吳洛濱，任雨琪，秦芳林，劉金明，金亞美

(1.上海師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院, 上海 200234; 2.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院 上海獸醫(yī)研究所 農(nóng)業(yè)部動(dòng)物寄生蟲學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 上海 200241)

血吸蟲病是由血吸蟲感染引起的一種僅次于瘧疾的常見(jiàn)熱帶寄生蟲病，常發(fā)于中東，南美和東南亞部分地區(qū)，尤其是在撒哈拉以南的非洲地區(qū)發(fā)病率很高[1]；據(jù)保守估計(jì)，至2018年全世界仍至少有2.3億人感染血吸蟲[2].目前治療血吸蟲病主要是應(yīng)用化學(xué)藥品，如使用吡喹酮對(duì)感染血吸蟲病的個(gè)體進(jìn)行治療，可取得良好的治療效果[3]，但化學(xué)藥物治療不能預(yù)防再次感染，且化療藥物的大量廣泛使用可能導(dǎo)致耐藥性蟲株的出現(xiàn)[4].

血吸蟲蟲體線性，雌雄異體，雌蟲所產(chǎn)大量蟲卵不僅會(huì)造成宿主嚴(yán)重的病理?yè)p害，排出體外也會(huì)造成疾病的再傳播[5].在血吸蟲的正常發(fā)育過(guò)程中，雌蟲的生殖發(fā)育需要與雄蟲的持續(xù)合抱，來(lái)自雄蟲的刺激對(duì)雌蟲的發(fā)育與保持雌蟲的繁殖能力必不可少.單性感染的雌蟲處于生殖系統(tǒng)不完善的發(fā)育阻遏狀態(tài)，兩性感染的合抱雌蟲一旦與雄蟲分開(kāi)，也會(huì)出現(xiàn)個(gè)體逐漸變小，生殖器官退化等現(xiàn)象.血吸蟲雄蟲通過(guò)一種非精子傳遞的方式調(diào)控著雌蟲的生長(zhǎng)發(fā)育，但其影響雌蟲生長(zhǎng)發(fā)育的具體機(jī)理尚不清楚[6].

實(shí)驗(yàn)室前期對(duì)單性感染和兩性感染雄蟲的蛋白質(zhì)組比較研究發(fā)現(xiàn)日本血吸蟲平衡型核苷轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白3(SjENT3)在18，21，23，25d 4個(gè)檢測(cè)時(shí)間點(diǎn)合抱雄蟲體內(nèi)的表達(dá)皆高于其在單性感染雄蟲體內(nèi)的表達(dá)，推測(cè)該蛋白可能會(huì)與血吸蟲雌雄合抱，雌雄蟲間信息傳遞有關(guān)，并進(jìn)而影響血吸蟲雌蟲的生長(zhǎng)生殖發(fā)育.

平衡型核苷轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(Equilibrative Nucleoside Transporters, ENTs)是一類存在于大多數(shù)真核生物細(xì)胞中的膜蛋白，能夠介導(dǎo)核苷、核堿基和其他核苷類似物的轉(zhuǎn)運(yùn)[7].ENTs通過(guò)跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)核苷參與和調(diào)節(jié)著生物體內(nèi)諸多生理、生化反應(yīng)，例如能量代謝、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、神經(jīng)發(fā)育、細(xì)胞和組織發(fā)育等[8]；其傳遞核苷類似物穿透生物膜的功能對(duì)于許多用于抗癌和抗病毒的核苷類似藥物的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)起著重要作用[9].ENTs家族包含ENT1，ENT2，ENT3和ENT4 4個(gè)成員[10-11].ENT3蛋白含有一個(gè)相對(duì)較長(zhǎng)的親水N-端區(qū)域，其在酸性條件下(pH5.5～6.5)具有最大的轉(zhuǎn)運(yùn)活性[12].ENT3蛋白除廣泛存在于人體器官外，還存在于人體的核內(nèi)質(zhì)溶酶體系統(tǒng).Hyde等[13]和Baldwin等[14]發(fā)現(xiàn)ENT3蛋白能夠有效轉(zhuǎn)運(yùn)嘧啶和嘌呤類核苷以及抗癌類藥物，其介導(dǎo)的抗癌和抗病毒的核苷類似藥物穿線粒體膜的轉(zhuǎn)運(yùn)可能與核苷藥物的線粒體毒性有著密切聯(lián)系.

為了研究SjENT3在血吸蟲生長(zhǎng)發(fā)育中的作用，我們利用qRT-PCR技術(shù)分析了其在血吸蟲生長(zhǎng)發(fā)育的不同時(shí)間、血吸蟲雌雄蟲體內(nèi)以及單性感染雄蟲與兩性感染合抱雄蟲體內(nèi)的轉(zhuǎn)錄水平，并通過(guò)RNA干擾技術(shù)敲降SjENT3基因的轉(zhuǎn)錄，分析其轉(zhuǎn)錄水平下降對(duì)血吸蟲生長(zhǎng)發(fā)育及生殖能力的影響.

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要試劑

Hieff qPCR SYBR Green Master Mix, Hifair Ⅱ 1st Strand cDNA Synthesis Kit購(gòu)自上海翊圣生物科技有限公司；TRIzol reagent購(gòu)自上海英濰捷基生物公司；siRNA由上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司合成；qRT-PCR引物由上海擎科生物科技有限公司合成.

1.1.2 生物材料

日本血吸蟲中國(guó)大陸株尾蚴由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所釘螺室提供.通過(guò)將陽(yáng)性釘螺暴露在光下可以獲得具有活力的尾蚴.雄性BALB/c小鼠(n=70；年齡: 4～6周)采購(gòu)于上海杰思捷實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司.

1.2 方法

1.2.1 蟲體的收集

BABL/c小鼠以腹部貼片法感染日本血吸蟲[15]，分別在感染后7，14，18，21，25，28，35，42d剖殺，以肝門靜脈灌注法收集蟲體；將感染后18，21，25，28，35，42天的部分合抱雌雄蟲人為分離，分別收集雌蟲與雄蟲蟲體；使用雄性尾蚴感染小鼠，收集18，21，23，25天單性感染雄蟲蟲體.所收集蟲體均用磷酸鹽緩沖液(PBS, pH7.4；137mmol/L NaCl, 2.7mmol/L KCl, 10mmol/L Na2HPO4, 2mmol/L KH2PO4)洗滌3次，除去殘留宿主碎片后凍存于液氮中備用.

1.2.2 SjENT3蛋白的氨基酸序列分析

利用ProtParam工具計(jì)算SjENT3蛋白質(zhì)(TNN11866.1)的理論分子量、等電點(diǎn)以及氨基酸組成.利用SignalP3.0分析蛋白質(zhì)有無(wú)信號(hào)肽；利用TMHMM服務(wù)器分析蛋白有無(wú)跨膜結(jié)構(gòu)；通過(guò)BLAST搜索到SjENT3在小鼠以及人類體內(nèi)的同源蛋白質(zhì)序列(Mouse，NP_076085.1；Humans，NP_060814.4)，通過(guò)DNAMAN軟件對(duì)其進(jìn)行同源性分析.

1.2.3 熒光定量PCR(qRT-PCR)

使用TRIzol從收集的日本血吸蟲中提取總RNA，然后使用PrimeScript RT試劑盒反轉(zhuǎn)錄為cDNA.根據(jù)SjENT3的基因序列(AY814163.1)，利用NCBI Primer BLAST設(shè)計(jì)引物(正向)5’-CACCGACTGATGGTTGGTACA-3’和(反向)5’-AGCAGCGTTCTTTACCACTTG-3’；對(duì)所得的cDNA進(jìn)行qRT-PCR分析，擴(kuò)增產(chǎn)物的大小為80bp；使用NADPH基因作為內(nèi)源性對(duì)照，引物(正向)5’-CGAGGACCTAACAGCAGAGG-3’和(反向)5’-TCCGAACGAACTTTGAGACC-3’，擴(kuò)增產(chǎn)物的大小為174bp；使用ABI PRISM 7500實(shí)時(shí)PCR系統(tǒng)(Applied Biosystems)采用熒光染料法進(jìn)行熒光定量PCR，每個(gè)反應(yīng)均做3孔重復(fù)，使用ABI 7500 V2.0.5軟件分析結(jié)果，用2-ΔΔCt法計(jì)算基因相對(duì)表達(dá)情況.

1.2.4 RNA干擾

上海吉瑪基因有限公司(中國(guó)上海)設(shè)計(jì)并化學(xué)合成了針對(duì)SjENT3基因不同區(qū)域的3種特異性siRNA(S1，S2，S3)和對(duì)照siRNA(NC)(表1).小鼠經(jīng)腹部皮膚感染大約200條日本血吸蟲尾蚴，并分為5組(每組兩只).感染后第22天時(shí)通過(guò)尾靜脈給小鼠注射siRNA(S1，S2，S3和NC)，每次注射2.5nmol siRNA(凍干狀態(tài)的siRNA先用125μL DEPC水溶解)，同時(shí)設(shè)置PBS(pH7.4)對(duì)照，48h后收集蟲體，提取蟲體RNA并反轉(zhuǎn)錄為cDNA后，利用qRT-PCR評(píng)估S1，S2，S3的干擾效果.

表1 SjENT3基因siRNA序列

12只BABL/c小鼠，平均分為3組，每組4只小鼠.于感染后第4天，選擇S1，S2，S3中干擾效果最佳的siRNA，每組小鼠尾靜脈分別注射該siRNA、PBS、NC，每4d干擾一次，共干擾10次，42d后剖殺收集蟲體并計(jì)數(shù)，qRT-PCR檢測(cè)干擾效果.

1.2.5 肝組織蟲卵計(jì)數(shù)

收集肝臟并稱重，加入PBS(pH7.4)，用勻漿機(jī)混勻后，定容至20mL，取1mL肝臟勻漿液，加入等體積10%(密度)NaOH，37℃水浴鍋中消化30min，消化完全后混勻取3份50μL樣品，鏡檢計(jì)數(shù)蟲卵，計(jì)算成蟲數(shù)和每克肝臟荷卵數(shù)及它們對(duì)應(yīng)的減少率.每克肝臟荷卵數(shù)減少率=(對(duì)照組每克肝臟荷卵數(shù)-處理組每克肝臟荷卵數(shù))/對(duì)照組每克肝臟荷卵數(shù)×100%；每雌蟲肝臟荷卵數(shù)=肝臟荷卵數(shù)/雌蟲數(shù)；每雌蟲肝臟荷卵數(shù)減少率=(對(duì)照組每雌蟲肝臟荷卵數(shù)-處理組每雌蟲肝臟荷卵數(shù))/對(duì)照組每雌蟲肝臟荷卵數(shù)×100%.

1.2.6 蟲卵孵化

取4mL肝臟勻漿液于細(xì)頸平底燒瓶中，加入去氯水，并用一薄層棉花覆蓋在液面下5cm處，26℃孵化6h后收集棉花上層清液，轉(zhuǎn)移至15mL離心管中，加入50μL碘酊染液固定毛蚴，4000×g離心5min，吸去上清，定容至2mL，混勻取3份50μL樣品，鏡檢計(jì)數(shù)尾蚴，計(jì)算孵化率和孵化率減少率.孵化率=總毛蚴數(shù)/總蟲卵數(shù)；孵化率減少率=(對(duì)照組孵化率-處理組孵化率)/對(duì)照組孵化率×100%.

1.2.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

數(shù)據(jù)表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差(SD).所有統(tǒng)計(jì)分析經(jīng)過(guò)t-test檢驗(yàn).P≤0.05被認(rèn)為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義.

2 結(jié) 果

2.1 SjENT3蛋白氨基酸序列分析

SjENT3蛋白的理論分子量為63.3kDa，等電點(diǎn)為8.60，具有信號(hào)肽與10個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域，將SjENT3蛋白與小鼠和人類體內(nèi)的同源蛋白序列進(jìn)行氨基酸序列比對(duì)，同源性分別為21.76%、22.09%(圖1，第114頁(yè)).

圖1 SjENT3蛋白質(zhì)序列比對(duì)分析

2.2 qRT-PCR分析SjENT3基因轉(zhuǎn)錄水平分析

使用TRIzol試劑從收集的7，14，18，21，25，28，35，42d日本血吸蟲蟲體中提取總RNA，然后使用Prime Script RT試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄.利用qRT-PCR分析SjENT3基因的轉(zhuǎn)錄水平，結(jié)果表明，SjENT3基因從7d到21d逐漸上升，并在21d達(dá)到最高，之后逐漸下降，在42d降到最低(圖2(a)，第114頁(yè)).將分開(kāi)收集的18，21，25，28，35，42d的曾合抱雌、雄蟲體提取總RNA并反轉(zhuǎn)錄，對(duì)SjENT3基因在其中的轉(zhuǎn)錄水平進(jìn)行qRT-PCR分析，結(jié)果表明，SjENT3基因在各檢測(cè)時(shí)期雄蟲體內(nèi)的轉(zhuǎn)錄水平明顯高于雌蟲，在不同時(shí)間點(diǎn)雄蟲體內(nèi)和雌蟲體內(nèi)的轉(zhuǎn)錄態(tài)勢(shì)和其在不同發(fā)育時(shí)間點(diǎn)蟲體內(nèi)的轉(zhuǎn)錄態(tài)勢(shì)一致(圖2(b)，第114頁(yè)).對(duì)處在不同感染狀態(tài)雄蟲蟲體進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)SjENT3基因在感染后21，23，25d合抱雄蟲體內(nèi)的轉(zhuǎn)錄水平皆顯著高于其在同時(shí)段單性感染雄蟲體內(nèi)的表達(dá)，其在感染后18d兩種感染狀態(tài)蟲體間的轉(zhuǎn)錄水平?jīng)]有顯著性差異(圖2(c)，第114頁(yè)).

圖2 SjENT3基因在日本血吸蟲體內(nèi)轉(zhuǎn)錄水平分析

2.3 SjENT3基因RNA干擾實(shí)驗(yàn)

2.3.1 特異性siRNA對(duì)SjENT3基因轉(zhuǎn)錄水平的影響

通過(guò)小鼠尾靜脈注射不同的siRNA，利用qRT-PCR分析各組中SjENT3相對(duì)內(nèi)參基因SjNADPH的表達(dá)量時(shí)發(fā)現(xiàn)：相對(duì)于PBS組與NC組，S1干擾組轉(zhuǎn)錄水平分別下降64.4%與65.4%；S2干擾組轉(zhuǎn)錄水平分別下降64.7%與65.6%；S3干擾組轉(zhuǎn)錄水平分別下降35.4%與37.1%(圖3(a)).相對(duì)于PBS組與NC組，S2 siRNA長(zhǎng)期干擾組SjENT3基因的轉(zhuǎn)錄水平分別下降75.9%與76.2%(圖3(b)).

圖3 qRT-PCR 檢測(cè)siRNA干擾效果

2.3.2 長(zhǎng)期干擾SjENT3基因的表達(dá)對(duì)血吸蟲生長(zhǎng)、生殖的影響

用干擾效果較好的S2 siRNA對(duì)血吸蟲體內(nèi)SjENT3基因進(jìn)行長(zhǎng)期干擾，對(duì)受干擾蟲體的生存能力和繁殖能力進(jìn)行比較分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn): 相對(duì)于PBS組和NC組，SjENT3基因表達(dá)被長(zhǎng)期干擾會(huì)引起小鼠體內(nèi)成蟲存活能力下降18.07%和24.45%，其產(chǎn)卵引起的每克肝臟荷卵數(shù)下降61.71%和57.47%；雌蟲產(chǎn)卵能力下降57.28%和42.28%，干擾SjENT3基因的轉(zhuǎn)錄水平對(duì)蟲卵的孵化能力沒(méi)有明顯的影響(表2).

表2 長(zhǎng)期干擾SjENT3對(duì)日本血吸蟲存活和繁殖能力的影響

3 討 論

血吸蟲病流行歷史悠久，分布廣泛，危害嚴(yán)重，為人畜共患的重大疫病之一.雖然化學(xué)藥物吡喹酮對(duì)其有良好的治療效果，但其不能預(yù)防重復(fù)感染，且對(duì)童蟲期血吸蟲殺傷效果欠佳[16].日本血吸蟲的終宿主為哺乳類，中間宿主為淡水釘螺[17].日本血吸蟲毛蚴進(jìn)入釘螺體內(nèi)可進(jìn)行大量的無(wú)性繁殖，多批次逸出尾蚴，尾蚴可感染多達(dá)40種哺乳類動(dòng)物，血吸蟲在終末宿主體內(nèi)可存活十?dāng)?shù)年，持續(xù)向外界環(huán)境中釋放蟲卵，造成血吸蟲病的再流行.日本血吸蟲的中間宿主釘螺生命力極強(qiáng)，個(gè)體小、數(shù)量大、繁殖快、難以消滅[17].水資源開(kāi)發(fā)，氣候和環(huán)境變化，人口流動(dòng)都可能導(dǎo)致釘螺滋生地范圍擴(kuò)大，致使血吸蟲病傳播到新的地區(qū)[18]，且到目前為止血吸蟲病尚無(wú)可用疫苗，化療藥物吡喹酮又有導(dǎo)致產(chǎn)生抗藥蟲株的可能，因此亟待開(kāi)發(fā)血吸蟲病防控新途徑.

ENT3蛋白作為核苷類似藥物穿膜的轉(zhuǎn)運(yùn)分子被廣泛應(yīng)用于抗癌和抗病毒治療.我們發(fā)現(xiàn)日本血吸蟲ENT3蛋白與宿主相關(guān)蛋白同源性低，可否根據(jù)此特性篩選治療血吸蟲病的核苷類藥物則值得探討.本研究發(fā)現(xiàn)，隨著血吸蟲的生長(zhǎng)發(fā)育，SjENT3轉(zhuǎn)錄水平逐漸上升，且其在同時(shí)期雄蟲體內(nèi)的含量顯著高于雌蟲，說(shuō)明SjENT3在血吸蟲尤其是雄蟲的生長(zhǎng)發(fā)育中有著重要的作用，可能為滿足其快速生長(zhǎng)需要大量的核苷類物質(zhì)和能量時(shí)提供幫助.前期研究發(fā)現(xiàn)在蛋白水平上，SjENT3在兩性感染雄蟲體內(nèi)表達(dá)量頗高，本研究在轉(zhuǎn)錄水平上分析了SjENT3在兩性感染雄蟲和單性感染雄蟲體內(nèi)的表達(dá)，21，23，25天的結(jié)果與蛋白質(zhì)組學(xué)結(jié)果相符合.

隨著生物科學(xué)技術(shù)的日新月異，出現(xiàn)了多種基因功能研究手段[19]，但目前能應(yīng)用于日本血吸蟲基因功能研究的仍是RNA干擾技術(shù).RNA干擾是基因轉(zhuǎn)錄后的沉默過(guò)程，由雙鏈RNA觸發(fā)，能夠?qū)е峦磎RNA的不穩(wěn)定[20].本研究通過(guò)尾靜脈注射siRNA長(zhǎng)期干擾宿主體內(nèi)日本血吸蟲SjENT3的轉(zhuǎn)錄，發(fā)現(xiàn)SjENT3的低表達(dá)會(huì)影響血吸蟲的生存能力，干擾導(dǎo)致宿主體內(nèi)蟲荷率下降24.44%，干擾SjENT3的表達(dá)還引起雌蟲產(chǎn)卵能力的下降，平均雌蟲產(chǎn)卵能力約下降42.28%，進(jìn)而導(dǎo)致宿主肝臟荷卵數(shù)下降57.47%.我們的研究發(fā)現(xiàn)(表2)：SjENT3不僅在雄蟲體內(nèi)大量表達(dá)，其在雌蟲體內(nèi)也有一定的表達(dá)，且其在兩性感染和單性感染雄蟲體內(nèi)的差異表達(dá)說(shuō)明該蛋白有可能參與血吸蟲雌雄蟲間的合抱、信息和物質(zhì)傳遞等生理過(guò)程.干擾導(dǎo)致雌蟲產(chǎn)卵能力下降可能是由于雌蟲體內(nèi)SjENT3的水平下降，也可能是由于雄蟲體內(nèi)SjENT3水平的大幅度降低，間接影響雌雄蟲間相互作用而導(dǎo)致的.

本研究分析了SjENT3在血吸蟲體內(nèi)的表達(dá)情況，并觀察、統(tǒng)計(jì)分析了該基因沉默對(duì)血吸蟲生長(zhǎng)生殖的影響，結(jié)果初步表明SjENT3基因參與了日本血吸蟲尤其是雄蟲的生長(zhǎng)發(fā)育，并可能與血吸蟲雌雄蟲合抱及其相互間信息傳遞有一定的關(guān)系.