邢 薇 郁歡歡 于鳳祥 劉 洋 李鐵梁 馬志宏 姜 娜 羅 琳

(1.漁業(yè)生物技術(shù)北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 北京市水產(chǎn)科學(xué)研究所, 北京 100068; 2.北京京朝花園農(nóng)業(yè)發(fā)展中心, 北京 100018)

鱘隸屬于硬骨魚綱、鱘形目, 是現(xiàn)存最古老、體型最大的一種魚類, 素有“水中活化石”之稱。鱘肉質(zhì)鮮美, 鱘卵制成的魚子醬更有“黑色黃金”之稱。因其具有生長速度快、營養(yǎng)價(jià)值和經(jīng)濟(jì)價(jià)值高等特點(diǎn), 鱘已成為世界上重要的經(jīng)濟(jì)魚類[1,2]。西伯利亞雜交鱘(Acipenser baeriiBrandt ♀ ×A.schrenckiiBrandt)是以西伯利亞鱘為母本(♀), 施氏鱘為父本()獲得的優(yōu)良雜交品種, 是我國主導(dǎo)的鱘養(yǎng)殖品種[3,4]。

脂肪是魚類的重要能量來源, 飼料配方中脂肪的合理利用不僅能夠節(jié)約蛋白質(zhì), 還能夠降低飼料成本、減少氮的排放。據(jù)了解, 國內(nèi)鱘的商業(yè)飼料主要參考鮭鱒的飼料配方[5]。而鮭鱒為冷水性魚類, 配方中的脂肪含量偏高, 約為20%—30%[6—8]甚至高達(dá)47%[9]。飼料中過高的脂肪水平會給魚類造成多種負(fù)面影響, 如抑制魚類攝食進(jìn)而導(dǎo)致生長遲緩[10—12]、魚體脂肪過度沉積進(jìn)而影響魚類健康和肉品質(zhì)等[13,14]。因此, 明確鱘的脂肪需求, 是其養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)可持續(xù)發(fā)展的必要條件之一。目前, 關(guān)于鱘脂肪需求的研究已有一些報(bào)道。Zhu等[15]用5%、15%和25%三種脂肪含量的飼料投喂俄羅斯鱘(A.gueldenstaedtii)后發(fā)現(xiàn), 當(dāng)飼料中的脂肪含量為25%時(shí), 俄羅斯鱘獲得最優(yōu)生長性能。而劉陽洋等[16]發(fā)現(xiàn), 當(dāng)飼料中脂肪水平為7.88%時(shí), 匙吻鱘[Polyodon spathula, 初始體重(81.38±0.14) g]的SGR達(dá)到最大值。施氏鱘(A.schrenckii)幼魚[初始體重(111.39±14.63) g]的適宜脂肪水平則處于俄羅斯鱘和匙吻鱘之間, 為17%[17]。以上結(jié)果說明, 不同品種的鱘對飼料中脂肪的需求量是不同的。但是目前, 缺乏西伯利亞雜交鱘適宜脂肪水平的相關(guān)報(bào)道。魚油是水產(chǎn)飼料中最重要的脂肪源。與其他動植物油脂相比, 魚油中含有豐富的必需脂肪酸n-3高不飽和脂肪酸(High unsaturated fatty acid, HUFA), 尤其是二十碳五烯酸(EPA)、二十二碳六烯酸(DHA)。本實(shí)驗(yàn)室在前期研究中發(fā)現(xiàn), EPA和DHA在促進(jìn)鱘生長發(fā)育、改善代謝和維持魚類健康等方面有重要作用[18,19]。本研究以魚油為脂肪源, 配制4種脂肪水平分別為5%、10%、15%和20%的等氮飼料, 探究不同脂肪水平對西伯利亞雜交鱘生長性能、飼料消化率、抗氧化及肌肉脂肪酸組成的影響, 以期找到雜交鱘飼料中較為適宜的脂肪添加水平, 從而更好地為雜交鱘的飼料生產(chǎn)提供參考。

1 材料與方法

1.1 飼料配方與制備

本研究以魚粉和豆粕為主要蛋白源, 以魚油為脂肪源, 設(shè)計(jì)粗脂肪含量分別為5%、10%、15%和20%的4種等氮飼料。采用雙螺桿擠壓膨化工藝(MY56X2A, 牧羊集團(tuán), 江蘇, 中國)制成3.0和4.0 mm兩種不同粒徑實(shí)驗(yàn)飼料, 以滿足實(shí)驗(yàn)魚的攝食需要。所有飼料晾干后于-20℃保存?zhèn)溆?。飼料組成及營養(yǎng)水平見表1。飼料中脂肪酸含量見表2。

1.2 實(shí)驗(yàn)魚及養(yǎng)殖條件

本養(yǎng)殖實(shí)驗(yàn)在北京京朝花園農(nóng)業(yè)發(fā)展中心的工廠化循環(huán)水養(yǎng)殖車間進(jìn)行。實(shí)驗(yàn)魚為該中心自行繁育的同批次的統(tǒng)一規(guī)格西伯利亞雜交鱘。在停食24h后, 初始體重為(152.83±0.67) g的實(shí)驗(yàn)魚(25尾/缸)被隨機(jī)的分配到12個(gè)圓柱形玻璃纖維缸(直徑2.0 m, 高0.5 m)中, 每種飼料設(shè)3個(gè)重復(fù), 每天飽食投喂3次(09:30、13:30和17:30), 養(yǎng)殖周期為12周。在養(yǎng)殖過程中, 水溫為(20±1)℃, pH為7.5—8.0, 溶氧在7.0 mg/L左右, 氨氮和亞硝酸鹽含量均低于100.0 μg/L。

1.3 樣品采集

為排除魚體腸道內(nèi)原有糞便對實(shí)驗(yàn)的干擾, 實(shí)驗(yàn)1周后開始收集糞便。因?yàn)轺\為底部攝食, 所以實(shí)驗(yàn)采用平底的圓形玻璃纖維缸, 用泥蟹的方法收集糞便[21]。每次飽食投喂0.5h后人工收集有完整膜包裹著的新鮮糞便。轉(zhuǎn)入小鋁盒內(nèi), 保存于-20℃,以免糞樣分解變質(zhì)。收集滿一盒后置于烘箱75℃下烘干用于檢測干物質(zhì)、蛋白、脂肪及能量的表觀消化率(Apparent digestibility coefficient, ADC)。

表1 飼料組成及營養(yǎng)水平(%風(fēng)干基礎(chǔ))Tab.1 Composition and nutrient levels of the experimental diets(% air-dry basis)

在12周的養(yǎng)殖實(shí)驗(yàn)結(jié)束后, 所有魚饑餓24h。分別對各缸魚稱重并統(tǒng)計(jì)末均重(Final body weight,FBW)、增重率(Weight gain rate,WGR)、特定生長率(Specific growth rate,SGR)及飼料效率(Feed efficiency,FE)。從每個(gè)養(yǎng)殖缸中隨機(jī)取3尾魚, 300 mg/L三氯叔丁醇麻醉后, 用2 mL的一次性注射器從尾靜脈采血, 采集的血樣放入2 mL離心管內(nèi), 1500×g離心5min后取血清并保存于-80℃, 用于抗氧化指標(biāo)和肝臟功能的分析。采完血后, 分別測量體長(Body length,BL)、體重、內(nèi)臟重和肝臟重, 計(jì)算肥滿度(Condition factor,CF)、臟體比(Viscerasoma-tic index,VSI)和肝體比(Hepatosomatic index,HSI),然后剖取肌肉和肝臟樣品, 存于-80℃, 用于肌肉組分、肝臟脂肪含量的檢測。

1.4 化學(xué)分析

所有樣品成分分析參考AOAC[22]描述的方法:水分含量采用直接干燥法(105℃), 粗蛋白含量(N×6.25)采用凱氏定氮法, 粗脂肪含量采用索氏抽提法, 灰分含量采用灰化法(550℃)。飼料和糞便中的三氧化二釔(Y2O3)含量按照田瑩等[23]描述的方法進(jìn)行測定。飼料和肌肉中的脂肪酸含量參照Caballero等[24]描述的方法, 使用安捷倫6890型氣相色譜儀進(jìn)行測定。

1.5 血清生化指標(biāo)

血清樣品用于檢測抗氧化指標(biāo), 包括超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase, SOD)、總抗氧化能力(Total antioxidant capacity, T-AOC)、谷胱甘肽過氧化物酶(Glutathione peroxidase, GSH-Px)和髓過氧化物酶(Myeloperoxidase, MPO); 肝功能指標(biāo), 包括谷丙轉(zhuǎn)氨酶(Alanine aminotransferase, ALT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(Aspartate aminotransferase, AST)、堿性磷酸酶(Alkaline phosphatase, ALP)和乳酸脫氫酶(Lactic dehydrogenase, LDH)。其中SOD、GSHPx和T-AOC試劑盒由南京建成生物工程研究所提供, MPO試劑盒由北京華英生物工程研究所提供。ALT、AST、ALP和LDH試劑盒由德國羅氏診斷有限公司提供。所有指標(biāo)均通過HITACH 7160型生化分析儀進(jìn)行檢測。

1.6 計(jì)算方法和統(tǒng)計(jì)分析

增重率(WGR, %)=100×(Wt-W0)/W0

特定生長率(SGR, %/d)=100×(lnWt-lnW0)/t

飼料效率(FE, %)=100×(Wt-W0)/干飼料消耗量

肥滿度(CF)=100×Wt/L3

臟體比(VSI)=100×Wv/Wt

肝體比(HSI)=100×Wh/Wt

干物質(zhì)表觀消化率(ADCd, %) = 100×[1-(飼料中Y2O3/糞便中Y2O3)]

蛋白質(zhì)表觀消化率(ADCp, %)=100×[1-(飼料中的Y2O3/糞便中的Y2O3)×(糞便中的粗蛋白/飼料中的粗蛋白)]

脂肪表觀消化率(ADCf, %)=100×[1-(飼料中的Y2O3/糞便中的Y2O3)×(糞便中的粗脂肪/飼料中的粗脂肪)]

能量表觀消化率(ADCe, %)=100×[1-(飼料中的Y2O3/糞便中的Y2O3)×(糞便中的粗能量/飼料中的粗能量)]

式中,W0為初重(g);Wt為末重(g);Wv為內(nèi)臟重(g);Wh為肝臟重(g);t為實(shí)驗(yàn)天數(shù)。

結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤(Mean±SE)表示, 使用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS 17.0對數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析(Oneway ANOVA)。差異顯著時(shí)通過Duncan’s檢驗(yàn)進(jìn)行多重比較, 差異顯著性水平為P＜0.05。通過線性回歸和皮爾遜相關(guān)分析得到肌肉中脂肪酸和飼料中脂肪酸含量的相關(guān)性, 顯著相關(guān)值為R2＞0.5。

2 結(jié)果

2.1 不同脂肪水平對雜交鱘生長和形體指標(biāo)的影響

在整個(gè)養(yǎng)殖過程中沒有出現(xiàn)實(shí)驗(yàn)魚死亡的現(xiàn)象, 各組存活率均為100%。從表3可以看出, 飼料中添加不同水平的脂肪, 對雜交鱘幼魚FBW、WGR和SGR均有顯著影響(P＜0.05)。FBW、WGR和SGR隨著脂肪水平的升高呈先升高后降低的趨勢,其中D15組顯著高于其他三組(P＜0.05)。D15組雜交鱘幼魚的FE在四組中最高, 且顯著高于D05和D10組(P＜0.05)。雜交鱘幼魚的BL和CF并未受到飼料脂肪含量的影響(P＞0.05)。VSI和HSI隨著飼料脂肪水平的升高顯著升高, D20組的VSI和HSI顯著高于其他三組(P＜0.05)。

表3 飼料中不同脂肪含量對雜交鱘幼魚生長、形體指標(biāo)的影響(平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤, n=3)Tab.3 Growth performance and morphometric parameters of juvenile hybrid sturgeon fed experimental diets with different lipid levels (Mean±SE, n=3)

2.2 不同脂肪水平對雜交鱘幼魚肌肉組分及肝臟脂肪含量的影響

飼料中不同脂肪水平對雜交鱘幼魚肌肉中水分、粗蛋白和灰分含量無顯著影響(P＞0.05, 表4)。隨著飼料中脂肪含量的升高, 雜交鱘幼魚肌肉和肝臟中的脂肪含量顯著升高(P＜0.05)。當(dāng)飼料脂肪含量為20%時(shí), 其肌肉和肝臟脂肪含量顯著高于D05和D10組(P＜0.05)。

2.3 不同脂肪水平對雜交鱘幼魚飼料消化率的影響

雜交鱘幼魚的ADCd、ADCp分別在76.49%—78.42%和90.99%—91.86%, 且未受飼料脂肪含量的顯著影響(P＞0.05, 表5)。D15組的ADCf和ADCe在各組中數(shù)值最大, 其中, ADCf顯著高于D05組(P＜0.05), ADCe顯著高于D05和D10組(P＜0.05)。

表4 飼料中不同脂肪水平對雜交鱘幼魚肌肉組成和肝臟脂肪含量的影響(平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤, n=3)Tab.4 Fillet proximate compositions and hepatic fat content of juvenile hybrid sturgeon fed experimental diets with different lipid levels (Mean±SE, n=3)

2.4 不同脂肪水平對雜交鱘血清中抗氧化和肝功能指標(biāo)的影響

如表6所示, 隨著飼料中脂肪含量的增加, 雜交鱘幼魚血清中SOD、T-AOC和MPO水平顯著升高(P＜0.05)。其中, D20組的SOD水平顯著高于其他三組(P＜0.05); D20組的MPO水平顯著高于D05和D10組(P＜0.05), 但與D15組相比, 差異不顯著(P＞0.05)。血清GSH-Px水平隨著飼料脂肪含量的升高顯著降低, 且D15組GSH-Px顯著低于D05和D10組(P＜0.05), 而與D20組差異不顯著(P＞0.05)。

隨著飼料脂肪含量的增加, 雜交鱘幼魚血清中ALT、AST、ALP和LDH的含量隨之顯著升高(P＜0.05)。其中D20組雜交鱘幼魚血漿ALT、AST、ALP和LDH含量顯著高于脂肪含量為5%的D05組(P＜0.05, 表6)。

表5 飼料中不同脂肪水平對雜交鱘幼魚表觀消化率的影響(平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤, n=3)Tab.5 ADC of dry matter, protein, fat and energy of juvenile hybrid sturgeon fed experimental diets with different lipid levels(Mean±SE, n=3)

表6 飼料中不同脂肪含量對雜交鱘血清中抗氧化指標(biāo)和肝臟功能的影響(平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤, n=3)Tab.6 Serum antioxidant parameters and liver functions of juvenile hybrid sturgeon fed experimental diets with different lipid levels (Mean±SE, n=3)

2.5 不同脂肪水平對雜交鱘幼魚肌肉脂肪酸含量的影響

由表7可見, 隨著飼料脂肪水平的升高, 雜交鱘幼魚肌肉中飽和脂肪酸(∑MUFA)、單不飽和脂肪酸(∑MUFA)和多不飽和脂肪酸(∑PUFA)的含量也隨之顯著升高(P＜0.05)。雜交鱘幼魚肌肉中各脂肪酸含量與飼料中脂肪酸含量呈顯著的線性正相關(guān)(R2＞0.92, 表8)。

3 討論

3.1 飼料脂肪水平對雜交鱘幼魚生長性能的影響

本研究結(jié)果顯示, 飼料脂肪含量從5%增加到15%時(shí), 雜交鱘幼魚的生長性能顯著提高, 而當(dāng)飼料中的脂肪含量從15%增加到20%時(shí), 雜交鱘幼魚的生長性能有所下降。這一結(jié)果與已有的研究結(jié)果相吻合[25—29]。魚類對于脂肪具有較好的利用能力, 飼料中添加適量脂肪, 能夠起到減少蛋白質(zhì)分解供能, 增加蛋白質(zhì)沉積的作用, 這是隨飼料中脂肪含量增加(5%—15%), 雜交鱘幼魚生長性能顯著提高的主要原因。但是, 飼料脂肪含量不是越高越好, 當(dāng)飼料中的脂肪含量超過最適含量后, 魚類的生長性能反而下降。研究表明, 俄羅斯鱘[30]、黃姑魚(Nibea japonica)[31]、雜交羅非魚(Oreochromis niloticus×O.aureus)[32]、亞東鮭(Salmo trutta)[33]等攝入脂肪水平偏高的飼料時(shí), 其生長速度會減慢,飼料效率降低。而且當(dāng)飼料中脂肪含量過高, 還會造成魚體肝臟、肌肉和腹腔等部位的脂肪過量沉積[32], 嚴(yán)重時(shí)會誘發(fā)脂肪肝等代謝性疾病。本研究發(fā)現(xiàn), 當(dāng)飼料中的脂肪含量為20%時(shí), 肝臟中的脂肪顯著蓄積, 臟體比、肝體比顯著上升, 抗氧化及肝臟功能相關(guān)酶活顯著上升, 機(jī)體代謝異常是高脂飼料導(dǎo)致雜交鱘幼魚生長性能下降的主要原因之一[25, 26, 34, 35]。

表7 飼料中不同脂肪水平對雜交鱘幼魚肌肉脂肪酸含量的影響(g/100 g肌肉, 平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤, n=3)Tab.7 Fatty acid content in fillets of juvenile hybrid sturgeon fed experimental diets with different lipid levels (g/100 g fillet, Mean±SE, n=3)

表8 肌肉和飼料中脂肪酸含量相關(guān)性分析Tab.8 Correlation coefficients (R2) and P values of fatty acid concentrations in fillets vs.dietary fatty acid concentrations

蛋能比(P/E)在魚類飼料中扮演著重要的角色,蛋能比過高會造成蛋白質(zhì)的浪費(fèi), 過低則會造成脂肪代謝異常, 生長受到抑制[13,36]。對于大多數(shù)魚類而言, 最適的蛋能比為20—25 mg/kJ[37—39]。Mohseni等[40]的研究指出俄羅斯鱘的最適P/E為22 mg/kJ, 波斯鱘(A.persicus)的最適P/E為18—20 mg/kJ, 歐洲鰉(Huso huso)的最適P/E為21—23 mg/kJ。Médale等[41]也認(rèn)為當(dāng)P/E比為20—22 mg/kJ時(shí)對俄羅斯鱘的生長更為有利。在本研究中, D15組的生長性能和FE在所有實(shí)驗(yàn)組中是最優(yōu)的, 說明對于西伯利亞雜交鱘幼魚而言, P/E在23.54 mg/kJ左右比較適宜。

3.2 飼料脂肪水平對雜交鱘幼魚血清中抗氧化和肝功能指標(biāo)的影響

ALT、AST、ALP和LDH是指示肝功能的重要指標(biāo)。Wells等[42]的研究指出, 血清中ALT、AST和ALP水平升高可能是肝損傷或肝功能障礙的信號。LDH是用來檢測組織障礙和幫助診斷組織損傷的指標(biāo)[43,44], 其水平升高可能是由于細(xì)胞損傷而導(dǎo)致的肝臟病變和壞死[45,46]。在本研究中, ALT、AST、ALP和LDH在D20組中都是最高的, 說明飼料中過高的脂肪水平引起雜交鱘幼魚肝臟功能受損。

在正常的營養(yǎng)代謝過程中會產(chǎn)生大量的活性氧(Reactive oxygen species, ROS)。機(jī)體抗氧化系統(tǒng)通過清除過量ROS, 維持氧化與抗氧化的動態(tài)平衡, 保護(hù)組織和細(xì)胞免受氧化應(yīng)激損傷[47]?？寡趸到y(tǒng)分為酶與非酶抗氧化系統(tǒng)。SOD和GSH-Px是機(jī)體抗氧化酶系統(tǒng)的主要成員, 而T-AOC反映機(jī)體的總抗氧化水平。本研究發(fā)現(xiàn), D20組雜交鱘幼魚血清中SOD、T-AOC的含量顯著升高, 提示當(dāng)飼料中脂肪水平達(dá)到20%時(shí), 雜交鱘幼魚發(fā)生氧化應(yīng)激。魚油是飼料中n-3 HUFA的主要來源, 隨著魚油含量的增加, 飼料中的HUFA含量顯著上升。而HUFA是機(jī)體發(fā)生脂質(zhì)過氧化的主要來源。HUFA的含量越高, 機(jī)體發(fā)生過氧化的概率也就越大[48]。因此, 抵制體內(nèi)脂質(zhì)過氧化的發(fā)生, 是D20組SOD酶被顯著激活, T-AOC含量顯著增加的主要原因[49]。GSH-Px在抗過氧化的所有酶中, 效果是最顯著的[50]。通過促進(jìn)谷胱甘肽與過氧化氫反應(yīng), GSH-Px能夠有效減少脂質(zhì)過氧化對魚體的損傷[51]。在本實(shí)驗(yàn)中, D15和D20組血清GSH-Px的活性顯著低于D05和D10組, 說明飼料中脂肪含量過高會降低機(jī)體的抗氧化能力。MPO主要存在于中性粒細(xì)胞和單核細(xì)胞中, 能夠催化過氧化氫和氯離子產(chǎn)生次氯酸。臨床上認(rèn)為, MPO的激活主要與炎癥等有關(guān)[52,53]。在本研究中, MPO水平隨著飼料中脂肪含量的增加而升高, 并在D20組中達(dá)到最高, 說明飼料中高水平脂肪可能有增加機(jī)體炎癥反應(yīng)的風(fēng)險(xiǎn)。

3.3 飼料脂肪水平對雜交鱘幼魚肌肉脂肪酸含量的影響

Xu等[54]研究發(fā)現(xiàn)白鱘肌肉中的脂肪酸組成, 特別是n-3 HUFA, 顯著受飼料中脂肪酸組成的影響。Xu和Hung[55]也指出, 白鱘肌肉中的脂肪酸組成與飼料中的脂肪酸組成高度一致。相似的結(jié)果在納氏鱘中也得到了驗(yàn)證, Vaccaro等[56]發(fā)現(xiàn)納氏鱘肌肉中C16∶0、C18∶1n9、C20∶5n3和C22∶6n3的含量與飼料中該四種脂肪酸含量顯著一致。本實(shí)驗(yàn)的研究結(jié)果也顯示, 雜交鱘幼魚肌肉中的各脂肪酸含量與飼料中脂肪酸含量呈顯著的線性正相關(guān)(R2＞0.90)。以上結(jié)果說明, 鱘肌肉中脂肪酸組成和含量與飼料中脂肪酸組成和含量高度相關(guān)。

4 結(jié)論

本研究結(jié)果表明, 當(dāng)飼料中脂肪含量從5%增加到15%時(shí), 雜交鱘幼魚的生長性能顯著提高, 而當(dāng)飼料中的脂肪含量從15%增加到20%時(shí), 雜交鱘幼魚的生長性能顯著下降。隨著飼料中脂肪水平的升高, 雜交鱘幼魚臟體比、肝體比及肌肉、肝臟中的脂肪含量顯著上升, 機(jī)體過氧化壓力增大, 肝損傷風(fēng)險(xiǎn)增加。雜交鱘幼魚肌肉中的各脂肪酸含量與飼料中脂肪酸含量呈顯著的線性正相關(guān)。綜合各指標(biāo)因素分析, 雜交鱘適宜脂肪水平為15%,P/E為23.54 mg/kJ。