劉志偉，李新陽(yáng)，王子明，任 婧，王新帥

食管癌作為消化系統(tǒng)惡性腫瘤之一，死亡率高，嚴(yán)重威脅人類的健康[1]?！?018年全球癌癥統(tǒng)計(jì)》對(duì)全世界范圍內(nèi)185個(gè)國(guó)家36種癌癥的發(fā)病率及死亡率的估計(jì)顯示，2018年食管癌新發(fā)572 034例，其發(fā)病率和病死率分別在全球惡性腫瘤中居第七位和第六位[2]。同時(shí)中國(guó)食管癌新發(fā)及死亡病例約占全球病例的一半，《2015年中國(guó)惡性腫瘤流行情況分析》顯示我國(guó)食管癌新發(fā)24.6萬(wàn)例，死亡18.8萬(wàn)例，其發(fā)病率和病死率分別在中國(guó)惡性腫瘤中居第七位和第四位[3]。由于食管癌早期無(wú)明顯癥狀，大多數(shù)患者確診時(shí)已是晚期，無(wú)手術(shù)根治切除的機(jī)會(huì)，傳統(tǒng)放化療尚不能明顯提高患者遠(yuǎn)期生存率，近年來(lái)免疫治療的興起使多種癌癥患者受益，同時(shí)也為食管癌精準(zhǔn)治療提供了一種新的治療方式?；诖?，進(jìn)一步探明更多影響食管癌免疫相關(guān)基因顯得尤為必要。因此，本研究在轉(zhuǎn)錄組水平上通過(guò)對(duì)比分析食管鱗癌與正常組織的基因表達(dá)差異性，探尋食管鱗癌免疫相關(guān)基因，并驗(yàn)證其有效性，為食管鱗癌免疫治療提供理論依據(jù)?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 數(shù)據(jù)下載及預(yù)處理研究采用Rstduio(3.6.3版本)下載函數(shù)，從GEO數(shù)據(jù)庫(kù)獲得GSE75241基因表達(dá)矩陣及平臺(tái)信息GPL5175[HuEx-1_0-st] Affymetrix Human Exon 1.0 ST Array[transcript (gene) version]。基因表達(dá)矩陣GSE75241共納入15例食管鱗癌組織樣本及15例癌旁組織樣本，借助標(biāo)準(zhǔn)化函數(shù)降低數(shù)據(jù)間的差異性，使基因表達(dá)數(shù)據(jù)具有較好的一致性，基于平臺(tái)信息將探針名轉(zhuǎn)化為基因名以用于下一步分析。

1.2 免疫相關(guān)基因鑒定基于Rstduio的相關(guān)軟件包Limma(3.42.2版本)綜合對(duì)比分析食管鱗癌組織與癌旁組織的基因表達(dá)矩陣，得到差異分析矩陣。差異基因定義為FDR<0.01及|logFC|≥1。Ggplot2包(3.3.0版本)用于繪制火山圖和可視化差異分析結(jié)果。本研究從在線分析免疫相關(guān)基因的數(shù)據(jù)庫(kù)Immport下載得到2 498個(gè)免疫相關(guān)基因，進(jìn)一步結(jié)合分析差異基因，確定具有顯著差異性的免疫相關(guān)基因。

1.3 PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及關(guān)鍵免疫相關(guān)基因確定STRING(https://string-db.org/)數(shù)據(jù)庫(kù)用于評(píng)估蛋白質(zhì)的相互作用(protein-protein interaction，PPI)和網(wǎng)絡(luò)內(nèi)基因的量化關(guān)系。關(guān)鍵基因(key genes)是指與網(wǎng)絡(luò)內(nèi)其他基因高度相關(guān)，并對(duì)整個(gè)網(wǎng)絡(luò)有重要影響的基因。關(guān)鍵免疫相關(guān)基因依據(jù)基因之間的關(guān)聯(lián)度(degree)篩選分析。

1.4 關(guān)鍵免疫相關(guān)基因分析驗(yàn)證及miRNA預(yù)測(cè)GEPIA(http://gepia.cancer-pku.cn/)數(shù)據(jù)庫(kù)可以根據(jù)腫瘤類型對(duì)比分析腫瘤與正常組織中關(guān)鍵基因的差異表達(dá)情況，并用箱線圖可視化驗(yàn)證?；贙aplan Meier-plotter(http://kmplot.com/analysis/)數(shù)據(jù)庫(kù)驗(yàn)證關(guān)鍵基因?qū)ι骖A(yù)后的影響。MiRWalk數(shù)據(jù)庫(kù)(http://mirwalk.umm.uni-heidelberg.de/)是一個(gè)多物種綜合性的miRNA靶基因數(shù)據(jù)庫(kù)，選擇靶位點(diǎn)在3’-UTR區(qū)域相關(guān)性>95%的miRNA用于預(yù)測(cè)關(guān)鍵免疫相關(guān)基因的miRNA。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法本研究統(tǒng)計(jì)學(xué)計(jì)算及分析采用

Rstduio(3.6.3版本)和相關(guān)軟件包，以P<0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，F(xiàn)DR(false discovery rate)指調(diào)整后的P值。

2 結(jié)果

2.1 數(shù)據(jù)下載及預(yù)處理本研究通過(guò)R下載函數(shù)獲得GSE75241基因表達(dá)矩陣及GPL5175平臺(tái)信息。通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)化及探針轉(zhuǎn)化，得到17 324個(gè)基因和30例食管組織樣本(15例食管鱗癌組織和15例癌旁組織)構(gòu)成的基因表達(dá)矩陣。

2.2 免疫相關(guān)基因鑒定基于Limma包差異分析17 324個(gè)基因，得到基因的差異表達(dá)矩陣。以“FDR<0.01及|logFC|≥1”為篩選條件，共得到1 437個(gè)顯著差異表達(dá)基因(841個(gè)上調(diào)差異基因和596個(gè)下調(diào)差異基因)，如圖1所示，紅點(diǎn)代表841個(gè)上調(diào)基因，綠點(diǎn)代表596個(gè)下調(diào)基因。進(jìn)一步將1 437個(gè)差異基因與2 498個(gè)免疫相關(guān)基因結(jié)合分析，發(fā)現(xiàn)差異基因中存在169個(gè)顯著差異的免疫相關(guān)基因(130個(gè)上調(diào)、39個(gè)下調(diào))，如圖2所示。

圖1 差異基因火山圖

圖2 免疫相關(guān)基因鑒定

2.3 PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及關(guān)鍵免疫相關(guān)基因確定本研究將130個(gè)上調(diào)和39個(gè)下調(diào)免疫相關(guān)基因上傳至STRING在線數(shù)據(jù)庫(kù)得到基因之間的量化關(guān)系?；诨蛑g的量化關(guān)系，通過(guò)Cytoscape軟件繪制上調(diào)及下調(diào)免疫相關(guān)基因的PPI網(wǎng)絡(luò)并行可視化分析。選取上調(diào)免疫相關(guān)基因PPI網(wǎng)絡(luò)基因關(guān)聯(lián)度≥65的基因作為關(guān)鍵免疫相關(guān)基因，選取下調(diào)免疫相關(guān)基因PPI網(wǎng)絡(luò)基因關(guān)聯(lián)度≥7的基因作為關(guān)鍵免疫相關(guān)基因。如圖3A和3B所示，上調(diào)關(guān)鍵免疫相關(guān)基因?yàn)镮L-6(白介素6)、CXCL8(白介素8)，下調(diào)關(guān)鍵免疫相關(guān)基因?yàn)镮L-18(白介素18)。

A：上調(diào)免疫相關(guān)基因PPI網(wǎng)絡(luò)；B：下調(diào)免疫相關(guān)基因PPI網(wǎng)絡(luò)。圖3 免疫相關(guān)基因PPI網(wǎng)絡(luò)

2.4 關(guān)鍵免疫相關(guān)基因分析驗(yàn)證及miRNA預(yù)測(cè)本研究基于GEPIA在線數(shù)據(jù)庫(kù)分析IL-6、CXCL8和IL-18在食管癌及正常食管組織中的基因表達(dá)水平。如圖4所示，對(duì)比正常食管組織，IL-6和CXCL8在食管癌組織內(nèi)高表達(dá)，而IL-18在食管癌組織內(nèi)低表達(dá)。進(jìn)一步將IL-6、CXCL8和IL-18上傳至Kaplan Meier-plotter數(shù)據(jù)庫(kù)分析基因表達(dá)水平對(duì)食管癌患者總生存期(overall survival,OS)的影響，如圖5所示，IL-6和CXCL8高表達(dá)與食管癌患者較短的總生存期相關(guān)(P<0.05)，而IL-18表達(dá)與食管癌患者生存期無(wú)相關(guān)性(P>0.05)。基于miRWalk數(shù)據(jù)庫(kù)獲得與IL-6、CXCL8和IL-18有關(guān)的miRNA，得到與IL-6顯著相關(guān)miRNA 75個(gè)，與CXCL8顯著相關(guān)miRNA 206個(gè)，與IL-18顯著相關(guān)miRNA 199個(gè)，通過(guò)繪制維恩圖發(fā)現(xiàn)miR-6806-5p共同靶向IL-6、CXCL8和IL-18(圖6)。

紅色：食管癌組織; 黑色：正常食管組織。圖4 關(guān)鍵免疫相關(guān)基因在食管癌和正常組織中差異表達(dá)

圖5 關(guān)鍵免疫相關(guān)基因OS評(píng)估

圖6 免疫相關(guān)基因miRNA靶標(biāo)預(yù)測(cè)

3 討論

食管癌是世界第七大常見(jiàn)癌癥，中國(guó)食管癌發(fā)病率居世界首位。免疫治療通過(guò)刺激免疫系統(tǒng)消滅腫瘤，相比于傳統(tǒng)放化療，其藥物毒性作用少，已使越來(lái)越多的患者受益[4]。目前，免疫治療在食管癌中的研究逐漸展開，挖掘食管癌免疫相關(guān)基因，對(duì)于食管癌免疫治療尤為必要。

本研究通過(guò)差異對(duì)比分析食管鱗癌與正常組織的基因表達(dá)量，鑒定出與免疫基因顯著相關(guān)的差異基因169個(gè)，通過(guò)分析免疫相關(guān)基因PPI網(wǎng)絡(luò)，確定關(guān)鍵免疫相關(guān)基因?yàn)镮L-6、CXCL8(上調(diào))和IL-18(下調(diào))。對(duì)比分析正常食管組織，IL-6和CXCL8在食管癌組織中高表達(dá)，而IL-18在食管癌組織中低表達(dá)(圖4)，與差異分析結(jié)果一致。生存分析顯示IL-6和CXCL8的高表達(dá)與患者較短總生存期相關(guān)(P<0.05)，IL-18表達(dá)雖然與食管癌免疫相關(guān)，但與患者生存期無(wú)顯著相關(guān)性(P>0.05)。綜合分析IL-6、CXCL8和IL-18相關(guān)miRNA，發(fā)現(xiàn)miR-6806-5p共同靶向IL-6、CXCL8和IL-18，提示miR-6806-5p可能共同調(diào)控IL-6、CXCL8和IL-18的表達(dá)。

IL-6是一種多功能促炎細(xì)胞因子[5]，在惡性腫瘤的發(fā)病和發(fā)展過(guò)程中起重要作用[6]。已證實(shí)，IL-6在黑色素瘤、結(jié)直腸癌、卵巢癌等多種癌癥中高表達(dá)[7-9]，且與癌癥患者生存率呈負(fù)相關(guān)[10]。IL-6主要通過(guò)JAK2-STAT3、Ras-MAPK和PI3K-Akt信號(hào)通路促進(jìn)腫瘤細(xì)胞擴(kuò)增及新生血管的生成[6，11-12]。腫瘤免疫逃逸與IL-6調(diào)節(jié)多種免疫細(xì)胞(T細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞及巨噬細(xì)胞)有關(guān)[13-14]。CXCL8是一種由多種腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生能吸引髓系白細(xì)胞的促炎性趨化因子[15]。CXCL8同樣在多種腫瘤細(xì)胞中高表達(dá)，如乳腺癌、胃癌、前列腺癌等。且血清白介素8的高水平與疾病進(jìn)展有關(guān)[16]。CXCL8由腫瘤細(xì)胞通過(guò)旁分泌或自分泌產(chǎn)生后，與趨化性受體CXCR1或CXCR2相互作用，可以改變腫瘤微環(huán)境內(nèi)免疫細(xì)胞的構(gòu)成或促進(jìn)致癌信號(hào)、血管生成及多藥耐藥[17]。最新研究表明，腫瘤細(xì)胞分泌CXCL8可以促進(jìn)髓系來(lái)源的抑制細(xì)胞浸潤(rùn)，進(jìn)一步導(dǎo)致T免疫細(xì)胞受抑制引起腫瘤免疫逃逸[18]。IL-18屬于白介素1家族，是一種免疫刺激細(xì)胞因子[19]。由活化的免疫細(xì)胞(單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、自然殺傷細(xì)胞等)產(chǎn)生的IL-18可以刺激Th1或自然殺傷細(xì)胞產(chǎn)生IFN-γ，促進(jìn)淋巴細(xì)胞增殖增強(qiáng)體內(nèi)免疫系統(tǒng)。各種腫瘤細(xì)胞都會(huì)產(chǎn)生IL-18誘導(dǎo)癌細(xì)胞侵襲、轉(zhuǎn)移和增殖[20]。miRNA靶標(biāo)預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)miR-6806-5p共同調(diào)控IL-6、CXCL8和IL-18，目前miR-6806-5p的生物學(xué)功能尚不清楚，但是其靶向性可能作為研究食管癌免疫治療的一個(gè)新靶標(biāo)。

綜上所述，本研究基于綜合數(shù)據(jù)分析，對(duì)比食管鱗癌與正常食管組織的基因表達(dá)譜，鑒定與食管癌顯著相關(guān)的免疫基因，表明IL-6、CXCL8和IL-18通過(guò)影響免疫細(xì)胞，可能會(huì)導(dǎo)致腫瘤免疫逃逸的發(fā)生，并進(jìn)一步預(yù)測(cè)出共同調(diào)控IL-6、CXCL8和IL-18的miRNA(miR-6806-5p)，為食管鱗癌免疫治療提供一定的理論依據(jù)。