金 晶，皮先明，余新健，白書仙，毛慧芳，張 波

皮膚鱗狀細胞癌(cutaneous squamous cell carcinoma, CSCC)起源于表皮膠質(zhì)形成細胞，是我國常見的皮膚惡性腫瘤之一，發(fā)病率呈逐年增長的趨勢[1]。目前，CSCC的發(fā)病機制尚不清楚，可能與慢性炎癥、化學(xué)致癌物、微生物感染等有關(guān)[2]。明確CSCC的發(fā)生、發(fā)展機制，尋找關(guān)鍵調(diào)控作用分子，對CSCC的診斷和治療具有重要意義。長鏈非編碼RNA(long-chain non-coding RNA, lncRNA)是一種轉(zhuǎn)錄本長度大于200個核苷酸的內(nèi)源性RNA，自身不具有編碼蛋白質(zhì)的功能[3]。lncRNA可通過多種方式調(diào)控特定基因的表達，在人體多種疾病包括腫瘤的進程中發(fā)揮重要作用[4-5]。COLCA1是新近發(fā)現(xiàn)的lncRNA，研究顯示COLCA1在乳腺癌組織中低表達，COLCA1表達越低，乳腺癌患者的生存期越短[6]。COLCA1在CSCC組織中的表達及對腫瘤發(fā)生、發(fā)展的影響，目前尚未見報道。本文檢測COLCA1在CSCC組織和細胞系中的表達，觀察過表達COLCA1對CSCC細胞增殖和遷移的影響，應(yīng)用生物信息學(xué)法探討其發(fā)揮作用的潛在分子機制。

1 材料與方法

1.1 臨床資料收集2018年2月～2019年12月我院行手術(shù)切除的CSCC組織37例，標本在液氮中保存并經(jīng)病理檢查確診。男性20例，女性17例，平均年齡(52.93±9.57)歲；原位鱗狀細胞癌9例，高分化鱗狀細胞癌12例，中分化鱗狀細胞癌16例。選取同期行整形外科手術(shù)的正常人皮膚組織37例作為對照。本實驗經(jīng)我院倫理委員會同意，患者均簽署知情同意書。

1.2 細胞與主要試劑CSCC細胞系(HSC-2、SCL-12、Colo-16、A431、SCL-1)和人角質(zhì)形成細胞系(HaCaT)，均購自中國科學(xué)院上海生命科學(xué)院細胞資源中心。COLCA1過表達質(zhì)粒和空白質(zhì)粒，均購自上海吉瑪基因公司。RPMI 1640培養(yǎng)基、胎牛血清(FBS)、DMEM培養(yǎng)基，均購自美國Gibco公司。轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine 3000購自美國Invitrogen公司。qRT-PCR和Trizol試劑，均購自北京天根生化公司。ECL試劑購自美國Thermo公司。噻唑藍(methyl thiazol tetrazolium，MTT)和二甲基亞砜，均購自美國Sigma公司。一、二抗均購自英國Abcam公司。

1.3 細胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染HSC-2、Colo-16、A431細胞采用含10% FBS的RPMI 1640培養(yǎng)基培養(yǎng)，SCL-12、SCL-1、HaCaT采用含10% FBS的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)，置于37 ℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中。將處于對數(shù)生長期的A431細胞接種于6孔板中，當細胞密度達50%時，通過Lipofectamine 3000轉(zhuǎn)染空白質(zhì)粒(對照組)和COLCA1過表達質(zhì)粒(實驗組)至A431細胞，具體操作步驟嚴格按照轉(zhuǎn)染試劑盒說明書進行。12 h后更換新鮮培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。

1.4 RNA提取和qPCR檢測通過Trizol試劑裂解并提取組織和細胞系總RNA，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。按照qRT-PCR試劑盒說明書配制反應(yīng)體系，反應(yīng)條件為95 ℃預(yù)變性10 min、62 ℃ 30 s、72 ℃ 30 s，合計40個循環(huán)。熒光值采用2-ΔΔCt方法計算。以GAPDH為內(nèi)參檢測COLCA1和FAM172A mRNA的表達，以U6為內(nèi)參檢測miR-423-5p的表達。COLCA1上游引物：5′-CAGCAGCAGGGACTCAGC-3′，下游引物：5′-AGCCGGATGCTTTGTGAA-3′；U6上游引物：5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′，下游引物：5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′；GAPDH上游引物：5′-ACAACTTTGGTATCGTGGAAGG-3′，下游引物：5′-GCCATCACGCCACAGTTTC-3′；miR-423-5p上游引物：5′-GGTCGCTCTCTGCCCCTCA-3′，下游引物：5′-CAGTGCGTGTCGTGGAGT-3′；FAM172A上游引物：5′-CGACTGGCGAACTGGAAG-3′，下游引物：5′-GAGCTCAAGGAAATAGACATCAATC-3′。

1.5 MTT檢測A431細胞增殖A431細胞轉(zhuǎn)染48 h后，胰酶消化并制備單細胞懸液，以4×103個/孔細胞密度接種于96孔板中，每組4個復(fù)孔，分別培養(yǎng)1、2、3、4、5天。每天進行MTT檢測，每孔加入10 μL濃度為2.5 g/L的MTT試劑，培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 h，每孔加入200 μL二甲基亞砜，水平振蕩器振蕩20 min，酶標儀讀取每孔在450 nm波長處光密度(OD)值，繪制A431細胞生長曲線。

1.6 細胞劃痕實驗檢測A431細胞遷移A431細胞轉(zhuǎn)染48 h后，胰酶消化并制備單細胞懸液，以8×105個/孔細胞密度接種于6孔板中，每組4個復(fù)孔。待A431細胞貼壁后，使用10 μL移液槍槍頭在6孔板底部劃痕，用PBS沖洗3次，加入無血清RPMI 1640培養(yǎng)基，在倒置顯微鏡下(100×)拍照并記錄細胞劃痕寬度W1。培養(yǎng)24 h后，在倒置顯微鏡下(100×)拍照并記錄細胞劃痕寬度W2，細胞遷移率代表細胞遷移能力，遷移率=(W1-W2)/W1×100%。

1.7 生物信息學(xué)法預(yù)測COLCA1潛在分子機制采用LncBase Predicted v.2在線數(shù)據(jù)庫預(yù)測COLCA1可能互補結(jié)合的miRNA，采用miRNA Map在線數(shù)據(jù)庫預(yù)測miRNA可能互補結(jié)合的mRNA。

1.8 Western blot實驗檢測FAM172A蛋白的表達A431細胞轉(zhuǎn)染48 h后，胰酶消化收集細胞，提取細胞總蛋白，取等量蛋白進行SDS-PAGE電泳，將蛋白轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜，采用5%脫脂奶粉封閉液在室溫封閉2 h，稀釋一抗FAM172A(1 ∶1 000稀釋)、Notch1(1 ∶2 000稀釋)、Hes1(1 ∶1 000稀釋)、Cyclin D1(1 ∶3 000)、C-myc(1 ∶3 000)及α-Tubulin(1 ∶1 000)，一抗在4 ℃下孵育過夜。加入二抗稀釋液，在室溫下?lián)u床孵育2 h，滴加ECL試劑曝光、顯影。

2 結(jié)果

2.1 CSCC組織和細胞系中COLCA1的表達qRT-PCR檢測結(jié)果顯示，COLCA1在37例CSCC組織與37例正常皮膚組織中的表達量分別為5.71±0.78和1.01±0.20，COLCA1在CSCC組織中呈低表達(P<0.01，圖1)；COLCA1在CSCC細胞系(HSC-2、SCL-12、Colo-16、A431、SCL-1)和人角質(zhì)形成細胞系(HaCaT)中的表達量分別為0.64±0.07、0.39±0.03、0.16±0.05、0.77±0.03、0.56±0.07和1.00±0.01，COLCA1在CSCC細胞系中呈低表達(P均<0.01)，A431細胞中COLCA1的表達最低(P<0.01，圖2)。

圖1 正常皮膚和皮膚鱗狀細胞癌組織中COLCA1的表達

圖2 皮膚鱗狀細胞癌細胞系和人角質(zhì)形成細胞中COLCA1的表達

2.2 轉(zhuǎn)染COLCA1過表達質(zhì)粒對A431細胞中COLCA1表達的影響轉(zhuǎn)染COLCA1過表達質(zhì)粒后，qRT-PCR檢測對照組和實驗組A431細胞中COLCA1表達量分別為1.00 ± 0.04和9.31 ± 0.99，結(jié)果顯示，實驗組中COLCA1表達高于對照組(P<0.01，圖3)。

圖3 COLCA1在對照組和實驗組的A431細胞中的表達

2.3 過表達COLCA1對A431細胞增殖的影響MTT檢測顯示，在第2、3、4、5天實驗組A431細胞的OD值與對照組相比，其表達下調(diào)(P<0.05、P<0.05、P<0.01、P<0.01)；提示過表達COLCA1可抑制A431細胞的增殖(圖4)。

2.4 過表達COLCA1對A431細胞遷移的影響細胞劃痕實驗顯示，實驗組和對照組中A431細胞遷移率分別為(27.69±2.15)%和(61.84±6.32)%，實驗組中細胞遷移率低于對照組(P<0.01，圖5)；提示過表達COLCA1可抑制A431細胞的遷移。

圖5 A.過表達COLCA1對A431細胞遷移的影響；B.直方圖統(tǒng)計分析

2.5 生物信息學(xué)法預(yù)測COLCA1潛在分子機制采用LncBase Predicted v.2在線數(shù)據(jù)庫預(yù)測COLCA1可能與miR-423-5p互補結(jié)合，采用miRNA Map在線數(shù)據(jù)庫預(yù)測miR-423-5p可能與FAM172A mRNA互補結(jié)合(圖6)。

圖6 生物信息學(xué)方法預(yù)測COLCA1潛在分子機制

2.6 過表達COLCA1對A431細胞中miR-423-5p和FAM172A mRNA表達的影響qRT-PCR檢測顯示，對照組和實驗組的A431細胞中miR-423-5p表達量分別為1.00 ± 0.05和0.20±0.05，實驗組中miR-423-5p表達低于對照組(P<0.01，圖7)。對照組和實驗組的A431細胞中FAM172A mRNA表達量分別為1.00±0.02和5.11±0.79，實驗組中FAM172A mRNA表達高于對照組(P<0.01)；提示過表達COLCA1可下調(diào)miR-423-5p mRNA的表達，上調(diào)FAM172A mRNA的表達。

圖7 miR-423-5p(A)和FAM172A mRNA(B)在對照組和實驗組A431細胞中的表達

2.7 過表達COLCA1對FAM172A蛋白表達的影響Western blot檢測顯示，過表達COLCA1后，F(xiàn)AM172A蛋白表達上調(diào)，Notch信號通路蛋白如Notch1、Hes1、Cyclin D1及C-myc蛋白表達下調(diào)，Notch信號通路活化被抑制(圖8)。

3 討論

近年越來越多的研究證實lncRNA廣泛參與細胞分化、發(fā)育、增殖、凋亡、轉(zhuǎn)移、衰老等各種生理和病理過程[7-8]。lncRNA在絕大多數(shù)腫瘤中均異常表達，可作為抑癌基因或原癌基因調(diào)控腫瘤的發(fā)生、發(fā)展[9-11]。隨著新一代測序技術(shù)的不斷發(fā)展，發(fā)現(xiàn)越來越多的lncRNA與CSCC的惡性表型有關(guān)[12]。lncRNA LINC00520在CSCC組織中表達下調(diào)，LINC00520可通過干擾PI3K/Akt信號通路的活化，抑制CSCC的進展[13]。lncRNA PRECSIT在CSCC組織和細胞系中均呈低表達，PRECSIT可被p53蛋白負向調(diào)控，沉默PRECSIT可抑制CSCC細胞在體內(nèi)和體外的生長和轉(zhuǎn)移[14]。COLCA1是新發(fā)現(xiàn)的lncRNA，其在乳腺癌中異常低表達，與乳腺癌患者的預(yù)后相關(guān)，提示其在腫瘤發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮抑癌基因作用[6]。目前，COLCA1在CSCC中的生理功能和分子機制尚不清楚。

圖8 過表達COLCA1對A431細胞FAM172A蛋白表達的影響

本組qRT-PCR檢測顯示，COLCA1在CSCC組織和細胞系中表達下調(diào)，提示COLCA1可能參與調(diào)控CSCC的發(fā)生、發(fā)展。MTT法和細胞劃痕實驗顯示，過表達COLCA1可抑制A431細胞的增殖和遷移。lncRNA可作為競爭性內(nèi)源性RNA與特定miRNA互補結(jié)合，抑制miRNA對其靶基因的干擾作用，進而促進miRNA靶基因的表達[15]。生物信息法顯示，COLCA1可能與miR-423-5p互補結(jié)合，miR-423-5p可能與FAM172A mRNA互補結(jié)合。miR-423-5p在膠質(zhì)瘤、胃癌、前列腺癌等腫瘤中表達上調(diào)，miR-423-5p可促進腫瘤細胞的增殖、遷移、侵襲、血管生長，與腫瘤的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)，可作為患者不良預(yù)后的獨立指標[16-17]。qRT-PCR檢測顯示，過表達COLCA1可抑制miR-423-5p的表達，COLCA1可能作為競爭性內(nèi)源性RNA與miR-423-5p互補結(jié)合。FAM172A基因位于染色體5q15，是一類抑癌基因[18]。FAM172A在胰腺癌、結(jié)直腸癌等腫瘤中表達下調(diào)，F(xiàn)AM172A表達水平與腫瘤大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、臨床分期、預(yù)后呈負相關(guān)[19]。過表達FAM172A蛋白可抑制腫瘤細胞的增殖、遷移、侵襲，沉默F(xiàn)AM172A蛋白表達可促進腫瘤的惡性生物學(xué)行為[18]。本組結(jié)果顯示，COLCA1下調(diào)miR-423-5p表達后，F(xiàn)AM172A基因表達上調(diào)，提示COLCA1可能通過互補結(jié)合miR-423-5p，間接促進FAM172A基因的表達。Notch信號通路的異?；罨杉铀倌[瘤細胞的生長和轉(zhuǎn)移，在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮重要作用[20]。Western blot檢測顯示，A431細胞中FAM172A蛋白表達升高后，Notch信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路蛋白如Notch1、Hes1、Cyclin D1和C-myc表達下調(diào)，提示Notch1信號通路活化被阻滯。

綜上所述，本實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)COLCA1在CSCC組織和細胞系中表達下調(diào)，過表達COLCA1可抑制CSCC細胞的增殖和遷移，其潛在分子機制可能為COLCA1作為競爭性內(nèi)源性RNA與miR-423-5p競爭性調(diào)控FAM172A基因的表達，抑制Notch信號通路的活化。本組實驗為COLCA1在CSCC發(fā)生、發(fā)展中的功能提供理論基礎(chǔ)，有望為CSCC的靶向治療提供新分子靶標。