谷存洋，張怡晗，劉淑霞，吳怡瑤，肖云飛，劉金熹，許 潔，王曉丹，劉青娟

糖尿病腎病(diabetic kidney disease, DKD)是終末期腎病(end-stage renal disease, ESRD)的主要原因，約44%的DKD患者可能發(fā)展為ESRD。腎小管間質纖維化(tubulointerstitial fibrosis, TIF)是DKD進展到ESRD的主要病理基礎，而腎近曲小管上皮細胞通過上皮-間葉性轉化(epithelial-mesenchymal transition, EMT)轉變?yōu)榧〕衫w維細胞是產生細胞外基質的主要細胞，在TIF進展中發(fā)揮重要作用[1]。有研究表明，DKD組織中STAT1被磷酸化激活，且STAT1的激活與TIF和EMT有關[2-3]。小泛素相關修飾物(small ubiquitin-related modifier, SUMO)是一種重要的蛋白質翻譯后修飾[4]，STAT1可發(fā)生SUMO化修飾且該修飾會影響STAT1的活性[5-6]。以往關于STAT1的SUMO化修飾的研究主要集中在SUMO1、SUMO2和SUMO3，而SUMO4主要在腎臟和免疫系統(tǒng)中表達[7-8]。本文以人腎小管上皮細胞為分析對象，探討STAT1的SUMO4修飾情況，以及該修飾在高糖誘導的腎小管上皮細胞EMT中的作用和機制。

1 材料與方法

1.1 材料人腎近曲小管上皮細胞株HK-2購自美國ATCC公司，兔抗SUMO4、α-SMA購自美國Abcam公司；鼠抗vimentin、p-STAT1，購自美國Abcam公司；鼠抗STAT1、兔抗E-cadherin、β-actin、A/G beads，均購自美國ProteinTech公司；報告基因檢測試劑盒購自美國Promega公司；SUMO4與UBC9 siRNA購自上海Sangon Biotech公司；轉染試劑Lipofectamine 3000購自美國Thermo Scientific公司；STAT1-Luc質粒購自上海Genonmeditech公司。

1.2 方法

1.2.1細胞培養(yǎng)及轉染 HK-2細胞用含有10%胎牛血清與1%青鏈霉素混合液的DMEM培養(yǎng)基，在37 ℃ 5% CO2的培養(yǎng)箱中正常培養(yǎng)。待細胞融合至60%～80%時，隨機分為：空白對照組，給予正常糖(NG，5.5 mmol/L葡萄糖)培養(yǎng)、高糖組(HG，30 mmol/L葡萄糖)、SUMO4-siRNA(轉染SUMO4 siRNA)組、NC-siRNA(轉染scrimble siRNA)組、UBC9-siRNA(轉染UBC9 siRNA)組。用Lipofectamine 3000將20 nmol/L的SUMO4 siRNA、UBC9 siRNA與500 ng的STAT1-Luc質粒轉染入HK-2細胞中，繼續(xù)用高糖培養(yǎng)基培養(yǎng)，48 h后收集細胞進行Western blot、Co-IP和雙熒光素酶報告基因分析。

1.2.2Western blot檢測 用含0.4%蛋白酶抑制劑和1%磷酸酶抑制劑混合物的RIPA裂解緩沖液裂解HK-2細胞，然后用BCA試劑盒對蛋白進行定量。蛋白電泳、轉膜后分別用抗SUMO4、STAT1、p-STAT1、E-cadherin、vimentin、α-SMA和β-actin抗體封閉過夜。采用ECL化學發(fā)光試劑檢測底物蛋白。以β-actin為內參，相對蛋白表達用Gel-Pro analyzer定量。

1.2.3免疫細胞化學檢測 使用6孔板放置無菌蓋玻片培養(yǎng)細胞，應用PV兩步法檢測E-cadherin和α-SMA的表達。4%多聚甲醛固定細胞30 min；0.1%Triton打孔30 min；3%H2O237 ℃孵育30 min去除內源性過氧化物酶；一抗1 ∶250稀釋，4 ℃過夜；分別滴加反應增強液和增強酶標山羊抗兔IgG聚合物，37 ℃孵育30 min；DAB顯色，蘇木精復染核。光學顯微鏡下觀察陽性信號。

1.2.4Co-IP檢測 用含0.4%蛋白酶抑制劑和1%磷酸酶抑制劑混合物的RIPA裂解緩沖液裂解HK-2細胞，然后用BCA試劑盒定量。將裂解物與鼠抗STAT1抗體(1 ∶2 000)在4 ℃搖架上孵育24 h，然后在4 ℃搖架上與蛋白A/G和瓊脂糖孵育過夜。用IP洗滌緩沖液4次，加入Buffer緩沖液，提取的蛋白質在100 ℃下煮沸7 min，并用Western blot法檢測SUMO4的表達。

1.2.5雙熒光素酶報告基因分析 將STAT1-Luc質粒、SUMO4 siRNA或UBC9 siRNA共轉染HK-2細胞，每組均同時轉染海腎熒光素酶質粒以消除轉染效率不同帶來的差異，高糖刺激24 h后加入細胞裂解液PLB，在室溫充分裂解。裂解液中首先加入LARⅡ試劑，檢測螢火蟲熒光素酶活性，隨后立即加入Stop&Glo試劑，檢測海腎熒光素酶活性。STAT1活性以螢火蟲熒光素酶活性與海腎熒光素酶活性的比值表示。

2 結果

2.1 高糖對HK-2細胞表型轉化的影響正常糖培養(yǎng)時，多數(shù)HK-2細胞呈典型的鵝卵石樣排列；而高糖培養(yǎng)48 h，多數(shù)細胞明顯拉長呈梭形(圖1A)。免疫細胞化學結果顯示，高糖刺激后HK-2細胞內E-cadherin陽性信號減弱，而α-SMA陽性信號增強(圖1B)。Western blot結果表明，正常糖培養(yǎng)不影響vimentin、α-SMA和E-cadherin的表達(圖1C)。高糖刺激下，與0 h相比，隨刺激時間延長，HK-2細胞中vimentin、α-SMA的相對表達量逐漸增高，分別于高糖刺激24、48 h差異有統(tǒng)計學意義。高糖刺激12 h后E-cadherin的相對表達量有明顯下調，且其表達變化呈時間依賴性(圖1D、E)。

2.2 高糖對HK-2細胞中SUMO4、p-STAT1的影響HK-2細胞加入高糖刺激后，SUMO4的相對表達量增高，12 h達高峰，之后其表達量有所下降(圖2A、B)。p-STAT1(Tyr701)的相對表達量在高糖刺激后持續(xù)上升，呈時間依賴性(圖2C、D)，但總STAT1的表達不受高糖影響。正常糖培養(yǎng)不改變SUMO4和p-STAT1的表達(圖2E)。

2.3 高糖對STAT1的SUMO4修飾的影響Co-IP檢測HK-2細胞中STAT1的SUMO4化修飾。正常糖培養(yǎng)時，用STAT1抗體沉淀的蛋白中檢測不到SUMO4，而高糖刺激后可見明顯的SUMO4條帶(圖3)，說明兩者在高糖條件下有明顯的結合，并且轉染UBC9 siRNA可明顯抑制兩者的結合，提示兩者間的結合是STAT1發(fā)生了SUMO4修飾。

2.4 STAT1的SUMO4修飾對其轉錄活性的影響HK-2細胞中加入高糖刺激24 h后，STAT1的活性升高(圖4)。轉染SUMO4 siRNA或者UBC9 siRNA之后再給予高糖刺激，均可進一步提升STAT1的活性。

2.5 SUMO4低表達對高糖誘導HK-2細胞EMT的影響HK-2細胞中轉染SUMO4 siRNA后再給予高糖刺激48 h，與NC-siRNA組相比，SUMO4-siRNA組中SUMO4的表達顯著降低，提示敲低SUMO4 siRNA的效果顯著(圖5A、B)。與NC-siRNA組相比，SUMO4-siRNA組HK-2細胞中α-SMA表達量顯著升高，而E-cadherin的表達顯著降低(圖5A、B)；提示敲低SUMO4可抑制HK-2細胞的表型轉變。

3 討論

DKD的主要病理改變是腎小球硬化及TIF。既往認為腎小球病變?yōu)镈KD的主要病理改變，但越來越多的證據(jù)表明TIF與腎功能相關性比腎小球硬化更為密切。TIF是DKD發(fā)展為ESRD的重要病理基礎，與腎小球病變相比，TIF能更好地預測腎臟疾病的進展[3]。TIF的特點是腎成纖維細胞的異?；罨图毎饣|的過量積累，而腎小管上皮細胞通過EMT轉變?yōu)榧〕衫w維細胞是產生細胞外基質、促使TIF發(fā)生、發(fā)展的關鍵病理過程。腎小管上皮細胞發(fā)生EMT的特征是上皮細胞黏附分子如E-cadherin丟失，并出現(xiàn)肌成纖維細胞的標志物如α-SMA和vimentin等的表達。本組應用30 mmol/L的高糖刺激HK-2細胞，通過細胞形態(tài)的改變及E-cadherin的表達減少和α-SMA、vimentin的表達增加，再次驗證了高糖可促使HK-2細胞發(fā)生EMT。

圖1 高糖對HK-2細胞中vimentin、α-SMA、E-cadherin表達的影響：A.光鏡觀察高糖對HK-2細胞形態(tài)的影響；B.免疫細胞化學檢測HK-2細胞中E-cadherin和α-SMA的表達，PV兩步法；C.Western blot檢測正常糖培養(yǎng)時HK-2細胞中vimentin、α-SMA、E-cadherin的表達；D.Western blot法檢測高糖培養(yǎng)下HK-2細胞中vimentin、α-SMA、E-cadherin的表達；E.vimentin、α-SMA、E-cadherin相對表達量的統(tǒng)計學分析，與0 h相比，*P<0.05，**P<0.01

圖2 高糖對HK-2細胞中SUMO4與p-STAT1表達的影響：A.Western blot法檢測高糖培養(yǎng)下SUMO4的表達；B.SUMO4相對表達量的統(tǒng)計學分析，與0 h相比，*P<0.05，**P<0.01；C.Western blot法檢測高糖培養(yǎng)時p-STAT1(Tyr701)及STAT1在HK-2中的表達；D.p-STAT1(Tyr701)相對表達量的統(tǒng)計學分析，與0 h相比 **P<0.01；E.Western blot法檢測正常糖培養(yǎng)時SUMO4、p-STAT1(Tyr701)在HK-2中的表達

圖4 雙熒光素酶報告基因分析檢測STAT1的轉錄活性：與NG組相比，*P<0.05，**P<0.01；與HG組相比，##P<0.01

文獻報道STAT1的磷酸化水平與DKD或其它慢性腎臟疾病的TIF和EMT有關[2-3,9-10]。STAT1有一個特定的SUMO化識別位點 —— ΨKXE，Ψ代表大的疏水殘基，K為賴氨酸，X為任意氨基酸，E為谷氨酸[11]，即STAT1可以發(fā)生SUMO化修飾，多數(shù)研究認為STAT1的SUMO化修飾通過影響STAT1的磷酸化進而影響其活性[12]，但以往的研究主要關注STAT1的SUMO1、SUMO2和SUMO3修飾。本實驗檢測HK-2細胞中STAT1的SUMO4修飾，結果表明：高糖可上調HK-2細胞內STAT1的SUMO4修飾。雙熒光素酶報告基因結果顯示，高糖可提升STAT1的轉錄活性，而抑制SUMO化修飾可進一步上調STAT1活性。此外，與單純高糖組相比，細胞轉染SUMO4 siRNA后再給予高糖刺激，HK-2細胞中E-cadherin的蛋白量增加，α-SMA的蛋白量降低，提示抑制STAT1的SUMO4修飾可緩解高糖誘導的EMT。

綜上所述，高糖誘導HK-2細胞發(fā)生EMT的同時，亦可提升STAT1的SUMO4修飾，盡管此時STAT1的活性上調，但抑制SUMO化修飾使STAT1活性進一步上調后，高糖誘導的EMT得到緩解。上述結果提示，高糖條件下STAT1活性增強可能是一種保護因素，因高糖會同時增加STAT1的SUMO化修飾，該修飾可抑制STAT1的活性，因此STAT1活性上調不足以對抗高糖誘導的EMT。當然，高糖還能誘導其它致EMT的因素，比如TGF-β1的合成增多、STAT3的激活等[13-14]，這些都是STAT1不能發(fā)揮有效保護作用的原因。本組結果不同于文獻報道的STAT1活化受抑可緩解EMT及TIF，可能的原因有以下幾個方面：本實驗應用SUMO4 siRNA處理會影響HK-2細胞中所有能被SUMO4修飾的蛋白，并不能特異抑制STAT1的SUMO4修飾；EMT緩解的原因也可能是其它蛋白的SUMO4修飾受抑導致的；文獻報道的腎臟病變緩解時除觀察到STAT1的磷酸化水平下調外，也有其它因素的變化，究竟哪些因素介導了病變的緩解尚不明確。因此，我們還需進一步特異性的靶向抑制STAT1的活性，以明確STAT1的激活在TIF中的作用。