì)比野生型幼魚分別在外周區(qū)及中心區(qū)的持續(xù)時(shí)間，可以發(fā)現(xiàn)dia1r-/-幼魚在兩個(gè)區(qū)域所持續(xù)的時(shí)間差值相對(duì)于野生型幼魚更小(圖5(d)).通過上文中公式計(jì)算趨觸值，可以看到dia1r-/-幼魚相比于野生型幼魚趨觸性顯著減弱了(圖5(c))，說明dia1r-/-幼魚較野生型幼魚有更低的焦慮水平.

圖5 持續(xù)光照條件下dia1r-/-幼魚趨觸性降低

2.5 光暗交替條件下dia1r-/-幼魚對(duì)光照變化比野生型更加敏感

有文獻(xiàn)報(bào)導(dǎo)表明在黑暗條件下，斑馬魚幼魚更傾向表現(xiàn)出焦慮行為[29-30]，在不同的光照條件下斑馬魚的行為差異成為檢測(cè)神經(jīng)系統(tǒng)疾病的依據(jù)[31].圖6(a)中可以看出，在光暗交替過程中，黑暗條件下dia1r-/-幼魚與對(duì)照組幼魚的游動(dòng)速度沒有明顯的差異，而當(dāng)轉(zhuǎn)換為光照條件時(shí)，則dia1r-/-幼魚的游動(dòng)速度低于對(duì)照組幼魚.

圖6 光暗交替條件下dia1r-/-幼魚與wt幼魚的行為差異

圖6(b)中統(tǒng)計(jì)了D1、L1、D2、L2 4個(gè)時(shí)期幼魚的運(yùn)動(dòng)速度，在L1、L2兩個(gè)時(shí)期dia1r-/-幼魚與野生型幼魚具有顯著性差異.同時(shí)在光暗交替的瞬間，dia1r-/-幼魚表現(xiàn)出更加突出的自發(fā)運(yùn)動(dòng)(圖6(a)中箭頭處)，說明其對(duì)光暗交替表現(xiàn)出更大的驚嚇反應(yīng).對(duì)dia1r-/-幼魚在外周區(qū)累計(jì)持續(xù)的時(shí)間進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，也發(fā)現(xiàn)在光暗交替的瞬間，突變體斑馬魚會(huì)更多的脫離外周，向中心區(qū)移動(dòng)(圖6(c)中箭頭處)，這兩者都說明了dia1r-/-幼魚對(duì)光暗交替刺激更加敏感.

2.6 dia1r-/-成魚比野生型成魚表現(xiàn)出更低的焦慮水平

dia1r-/-斑馬魚在成年后仍可以存活和繁殖.我們使用新缸實(shí)驗(yàn)檢測(cè)dia1r-/-成魚的焦慮程度.當(dāng)斑馬魚成魚被突然置于陌生的環(huán)境中時(shí)，通常會(huì)選擇趨向于在底部活動(dòng)，并減少探索行為以保證安全[32].隨著斑馬魚逐漸適應(yīng)新的環(huán)境，其探索行為通常會(huì)增加，在魚缸頂部的活動(dòng)時(shí)間也會(huì)增加[33].我們使用具有頂部區(qū)、中間區(qū)和底部區(qū)的三室透明水箱進(jìn)行試驗(yàn)(圖7(a))，我們發(fā)現(xiàn)dia1r-/-成魚在頂部區(qū)、中間區(qū)的時(shí)間顯著多于野生型成魚，而在底部區(qū)的時(shí)間顯著低于野生型成魚(圖7(c)).并且，dia1r-/-成魚和野生型成魚的運(yùn)動(dòng)速度沒有顯著差異(圖7(b))，說明該表型并非由運(yùn)動(dòng)缺陷引起.這些數(shù)據(jù)表明，dia1r-/-成魚比野生型成魚的焦慮水平要低.

圖7 dia1r-/-和野生成魚新缸實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.7 雄性dia1r-/-成魚比野生型成魚表現(xiàn)出更弱的社交偏好

待dia1r-/-斑馬魚長(zhǎng)至成魚后，檢測(cè)其自發(fā)運(yùn)動(dòng)能力和社交偏好.使用6月齡dia1r-/-雌魚10條，dia1r-/-雄魚10條，野生型雌魚10條，野生型雄魚10條，逐一放入裝置中檢測(cè)，社交偏好強(qiáng)的斑馬魚更喜歡在conspecific arm區(qū)域游動(dòng)(例如圖8(a)，右缸較左缸魚具有更強(qiáng)的社交偏好).分別對(duì)比雌性和雄性斑馬魚后發(fā)現(xiàn)，dia1r-/-成魚的自發(fā)運(yùn)動(dòng)速度與對(duì)照組之間的差異并不具有顯著性(圖8(b)).通過上文中公式計(jì)算社交偏好值，研究表明，雌性dia1r-/-成魚較對(duì)照組的社交偏好沒有顯著差異，而雄性dia1r-/-成魚相比于對(duì)照組表現(xiàn)出更弱的社交偏好(圖8(c)).

圖8 dia1r-/-和野生成魚社交偏好實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3 討 論

CRISPR/Cas9是一種目前使用廣泛的基因組靶向編輯技術(shù)，現(xiàn)在已有實(shí)驗(yàn)室成功通過添加不同的gRNA以實(shí)現(xiàn)在多個(gè)基因位點(diǎn)同時(shí)引入突變[34]，為高通量基因編輯提供一種技術(shù)途徑.但與此同時(shí)，CRISPR系統(tǒng)的脫靶效應(yīng)(off-target)也不可忽視，脫靶效應(yīng)可能會(huì)在非特異靶向位點(diǎn)造成基因編輯，破壞未知基因的功能，從而對(duì)基因突變表型鑒定帶來諸多不利影響[35]，是CRISPR系統(tǒng)用于高通量基因編輯技術(shù)必須要克服的一個(gè)阻礙.目前已有多種方法減少CRISPR系統(tǒng)的脫靶效應(yīng)的影響[36]，本研究為了避免脫靶效應(yīng)導(dǎo)致的非特異性基因編輯，從兩個(gè)方面進(jìn)行了改進(jìn): 首先，使用多個(gè)gRNA設(shè)計(jì)平臺(tái)分別對(duì)不同gRNA候選靶位點(diǎn)的脫靶效應(yīng)和序列特征打分，選取綜合評(píng)分最好的gRNA；第二，將雜合突變體與野生型斑馬魚交配繁殖，從而盡可能地篩選清除掉與實(shí)驗(yàn)位點(diǎn)不連鎖遺傳的脫靶位點(diǎn)上的基因突變.

近年來，斑馬魚已經(jīng)成為ASDs研究領(lǐng)域十分重要的動(dòng)物模型[37].許多行為測(cè)試已經(jīng)在斑馬魚模型中被開發(fā)出來，包括對(duì)社會(huì)互動(dòng)、求新、求愛、抑制回避、恐懼和焦慮反應(yīng)、重復(fù)/刻板行為、癲癇和攻擊的評(píng)估等[38-40].一些斑馬魚ASDs基因缺陷模型也表現(xiàn)出行為學(xué)的異常，例如2016年Hoffman等敲除ASDs相關(guān)基因cntnap2后發(fā)現(xiàn)突變體斑馬魚表現(xiàn)出夜間亢奮行為[41].而syngap1和shank3a雙基因敲除表現(xiàn)出運(yùn)動(dòng)能力下降、無效逃逸行為和類癲癇樣行為[42].shank3b基因的敲除導(dǎo)致斑馬魚的運(yùn)動(dòng)能力和社會(huì)交往能力下降[25].dyrk1a基因敲除的斑馬魚表現(xiàn)出社交障礙[43].本文對(duì)所構(gòu)建的dia1r純合突變體進(jìn)行的行為學(xué)分析表明，相較于野生型對(duì)照組，純合突變體幼魚在持續(xù)光照條件下自發(fā)運(yùn)動(dòng)能力減弱，趨觸性減弱，而在光暗交替情況下，純合突變體幼魚表現(xiàn)出對(duì)光照刺激更強(qiáng)的敏感性.這些結(jié)果與ASDs相關(guān)基因shank3b[25]、dyrk1a[43]等基因的行為學(xué)表型類似，但尚不確定這些表型是否是ASDs相關(guān)基因在斑馬魚中的普遍表型.另外，我們也觀察到雄性純合突變體成魚比野生型成魚表現(xiàn)出更弱的社交偏好，而在雌性成魚中則沒有顯著性的差異.這種因?yàn)樾詣e差異而導(dǎo)致表型不同的現(xiàn)象在ASDs相關(guān)基因的研究中普遍存在，在人類ASDs患者[44-46]和小鼠[47-48]中都有發(fā)現(xiàn)，但其中具體的機(jī)制還不是很明確.

在本研究中，我們成功獲得穩(wěn)定遺傳的dia1r基因敲除純合突變體，并通過行為檢測(cè)發(fā)現(xiàn)純合突變體幼魚自發(fā)運(yùn)動(dòng)能力減弱，趨觸性減弱，而且雄性純合突變體成魚表現(xiàn)出更弱的社交偏好.這些結(jié)果與其他ASDs相關(guān)基因的行為學(xué)表型類似，給了我們一些對(duì)dia1r基因功能的猜測(cè)，為更進(jìn)一步的機(jī)制研究奠定了良好的基礎(chǔ).同時(shí)，本文所構(gòu)建的dia1r純合突變體也有望成為ASDs疾病模型，為進(jìn)一步揭示孤獨(dú)癥譜系障礙的致病機(jī)制及藥物篩選提供工具.