徐玉嬋，韋德寧，羅穎花，韋朔峰，蔡 稔，唐 寧，嚴(yán)提珍

柳州市婦幼保健院/廣西科技大學(xué)附屬婦產(chǎn)醫(yī)院、兒童醫(yī)院醫(yī)學(xué)遺傳科/柳州市生殖與遺傳研究所，廣西柳州 545001

C顯帶技術(shù)由ARRIGHI和HSU于1971年發(fā)明，一般認(rèn)為C顯帶深染的區(qū)域是結(jié)構(gòu)異染色質(zhì)區(qū)域，也就是DNA高度重復(fù)序列區(qū)域。人類近端著絲粒染色體(13、14、15、21和22號染色體)的副縊痕處與核仁形成有關(guān)，故稱為核仁形成區(qū)(NOR)，用N顯帶技術(shù)(硝酸銀染色法)可使染色體的隨體及核仁組織區(qū)出現(xiàn)特異性的黑色銀染物[1]。目前，C顯帶和N顯帶技術(shù)的相關(guān)研究很少，本實(shí)驗(yàn)室在工作中發(fā)現(xiàn)C顯帶和N顯帶技術(shù)除了輔助診斷染色體多態(tài)性以外，對雙著絲粒染色體、標(biāo)記染色體(mar)的分析也具有一定的意義,現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2018年3月至2020年2月于柳州市婦幼保健院進(jìn)行外周血染色體核型分析的就診者19 560例為研究對象。

1.2方法

1.2.1標(biāo)本采集 取受試者外周血2 mL，置于肝素抗凝的無菌真空采血管中，輕輕顛倒混勻后運(yùn)送到實(shí)驗(yàn)室檢測。

1.2.2染色體核型分析(G顯帶) 將外周血標(biāo)本0.5 mL接種于淋巴細(xì)胞培養(yǎng)液，37 ℃培養(yǎng)72 h后進(jìn)行常規(guī)染色體制備及G顯帶。計(jì)數(shù)20個(gè)中期分裂相細(xì)胞，分析5個(gè)及以上核型，當(dāng)發(fā)現(xiàn)嵌合體或異常細(xì)胞時(shí)，再增加計(jì)數(shù)至100個(gè)中期分裂相細(xì)胞。必要時(shí)采用C顯帶、N顯帶進(jìn)行輔助診斷。染色體核型描述采用人類細(xì)胞基因組學(xué)國際命名體系(ISCN)2016年版的相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)。

1.2.3染色體分析(C顯帶) 將制好的玻片置于0.2 mol/L氯化氫中，室溫下處理5 min，然后用60 ℃蒸餾水沖凈；浸入60 ℃的5%氫氧化鋇液中1～4 min，蒸餾水沖凈；在60 ℃的2×SSC液中處理10 min，蒸餾水沖凈；以稀釋10倍的吉姆薩染液染色5～10 min(37 ℃)，沖洗、晾干。

1.2.4染色體分析(N顯帶) 將制好的玻片置于干燥培養(yǎng)皿并放入60 ℃水浴箱中，新鮮配制0.1%甲酸1 mL，加入0.5 g硝酸銀，充分溶解后滴在覆蓋了兩層擦鏡紙的玻片上，直至擦鏡紙呈棕黃色，取走擦鏡紙，將玻片沖洗后以吉姆薩染液染色5～10 min(37 ℃)，沖洗、晾干。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用Excel2010進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

2 結(jié) 果

2.1C、N顯帶技術(shù)對染色體多態(tài)性的檢出情況 19 560例外周血染色體核型分析中，經(jīng)G顯帶結(jié)合C顯帶和N顯帶檢出的染色體多態(tài)共199例，檢出率為1.02%；其中涉及異染色質(zhì)的有142例，占71.36%，涉及核仁區(qū)變異的有57例，占28.64%。染色體多態(tài)檢出的人群中以不孕不育、不良妊娠史、反復(fù)流產(chǎn)等原因就診的有126例，占63.32%，其中不孕不育為主要就診原因，占51.59%(65/126)，具體的染色體多態(tài)類型及構(gòu)成比見表1。

表1 199例外周血染色體多態(tài)類型和構(gòu)成比

2.2C、N顯帶技術(shù)對mar的輔助診斷意義 19 560例外周血染色體核型分析中，檢出7例mar，進(jìn)行C、N顯帶分析，發(fā)現(xiàn)其中有5例N顯帶見兩端有隨體，C顯帶見深染或部分深染的異染色質(zhì)。臨床表現(xiàn)以不孕不育為主，3例不育，2例不孕，1例發(fā)育遲緩。其中1例36歲的不孕女性染色體核型為48,XX,+2mar，2個(gè)形態(tài)相似的mar N顯帶見頭尾兩端均有隨體(圖1)，C顯帶見深染的異染色質(zhì)(圖2)。另有1例智力低下的6歲患兒染色體核型為47,XX,+mar[26]/46,XX[81]，其較低比例的嵌合型mar N顯帶未見隨體，C顯帶未見異染色質(zhì)。

注：箭頭所示的2個(gè)mar均有雙隨體。

注：箭頭所示的2個(gè)mar均為深染的異染色質(zhì)。

2.3C顯帶對雙著絲粒染色體的輔助診斷意義 G顯帶結(jié)合C顯帶確證各類型雙著絲粒染色體核型6例，其中4例涉及性染色體，2例是等臂雙著絲粒Y染色體和45，X細(xì)胞系的嵌合體。就診原因中有3例矮小癥，2例不育，1例發(fā)育遲緩。其中1例4歲女性患兒因矮小癥就診，染色體核型分析為等臂雙著絲粒X染色體，經(jīng)C顯帶發(fā)現(xiàn)其中1個(gè)著絲粒較松散，呈細(xì)線狀，是沒有活性的假著絲粒，核型為46,X,psu idic(X)(p22.1)。另有1例11歲男性矮小癥患兒染色體核型為等臂雙著絲粒Y染色體，經(jīng)C顯帶發(fā)現(xiàn)2個(gè)著絲粒較致密，均為有活性的真著絲粒，核型為46,X,idic(Y)(p11.3)[88]/45,X[12]。

3 討 論

染色體多態(tài)性是指不同個(gè)體之間染色體結(jié)構(gòu)和染色體著色強(qiáng)度存在恒定的細(xì)小差別,通常指D、G組染色體隨體區(qū)變異(主要包括隨體區(qū)增大、雙隨體)及1、9、16號染色體副縊痕增加或缺失等，傳統(tǒng)觀點(diǎn)認(rèn)為上述變異不會(huì)引起表型效應(yīng)，但也有不少學(xué)者認(rèn)為染色體多態(tài)性降低了受精率和優(yōu)質(zhì)胚胎率，與男性無精、少精等生育異常密切相關(guān),也是導(dǎo)致女性不良妊娠的重要因素[2-4]。本研究中，染色體多態(tài)檢出率為1.02%，檢出的人群以不孕不育、不良妊娠史、反復(fù)流產(chǎn)等原因就診多見，又以不孕不育為主要就診原因，占51.59%。

mar是指通過常規(guī)細(xì)胞遺傳學(xué)顯帶技術(shù)可以辨認(rèn)但無法確定其來源或特征的染色體。mar的發(fā)生率在新生兒中為0.044%，在不孕不育人群中為0.125%，在發(fā)育遲緩患兒中為0.288%[5]。細(xì)胞遺傳學(xué)中C顯帶和N顯帶技術(shù)與分子診斷技術(shù)相結(jié)合,可以對額外小標(biāo)記染色體(sSMCs)的性質(zhì)、來源和致病性進(jìn)行明確診斷[6]。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，來源于常染色體的mar約80%為D、G組染色體，30%～50% 為15號染色體重復(fù)片段[5，7]。家族遺傳性和由異染色質(zhì)組成的mar臨床表型正常，而新發(fā)的包含常染色質(zhì)的mar常導(dǎo)致異常臨床表型。人類的近端著絲粒染色體(D、G組)短臂細(xì)長易斷裂，斷裂重接后沒有與原來的染色體長臂連接，而是兩端著絲粒的短臂連接，最終形成具有雙隨體的mar，由于其斷裂處靠近著絲粒，具有著絲粒功能，所以可隨細(xì)胞分裂而穩(wěn)定的向子代傳遞。近端著絲粒染色體的短臂暫未發(fā)現(xiàn)有致病基因,所以這類mar一般認(rèn)為其臨床表型是正常的[8]。楊蘭等[9]對攜帶sSMCs的26例患者進(jìn)行C、N顯帶分析,發(fā)現(xiàn)17例含有隨體片段,2例含有異染色質(zhì)片段,1例同時(shí)含有隨體和異染色質(zhì)片段，5例sSMCs可能是常染色質(zhì)來源。席惠等[10]通過聯(lián)合運(yùn)用多種技術(shù)鑒別4例胎兒新發(fā)mar,其中C顯帶示2例為異染色質(zhì)結(jié)構(gòu)，胎兒出生后生長發(fā)育均在正常范圍內(nèi)；2例為非異染色質(zhì)結(jié)構(gòu),進(jìn)一步行單核苷酸多態(tài)芯片檢測，結(jié)果示1例未見致病性改變，1例為4號染色體部分重復(fù)。本研究發(fā)現(xiàn)的7例mar中，有5例N顯帶見兩端有隨體，C顯帶見深染或部分深染的異染色質(zhì)，臨床表型主要為不孕不育。另有1例6歲患兒雖為較低比例的嵌合型 mar，卻表現(xiàn)為智力低下，其N顯帶未見隨體，C顯帶未見異染色質(zhì)。由于經(jīng)濟(jì)原因，該患兒并未進(jìn)一步行染色體微陣列分析(CMA)或基因組拷貝數(shù)變異測序(CNV-seq)等分子診斷技術(shù)來鑒別mar的來源和致病性。

雙著絲粒染色體是由兩條非同源或同源染色體發(fā)生一次末端缺失后，兩段具有著絲粒的片段重接形成，如果是兩條同源染色體片段斷裂重接，兩臂成鏡像關(guān)系，則稱為等臂雙著絲粒染色體，其在健康人群中非常少見，多見于經(jīng)染色體斷裂劑處理、白血病及骨髓增生異?；颊叩墓撬枞旧w核型[11-13]。少數(shù)雙著絲粒染色體中的1個(gè)著絲粒失活，僅存在1個(gè)具有功能活性的著絲粒，且具有穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)[14]，稱為假雙著絲粒染色體。鑒別雙著絲粒染色體的兩個(gè)著絲粒是否都具有活性，即判斷雙著絲粒的真假性，可初步從G顯帶結(jié)果判斷，一般有活性的著絲粒比較致密，有明顯的縮窄，無活性的著絲粒較疏松，縮窄不明顯，當(dāng)G顯帶不明顯無法鑒別時(shí)可借助C顯帶。本研究中，1例4歲女性患兒因矮小癥就診，染色體核型分析G顯帶為等臂雙著絲粒X染色體，經(jīng)C顯帶發(fā)現(xiàn)其中1個(gè)著絲粒較松散，呈細(xì)線狀，是沒有活性的假著絲粒。雙著絲粒染色體在細(xì)胞分裂時(shí)是不穩(wěn)定的，因此可形成不同類型的細(xì)胞系，且多為與45,X細(xì)胞系的嵌合體。嚴(yán)芳等[15]發(fā)現(xiàn)，6例性別混亂患者染色體核型均為等臂雙著絲粒Y染色體，其中5例與45,X細(xì)胞系嵌合,且Y染色體斷裂點(diǎn)的不同及45,X在細(xì)胞系中所占比例的差異導(dǎo)致表型的不同。本研究發(fā)現(xiàn)，6例雙著絲粒染色體中有4例涉及性染色體，有2例是等臂雙著絲粒Y染色體和45,X細(xì)胞系的嵌合體，臨床表現(xiàn)為矮小癥、不育和發(fā)育遲緩。

綜上所述，C顯帶和N顯帶技術(shù)較常用于隨體區(qū)變異、異染色質(zhì)長度變化及有無等染色體多態(tài)性的鑒別。本研究發(fā)現(xiàn)，C顯帶和N顯帶在mar的來源及致病性的初步判斷上具有一定意義，如N顯帶見兩端有隨體，C顯帶見深染的異染色質(zhì)，極有可能來源于D、G組染色體短臂的斷裂重接，通常無臨床表型；如N顯帶未見隨體，C顯帶未見異染色質(zhì)，致病的可能性大，需進(jìn)一步行CMA、CNV-seq等分子診斷技術(shù)鑒別其來源和致病性。C顯帶在鑒別雙著絲粒染色體的真假性上也有一定價(jià)值，假性、無活性的著絲粒其C顯帶較松散，呈細(xì)線狀。此外，對于涉及隨體、異染色質(zhì)的復(fù)雜染色體核型鑒定，亦可通過C顯帶和N顯帶技術(shù)進(jìn)行輔助診斷。因此，對于一些傳統(tǒng)的細(xì)胞遺傳學(xué)技術(shù)，在臨床工作中應(yīng)積極總結(jié)經(jīng)驗(yàn)，挖掘其多方面的臨床應(yīng)用價(jià)值。