鄭 爽，何麗清

（山西中醫(yī)藥大學(xué)，山西 晉中 030619）

小青龍湯方出自東漢張仲景《傷寒雜病論》第40 條“傷寒表不解，心下有水氣，干嘔，發(fā)熱而咳，或渴，或利，或噎，或小便不利、少腹?jié)M，或喘者，小青龍湯主之”和第41 條“傷寒，心下有水氣，咳而微喘，發(fā)熱不渴，服湯已，渴者，此寒去欲解也，小青龍湯主之”［1］。藥物組成為麻黃、生姜、桂枝、芍藥、細(xì)辛、半夏、五味子、甘草，主治外寒內(nèi)飲證，臨床上以治療肺系疾病為主。PI3K/Akt/mTOR 信號通路參與細(xì)胞增殖、凋亡與自噬的調(diào)控，影響許多呼吸系統(tǒng)疾病的預(yù)后與轉(zhuǎn)歸［2-3］。本研究觀察不同劑量小青龍湯對于小青龍湯證大鼠模型肺組織中PI3K、Akt、mTOR mRNA 表達(dá)的影響，為進(jìn)一步探究小青龍湯證的證候?qū)嵸|(zhì)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動物 雄性Wistar 大鼠24 只，體質(zhì)量（220±20）g，購于斯貝福（北京）生物技術(shù)有限公司，許可證號：SCXK（京）2016-0002。飼養(yǎng)于普通動物房，飼養(yǎng)環(huán)境溫度和濕度良好。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)儀器 BIO-RADCFX96 Touch 定量PCR儀、C1000 Touch PCR 儀，美國伯樂（BIO-RAD）公司；NanoDropTMOne 微量紫外-可見光分光光度計，美國賽默飛世爾科技公司。

1.1.3 藥物與試劑 小青龍湯方藥，由山西中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院藥房提供。RNA 提取試劑盒（DP431），購自天根生化科技（北京）有限公司；PCR 擴(kuò)增和反轉(zhuǎn)錄試劑盒，購自寶日醫(yī)生物技術(shù)（北京）有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 動物分組 造模大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1 周后，按體質(zhì)量隨機(jī)分為空白組、模型組、小青龍湯高劑量組和小青龍湯低劑量組4 組，每組6 只。除空白組外，其余各組制作小青龍湯證模型［4-7］。大鼠于室內(nèi)溫度10 ℃左右的寒冷環(huán)境中喂養(yǎng)，每日在（0±4）℃的低溫環(huán)境下冷凍1 h，并讓大鼠在冷水中游泳至水面淹沒鼻尖時撈出，持續(xù)4 周。造模期間給與冷凍飼料及冰水（寒涼飲食）喂養(yǎng)。若大鼠出現(xiàn)咳嗽、呼吸急促、喘息、打噴嚏、飲食減少、反應(yīng)遲鈍、行動遲緩、愛扎堆、立毛、拱背、蜷曲等情況，則造模成功。

1.2.2 藥物干預(yù)與取材 造模成功后，高、低劑量組大鼠每天按1 mL/100 g 體質(zhì)量小青龍湯灌胃，連續(xù)灌胃15 d，大鼠的給藥劑量按照《藥理實(shí)驗(yàn)方法學(xué)》［8］人和動物間按體表面積折算的等效劑量比值計算，高、低劑量組給藥量為折算后大鼠等效劑量的2 倍和1/2，藥物濃度分別為0.16 g/mL 和0.04 g/mL，空白組和模型組大鼠灌服生理鹽水，連續(xù)灌胃15 d 。大鼠末次灌胃1 h 后，10%水合氯醛腹腔注射麻醉，開胸取出肺組織，使用生理鹽水沖洗后保存于-80 ℃冰箱。

1.2.3 RT-qPCR 法檢測大鼠肺組織中PI3K、Akt、mTOR mRNA 的表達(dá) 按照RNA 提取試劑盒說明書的操作步驟提取肺組織RNA 后，檢測樣本RNA 濃度，根據(jù)濃度按說明書比例配置RNA 模板，每份20 μL。以37 ℃，15 min；85 ℃，5 s；4 ℃條件進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。PCR 反應(yīng)體系：10 μL SYBR Premix，1 μL 上游引物，1 μL 下游引物，2 μL cDNA 溶液，6 μL dH2O。PCR 擴(kuò)增使用兩步法：95 ℃，30 s，1 次；95 ℃，5 s，退火60 ℃，30 s，40 次。PCR以β-actin 為內(nèi)參，實(shí)驗(yàn)結(jié)束后記錄各個樣品Ct值，以相對定量分析法2-ΔΔCt進(jìn)行分析。PI3K、Akt、mTOR、β-actin 所用引物序列及長度如表1。

表1 RT-qPCR 檢測引物序列

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

經(jīng)SPSS 21.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計處理，若數(shù)據(jù)滿足正態(tài)分布和方差齊性，以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，采用單因素方差分析進(jìn)行統(tǒng)計；若不服從正態(tài)分布和方差齊性，以Md（P25，P75）表示，采用非參數(shù)檢驗(yàn)中的Kruskal-Wallis 檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 大鼠一般情況

造模過程中，模型組死亡1 只，其余各組造模成功。造模各組大鼠均出現(xiàn)咳嗽、呼吸急促、喘息、打噴嚏、飲食減少、反應(yīng)遲鈍、行動遲緩、愛扎堆、立毛、拱背、蜷曲等情況。與空白組比較，模型組與小青龍湯治療組大鼠體質(zhì)量在造模后增加不明顯，甚至出現(xiàn)負(fù)增長（P＜0.01）。經(jīng)過藥物干預(yù)治療后，與空白組比較，模型組大鼠質(zhì)量增長仍不明顯（P＜0.05）；與模型組比較，小青龍湯高、低劑量組大鼠體質(zhì)量明顯增加（P＜0.01）。結(jié)果見表2。

表2 小青龍湯對各組大鼠體質(zhì)量的影響（g，）

表2 小青龍湯對各組大鼠體質(zhì)量的影響（g，）

注：與空白組比較，1）P＜0.01；與模型組比較，2）P＜0.01

2.2 各組PI3K、Akt、mTOR mRNA相對表達(dá)量比較與空白組比較，模型組PI3K、Akt、mTOR mRNA 相對表達(dá)升高（P＜0.05）。與模型組比較，小青龍湯高劑量組PI3K、Akt、mTOR mRNA 相對表達(dá)降低（P＜0.05，P＜0.01），小青龍湯低劑量組PI3K、Akt、mTOR mRNA 相對表達(dá)降低，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。結(jié)果見表3。

表3 各組大鼠肺組織中PI3K、Akt、mTOR mRNA 相對表達(dá)量Md（P25，P75）

3 討論

小青龍湯是臨床上治療外寒內(nèi)飲的常用方劑，在抗炎、平喘、抗過敏等方面效果顯著，能夠改善肺部通氣狀況、干預(yù)氣道重塑。關(guān)于小青龍湯治療支氣管哮喘和變應(yīng)性鼻炎等肺系疾病的文獻(xiàn)報道有很多［9-10］，但對小青龍湯證這一外寒內(nèi)飲證的發(fā)生發(fā)展缺乏分子生物學(xué)基礎(chǔ)的研究和探討。前期我們已經(jīng)運(yùn)用數(shù)據(jù)挖掘技術(shù)研究古今小青龍湯相關(guān)醫(yī)案，深入分析小青龍湯證的本質(zhì)［11］，運(yùn)用NMR、GC-MS、LC-MS 3 種代謝組學(xué)技術(shù)檢測小青龍湯證的特征小分子代謝物，發(fā)現(xiàn)小青龍湯的作用機(jī)制與能量代謝、免疫調(diào)節(jié)和減輕炎癥反應(yīng)相關(guān)［12］。故本次實(shí)驗(yàn)基于PI3K/Akt/mTOR 信號通路，研究小青龍湯對于小青龍湯證大鼠模型肺組織PI3K、Akt、mTOR mRNA 表達(dá)的影響，進(jìn)一步探究小青龍湯證候?qū)嵸|(zhì)。

PI3K/Akt/mTOR 信號通路是人體的經(jīng)典信號通路之一。PI3K 是一種存在于細(xì)胞質(zhì)中的脂類激酶，能夠磷酸化磷脂酰肌醇D3 位。Akt 是PI3K 下游的關(guān)鍵蛋白，是一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶［13］。mTOR 屬于PIKK（磷脂酰肌醇3 激酶）激酶家族，由mTORC1 和mTORC2 復(fù)合體組成。PI3K 受到上游生長因子等刺激而激活，磷酸化合成PIP3（三磷酸肌醇），PIP3 結(jié)合Akt 并激活PDK1（磷酸肌醇依賴酶），PDK1 改變Akt 的蛋白結(jié)構(gòu)，使Akt磷酸化并被激活，激活后的Akt 會直接或者間接活化其下游的mTORC1 和mTORC2 復(fù)合體，進(jìn)而作用于mTOR 的下游底物，影響到微管組織的解聚、脂肪蛋白質(zhì)合成與分解、細(xì)胞自噬和凋亡及肌動蛋白細(xì)胞骨架的調(diào)節(jié)等。有研究表明，抑制PI3K/Akt/mTOR 信號通路的表達(dá)可以降低肺部炎性反應(yīng)的發(fā)生［14-15］，調(diào)控肺部上皮細(xì)胞自噬［16］。通過影響PI3K 的表達(dá)，抑制Akt 和mTOR 的磷酸化水平，減輕炎癥，影響氣道重塑［17-18］。PI3K/Akt/mTOR 信號通路在免疫調(diào)節(jié)［19］、能量代謝［20］、減輕炎癥反應(yīng)［21］等方面均起到調(diào)節(jié)作用。這與我們前期對于小青龍湯證證候?qū)嵸|(zhì)的研究結(jié)果相吻合。

本次實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，造模后空白組大鼠體質(zhì)量顯著升高，其余各組體質(zhì)量較造模前增加不明顯，甚至減輕，提示大鼠在造模過程中，因感受外邪，內(nèi)有水濕，正氣受損，結(jié)合大鼠一般情況表明小青龍湯證大鼠造模成功。經(jīng)小青龍湯治療后，除模型組外，其余各組大鼠體質(zhì)量均顯著升高，表明小青龍湯治療后機(jī)體有所恢復(fù)。與空白組比較，模型組PI3K、Akt、mTOR mRNA 相對表達(dá)量均升高，表明小青龍湯證發(fā)生發(fā)展與PI3K、Akt、mTOR mRNA 的表達(dá)上調(diào)相關(guān)。與模型組比較，高劑量組大鼠肺組織中PI3K、Akt、mTOR mRNA 相對表達(dá)量明顯下降，表明小青龍湯高劑量治療效果明顯，其作用機(jī)制與其能夠下調(diào)PI3K、Akt、mTOR mRNA 的相對表達(dá)量有關(guān)。

綜上所述，小青龍湯證的發(fā)生發(fā)展與PI3K、Akt、mTOR mRNA 的上調(diào)相關(guān)，小青龍湯治療機(jī)制與其能夠下調(diào)PI3K、Akt、mTOR mRNA 的相對表達(dá)量有關(guān)。但本研究只是初步驗(yàn)證了小青龍湯對于PI3K/Akt/mTOR 信號通路的調(diào)節(jié)作用，由于中藥多通路多靶點(diǎn)的特點(diǎn)，下游靶蛋白尚未明確，是否與其他信號通路協(xié)同作用，有待更進(jìn)一步的研究。