張杰，楊旭東★，石杰，楊驕霞，王桂云，宋高臣

（1.牡丹江醫(yī)學(xué)院，黑龍江 牡丹江 157011；2.牡丹江醫(yī)學(xué)院附屬紅旗醫(yī)院，黑龍江 牡丹江 157011）

0 引言

羊棲菜是一種隸屬于褐藻門的食用海藻，富含氨基酸、維生素和多糖等，其重要成分羊棲菜多糖（Sargassum fusiforme polysaccha-ride，SFPS）是一種具有多種生物活性的物質(zhì)，具有抗氧化、抗衰老、抑制腫瘤、降血脂等作用[1-3]。本課題組前期動(dòng)物實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，SFPS 具有改善糖尿病大鼠胰島素抵抗的作用[4-5]，但其對(duì)體外脂肪細(xì)胞的增殖及糖脂代謝的影響及其機(jī)制未見報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步觀察羊棲菜多糖對(duì)3T3-L1 脂肪細(xì)胞脂代謝的影響并初步研究其作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

羊棲菜多糖由牡丹江醫(yī)學(xué)院中心實(shí)驗(yàn)室提供；3T3-L1 前脂肪細(xì)胞（美國(guó)ATCC 公司）；DMEM 高糖培養(yǎng)液、胎牛血清（美國(guó)Gibco 公司）；DOMO、MTT試劑（Sigma 公司）；胰蛋白酶、引物核苷酸片段（上海生工），其他試劑為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 主要儀器和設(shè)備

CO2恒溫培養(yǎng)箱（美國(guó)G.S.公司）；PCR 儀（德國(guó)，Biometra）；紫外分光光度計(jì)（上海元析）；酶標(biāo)儀（美國(guó)Biotek公司）；凝膠成像系統(tǒng)（美國(guó)Bio-Rad公司）；PCR 儀（德國(guó)，Biometra）。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 細(xì)胞培養(yǎng)

3T3-L1 前脂肪細(xì)胞培養(yǎng)條件[6]，37℃飽和濕度，5%CO2環(huán)境，10%胎牛血清DMEM 高糖培養(yǎng)液（鏈霉素100mg/L、青霉素100IU/L）培養(yǎng)。

1.3.2 胰島素抵抗模型建立

待分化細(xì)胞37℃飽和濕度，5%CO2培養(yǎng)箱，DMEM培養(yǎng)基中加入誘導(dǎo)液1（10μg/mL 胰島素、0.5mmol/LIBMX、1mmol/mL 地塞米松）培養(yǎng)2d。棄上清，DMEM培養(yǎng)基中加入誘導(dǎo)液2（10mg/L 胰島素），培養(yǎng)2d。更換DMEM 培養(yǎng)基，37℃，5%CO2培養(yǎng)箱，培養(yǎng)9d，細(xì)胞接近圓形，脂滴明顯聚集，細(xì)胞分化完成。分化成熟的3T3-L1 脂肪細(xì)胞分為對(duì)照組（高糖DMEM 培養(yǎng)基）和模型組（1mmol/mL 地塞米松），96h 后，GOD-POD方法測(cè)定培養(yǎng)基中葡萄糖消耗量確定模型是否成功。

1.3.3 胰島素抵抗細(xì)胞葡萄糖消耗量、甘油三酯和游離脂肪酸的測(cè)定

造模成功細(xì)胞分為3 組：模型組、SFPS 100mg/L 組 和SFPS 200mg/L 組，另 設(shè) 分 化 成 熟3T3-L1 脂肪細(xì)胞為正常對(duì)照組。上述各組繼續(xù)培養(yǎng)48h 后，按照試劑盒說明測(cè)定葡萄糖消耗量（glucose consumption，Glu）、游離脂肪酸（Free fatty acid，F(xiàn)FA）的生成量和細(xì)胞中甘油三酯（triglyceride,TG）含量。

1.3.4 MTT 法檢測(cè)細(xì)胞相對(duì)增殖率

正常對(duì)照組、模型組、SFPS 100mg/L 組和SFPS 200mg/L 組細(xì)胞，每組6 個(gè)平行孔，分別培養(yǎng)24h、48h、72h，加入MTT（5g/L）20μL，孵育4h，棄上清，加150μL DMSO，完全溶解，輕微振蕩12min。酶標(biāo)儀570nm 測(cè)光密度（OD）值，并計(jì)算細(xì)胞相對(duì)增殖率（Relative Growth Rate，RGR）。RGR（細(xì)胞相對(duì)增殖率）＝實(shí)驗(yàn)組OD 值／對(duì)照組OD 值×100%

1.3.5 RT-PCR 檢測(cè)3T3-L1 細(xì)胞中GLUT-4、HSL的mRNA 表達(dá)情況

各組細(xì)胞棄培養(yǎng)液，Trizol 法提取3T3-L1 細(xì)胞細(xì)胞總RNA，鑒定RNA 純度后逆轉(zhuǎn)錄生成cDNA。PCR 反應(yīng)條件：預(yù)變性95℃60s，變性95℃15s，復(fù)性60℃25s，延伸72℃45s，共40 個(gè)循環(huán)，引物序列，見表1。凝膠成像系統(tǒng)分析，分別計(jì)算GLUT-4/β-actin 和HSL/β-actin 的灰度比值。

表1 GLUT-4、HSL 的引物序列

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 SFPS 對(duì)3T3-L1 細(xì)胞胰島素抵抗模型葡萄糖消耗量的影響

造模細(xì)胞分別培養(yǎng)24h、48h、72h，與對(duì)照組比較，培養(yǎng)48h、72h 的模型組細(xì)胞培養(yǎng)基中葡萄糖濃度顯著升高(P＜0.01)，表明細(xì)胞對(duì)葡萄糖的消耗量顯著降低，見表2。

表2 3T3-L1 細(xì)胞培養(yǎng)基中葡萄糖濃度（，n=6，mmol/L）

表2 3T3-L1 細(xì)胞培養(yǎng)基中葡萄糖濃度（，n=6，mmol/L）

注：與對(duì)照組比較，*P＜0.05，**P＜0.01。

2.2 SFPS 對(duì)胰島素抵抗3T3-L1 細(xì)胞糖脂代謝的影響

由表3 可知，與模型組比較，SFPS 100mg/L 組和SFPS 200mg/L 組也能顯著增加胰島素抵抗3T3-L1細(xì)胞葡萄糖消耗量的量 (P＜0.01)。與模型組比較，SFPS 100mg/L 組和SFPS 200mg/L 組也顯著降低胰島素抵抗3T3-L1 細(xì)胞生成FFA 的量(P＜0.01)。

表3 SFPS 對(duì)胰島素抵抗3T3-L1 細(xì)胞中糖脂代謝的影響（，n=6）

注：與正常對(duì)照組比較，**P＜0.01；與模型組比較，##P＜0.01。

2.3 SFPS 對(duì)胰島素抵抗3T3-L1 細(xì)胞相對(duì)增殖率的影響

與正常對(duì)照組比較，模型組胰島素抵抗3T3-L1細(xì)胞24h，48h 和72h 相對(duì)增值率降低（P＜0.01，P＜0.05），24h，48h 細(xì)胞相對(duì)增殖率降低顯著（P＜0.01）。與模型組比較，SFPS 100mg/L 組和SFPS 200mg/L 組能提高胰島素抵抗3T3-L1 細(xì)胞相對(duì)增值率，提高細(xì)胞活力，24h 細(xì)胞和48h 細(xì)胞相對(duì)增值率顯著增加（P＜0.01），見表4。

2.4 SFPS 對(duì)3T3-L1 細(xì)胞中GLUT-4、HSL mRNA表達(dá)的影響

與正常對(duì)照組比較，模型組胰島素抵抗3T3-L1 細(xì)胞GLUT-4 mRNA 表達(dá)顯著降低，HSL mRNA 表達(dá)顯著增加（P＜0.01）（見表5，圖1、2）。與模型組比較，SFPS 100mg/L 組和SFPS 200mg/L 組GLUT-4mRNA 表達(dá)顯著增加，HSL mRNA 表達(dá)顯著降低（P＜0.01，P＜0.05）（見表5，圖1、2）。

表4 SFPS 對(duì)胰島素抵抗3T3-L1 細(xì)胞相對(duì)增殖率的影響（,n=6）

表4 SFPS 對(duì)胰島素抵抗3T3-L1 細(xì)胞相對(duì)增殖率的影響（,n=6）

注：與正常對(duì)照組比較，**P＜0.01，* P＜0.05；與模型組比較，##P＜0.01，#P＜0.05。

表5 SFPS 對(duì)3T3-L1 細(xì)胞中GLUT-4、HSL mRNA 表達(dá)的影響（，n=6）

表5 SFPS 對(duì)3T3-L1 細(xì)胞中GLUT-4、HSL mRNA 表達(dá)的影響（，n=6）

注：與正常對(duì)照組比較，**P＜0.01，* P＜0.05；與模型組比較，##P＜0.01，#P＜0.05。

圖1 各組細(xì)胞GLUT-4 基因表達(dá)

圖2 各組細(xì)胞HSL 基因表達(dá)

3 討論

2 型糖尿病是一種復(fù)雜糖脂代謝紊亂的慢性疾病，以糖耐量異常、脂質(zhì)代謝異常為特征的胰島素抵抗貫穿于2 型糖尿病的始終。胰島素抵抗是指各種原因引起的外周組織對(duì)胰島素的敏感性降低，利用葡萄糖不足[7]，主要累及肝臟、脂肪、肌肉等組織，其中脂肪組織分泌的脂肪因子在機(jī)制中占重要地位[8-9]。SFPS 是羊棲菜中的多糖成分，具有抗菌、增強(qiáng)免疫力，調(diào)節(jié)脂代謝等作用[10-11]，因此，本實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步研究SFPS 對(duì)3T3-L1 細(xì)胞胰島素抵抗的作用并初步探討其作用機(jī)制。

葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（glucose transporter，GLUT）是組織細(xì)胞利用調(diào)節(jié)葡萄糖的重要蛋白，家族重要成員GLUT4 在脂肪、肝臟等組織中均有表達(dá)，GLUT4 蛋白將細(xì)胞外葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞內(nèi)[12-13]，對(duì)胰島素反應(yīng)敏感。已有研究顯示，胰島素抵抗的脂肪細(xì)胞膜上GLUT4 表達(dá)減少，與胰島素抵抗密切相關(guān)[14-15]。為了研究SFPS 對(duì)3T3-L1 細(xì)胞胰島素抵抗的影響，造模成功的細(xì)胞培養(yǎng)液中加入不同濃度的SFPS。本研究中，與模型組比較，SFPS 100 和200 mg/L 組細(xì)胞中GLUT4mRNA 的表達(dá)量顯著增加，表明SFPS 可通過增加GLUT4mRNA 的表達(dá)，改善3T3-L1 中胰島素抵抗。激素敏感性脂肪酶(hormone-sensitive triglayceride lipase，HSL)是脂肪分解的限速酶之一，在脂肪組織中受多種激素的調(diào)控，主要催化甘油三脂分解為甘油和脂肪酸[16]。為了研究SFPS對(duì)3T3-L1 細(xì)胞中甘油三酯分解利用的影響，造模成功的細(xì)胞培養(yǎng)液中加入不同濃度的SFPS。本研究中，與模型組比較，SFPS 100 和200 mg/L 組細(xì)胞中HSL mRNA 的表達(dá)量顯著降低，表明SFPS 可通過降低HSL mRNA 的表達(dá)，抑制3T3-L1 中脂質(zhì)的分解利用。

本研究結(jié)果顯示：①SFPS 能顯著增加胰島素抵抗3T3-L1 細(xì)胞葡萄糖消耗量，顯著降低胰島素抵抗3T3-L1 細(xì)胞生成FFA 的量。②SFPS 能顯著增加GLUT-4 mRNA 的表達(dá)，顯著降低HSL mRNA 的表達(dá)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示，SFPS 改善3T3-L1 脂肪細(xì)胞胰島素抵抗的分子機(jī)制可能與調(diào)控GLUT-4 和HSL mRNA 的表達(dá)有關(guān)。