郎鵬，時(shí)曉丹，張軍強(qiáng)

精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)是一種將個(gè)人基因、環(huán)境與生活習(xí)慣差異考慮在內(nèi)的疾病預(yù)防與處置的新興方法，其本質(zhì)是通過基因組、蛋白質(zhì)組等組學(xué)技術(shù)和二代測(cè)序等醫(yī)學(xué)前沿技術(shù)，對(duì)大樣本人群與特定疾病類型進(jìn)行生物標(biāo)記物的分析與鑒定、驗(yàn)證與應(yīng)用，從而精確尋找到疾病的原因和治療的靶點(diǎn)，并對(duì)一種疾病不同狀態(tài)和過程進(jìn)行精確分類，最終實(shí)現(xiàn)對(duì)于疾病和特定患者進(jìn)行個(gè)性化精準(zhǔn)治療的目的，提高疾病診治與預(yù)防的效益[1]。自2015年初前美國(guó)總統(tǒng)奧巴馬在美國(guó)國(guó)情咨文中提出“精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)計(jì)劃”以來[2]，精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)的概念迅速傳播普及，已成為未來醫(yī)學(xué)的發(fā)展方向，開啟了醫(yī)學(xué)發(fā)展的新時(shí)代。近年來，生殖醫(yī)學(xué)的飛速發(fā)展也得益于精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)概念的普及，高通量測(cè)序、全基因組關(guān)聯(lián)研究（genome-wide association studies，GWAS）、生物大數(shù)據(jù)分析等成功用于不孕不育癥的診斷、遺傳病檢測(cè)和胚胎植入前遺傳學(xué)檢測(cè)（pre-implantation genetic testing，PGT）等臨床實(shí)踐是目前精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)臨床應(yīng)用的典范。本文主要對(duì)精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)在輔助生殖領(lǐng)域的應(yīng)用以及目前得到的一些成果進(jìn)行綜述。

1 精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)與多囊卵巢綜合征（PCOS）

PCOS是一種臨床表現(xiàn)多樣、激素變化不一的生殖內(nèi)分泌和代謝異常綜合征，影響著5%～10%的育齡期女性，臨床表現(xiàn)主要包括無排卵或稀發(fā)排卵、月經(jīng)不調(diào)、高雄激素血癥以及不孕等[3]。早在1935年Stein和Leventhal就提出了這一綜合征，但時(shí)隔85年，其致病原因尚不清楚，臨床表現(xiàn)高度異質(zhì)，診斷標(biāo)準(zhǔn)、治療方案均未達(dá)到統(tǒng)一[4]。

山東大學(xué)陳子江團(tuán)隊(duì)通過GWAS確定了中國(guó)漢族婦女的11個(gè)基因座與PCOS有很強(qiáng)的相關(guān)性，包括17個(gè)單核苷酸多態(tài)性（SNPs）[5-6]。隨后有外國(guó)學(xué)者在白種人中驗(yàn)證了這17個(gè)位點(diǎn)，確認(rèn)了其中12個(gè)位點(diǎn)存在同樣的風(fēng)險(xiǎn)效應(yīng)，表明這些位點(diǎn)在不同人群中具有類似的遺傳效應(yīng)，但是這些位點(diǎn)出現(xiàn)的概率在不同人群中是不同的[7]。Jones等[8]研究發(fā)現(xiàn)，非肥胖PCOS患者STON1-GTF2A1L基因和LHCGR基因表達(dá)增加，而肥胖PCOS患者胰島素受體基因（INSR）的表達(dá)下降，表明肥胖PCOS患者和非肥胖PCOS患者之間的基因表達(dá)也是不同的。

近年來，越來越多的研究發(fā)現(xiàn)微小RNA（miRNA）在PCOS患者的卵泡膜細(xì)胞、顆粒細(xì)胞、卵泡液等中異常表達(dá)，并且影響機(jī)體內(nèi)許多重要的生物過程[9]。McAllister等[10]通過小RNA深度測(cè)序技術(shù)發(fā)現(xiàn)PCOS患者卵泡膜細(xì)胞中存在18個(gè)差異表達(dá)的miRNA，其中，miR-130b-3p與PCOS患者DENND1A.V2和CYP17A1的表達(dá)相關(guān)，生物信息學(xué)分析顯示miR-130b-3p可能的作用靶點(diǎn)與PCOS患者的高雄激素血癥有關(guān)。有研究發(fā)現(xiàn)miR-126-5p和miR-29a-5p表達(dá)在PCOS患者中顯著降低，其可通過Klotho信號(hào)通路影響PCOS患者的顆粒細(xì)胞凋亡[11]。miR-27a-3p在PCOS患者的顆粒細(xì)胞中表達(dá)顯著升高，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)其表達(dá)異?？赡苁怯捎赑COS患者的胰島素抵抗導(dǎo)致，為研究PCOS患者顆粒細(xì)胞功能障礙提供了重要線索[12]。

因此，結(jié)合最新發(fā)現(xiàn)的基因?qū)用娴淖兓约盎ヂ?lián)網(wǎng)大數(shù)據(jù)對(duì)我國(guó)PCOS表型、癥狀和診斷策略進(jìn)行全面綜合評(píng)價(jià)和判定，融入精準(zhǔn)醫(yī)療的理念，才能在臨床上更加精確地做出PCOS的診斷，對(duì)不同患病人群給出更加精準(zhǔn)的建議，實(shí)現(xiàn)個(gè)性化治療。

2 精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)與人類配子/胚胎發(fā)育障礙

關(guān)于人類配子和早期胚胎發(fā)育異常在基因?qū)用娴难芯恳恢焙苌?，隨著體外受精（IVF）技術(shù)和測(cè)序技術(shù)的發(fā)展及其廣泛應(yīng)用，人類配子及早期胚胎發(fā)育的過程現(xiàn)在可以更加精準(zhǔn)地進(jìn)行評(píng)價(jià)和研究。

復(fù)旦大學(xué)王磊團(tuán)隊(duì)收集在輔助生殖治療過程中發(fā)現(xiàn)的卵子及早期胚胎發(fā)育異常特殊病例，相繼發(fā)現(xiàn)了卵子成熟障礙的第一個(gè)致病基因TUBB8[13]、第二個(gè)致病基因PATL2[14]及與人類早期胚胎停育相關(guān)的第一個(gè)致病基因PADI6[15]。同時(shí)，該研究團(tuán)隊(duì)先后在4個(gè)受精障礙患者家系中發(fā)現(xiàn)WEE2基因存在不同的純合突變，通過進(jìn)一步研究揭示了WEE2突變的致病機(jī)制，WEE2突變通過破壞CDC2及WEE2蛋白自身的磷酸化使得成熟促進(jìn)因子（maturationpromoting factor，MPF）活性升高，進(jìn)而導(dǎo)致第二次減數(shù)分裂中期（MⅡ）卵子激活障礙，最終引起授精失敗[16]。后續(xù)對(duì)患者卵子成功進(jìn)行了分子干預(yù)，逆轉(zhuǎn)了受精障礙表型，為此類患者未來的基因治療奠定了基礎(chǔ)。最近，該團(tuán)隊(duì)對(duì)4個(gè)在IVF/胞漿內(nèi)單精子注射（ICSI）受精前后一段時(shí)間內(nèi)出現(xiàn)卵子退化凋亡的病例展開研究，發(fā)現(xiàn)糖基化蛋白PANX1相關(guān)基因突變，引起PANX1通道異常激活，加速了卵子內(nèi)部ATP釋放，最終導(dǎo)致卵子死亡，并明確“卵子死亡”是一種新的孟德爾顯性遺傳病[17]。

此外，還有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)確保卵母細(xì)胞表觀基因組正確建立的核心調(diào)控因子SETD2，在卵母細(xì)胞中特異性敲除SETD2，卵母細(xì)胞中表觀遺傳修飾的分布情況發(fā)生了巨大改變[18]。通過對(duì)SETD2的深入研究系統(tǒng)地闡明了表觀遺傳修飾之間如何通過相互作用建立包括基因印記的卵子表觀基因組，及其如何對(duì)早期胚胎發(fā)育產(chǎn)生至關(guān)重要的影響。

人類卵子及早期胚胎發(fā)育中隱藏著大量前所未知的新基因，在輔助生殖治療過程中，對(duì)那些發(fā)育異常的卵子和胚胎在基因?qū)用孢M(jìn)一步診斷和治療，以實(shí)現(xiàn)輔助生殖中的精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)。

3 精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)與男性不育

在全世界約15%的不孕不育夫婦中，有近乎一半是由男性原因?qū)е碌腫19]。隨著遺傳學(xué)檢測(cè)技術(shù)和組學(xué)分析技術(shù)的發(fā)展，臨床上對(duì)男性不育的檢測(cè)和治療愈發(fā)精準(zhǔn)高效。當(dāng)前，對(duì)不育癥患者基因缺陷方面的檢查主要包括染色體分析、Y染色體特定缺陷篩查[如無精子癥因子（AZF）缺失]、囊性纖維化跨膜傳導(dǎo)調(diào)節(jié)因子（CFTR）突變檢測(cè)、先天性低促性腺激素所致性腺功能減退癥相關(guān)的基因檢測(cè)[20]。

最近有研究對(duì)實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（qPCR）擴(kuò)增后的無精癥患者精漿外泌體miRNA做高通量表達(dá)譜分析發(fā)現(xiàn)，miR-31-5p、miR-539-5p和miR-941可能可以作為預(yù)測(cè)無精癥的標(biāo)志物[21]。

隨著蛋白組學(xué)技術(shù)的發(fā)展，對(duì)精液和精漿蛋白組學(xué)的研究也越來越深入。已經(jīng)通過組學(xué)分析證實(shí)精液或精漿中的一些蛋白可以作為無精癥的生物標(biāo)志物，其中PTGDS、ACRV1、ECM1和TEX101已經(jīng)得到驗(yàn)證和應(yīng)用[22]。最近有學(xué)者對(duì)精索靜脈曲張的精子線粒體進(jìn)行蛋白組學(xué)分析，確定了22個(gè)與精子線粒體結(jié)構(gòu)和功能相關(guān)的差異表達(dá)蛋白，這些蛋白通過影響線粒體結(jié)構(gòu)和功能可能進(jìn)一步導(dǎo)致氧化應(yīng)激，從而影響精子質(zhì)量。分析這些差異表達(dá)標(biāo)志物將有助于預(yù)測(cè)精索靜脈曲張患者的不育趨勢(shì)，以及為后續(xù)的抗氧化治療提供靶向路徑[23]。

4 精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)在PGT中的應(yīng)用

以往用于PGT的方法主要有熒光原位雜交（FISH）、比較基因組雜交（CGH）、微陣列比較基因組雜交（microarray-CGH）和SNPs芯片。近年來，隨著高通量測(cè)序技術(shù)、單細(xì)胞全基因組擴(kuò)增（single-cell whole genome amplification，eWGA）及其衍生技術(shù)的出現(xiàn)，植入前遺傳學(xué)診斷不斷向高分辨率、高特異性、無創(chuàng)的方向發(fā)展，同時(shí)分析單基因病和進(jìn)行全面染色體診斷也成為可能[24]。

eWGA是指在單細(xì)胞水平對(duì)全基因組進(jìn)行擴(kuò)增的新技術(shù)。應(yīng)用到PGT中，就可通過分析植入前胚胎中的單個(gè)細(xì)胞推斷出卵子本身的全部基因組信息，從而減少先天性遺傳缺陷嬰兒的出生，降低輔助生殖的醫(yī)源性風(fēng)險(xiǎn)。多次退火環(huán)狀循環(huán)擴(kuò)增技術(shù)（MALBAC）是一種全新的eWGA方法，該方法均一性高、等位基因脫扣率低、重現(xiàn)性好[25]。近年來有研究報(bào)道通過MALBAC-PGT對(duì)1例攜帶遺傳性多囊腎基因（PKD1）患者的胚胎進(jìn)行基因診斷，篩選出一個(gè)不帶致病基因的胚胎進(jìn)行移植，最終獲得了一個(gè)健康后代[26]。

基于高通量測(cè)序及MALBAC技術(shù)，北京大學(xué)謝曉亮團(tuán)隊(duì)開發(fā)出“高通量測(cè)序揭示突變等位基因同時(shí)進(jìn)行染色體異常和連鎖分析（MARSALA）”的方法，通過對(duì)MALBAC擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行PCR擴(kuò)增檢測(cè)單基因疾病相關(guān)的單核苷酸變異（single-nucleotide variant，SNV）、拷貝數(shù)變異（copy number variation，CNV）以及非整倍體變異，檢測(cè)中的假陽性和假陰性可以采用基于高通量測(cè)序的連鎖分析規(guī)避；采用該方法，該團(tuán)隊(duì)對(duì)一個(gè)父方含有常染色體單堿基突變和一個(gè)母方含有X染色體單堿基突變的胚胎做精準(zhǔn)選擇，成功誕生兩個(gè)沒有繼承父母單基因疾病的健康嬰兒[27]。

長(zhǎng)讀長(zhǎng)測(cè)序是近年來出現(xiàn)的基于高通量測(cè)序的檢測(cè)方法，其具有超長(zhǎng)讀長(zhǎng)、極低GC偏好性等優(yōu)勢(shì)，可以精確檢測(cè)結(jié)構(gòu)變異、串聯(lián)重復(fù)序列，不過其應(yīng)用成本相對(duì)較高，檢測(cè)時(shí)間也偏長(zhǎng)。Miao等[28]通過Nanopore全基因組長(zhǎng)讀長(zhǎng)測(cè)序技術(shù)，發(fā)現(xiàn)了以往短讀測(cè)序未能捕獲到的G6PC等位基因上的7.1 kb雜合缺失，結(jié)合短讀測(cè)序檢測(cè)到的另一個(gè)等位基因上的點(diǎn)突變，鑒定出患者家系常染色體隱性遺傳的Ⅰa型糖原貯積病的發(fā)病原因和致病基因來源，聯(lián)合qPCR和微衛(wèi)星連鎖分析篩選出僅攜帶母源點(diǎn)突變的胚胎進(jìn)行移植，最后成功分娩一個(gè)健康女嬰。

在精準(zhǔn)醫(yī)療的發(fā)展中，PGT無疑是最為重要的部分之一。技術(shù)的進(jìn)步使得PGT能更精準(zhǔn)地篩查出最合適的胚胎移植到母體，提高遺傳病家庭生育健康子代的可能。

5 輔助生殖領(lǐng)域中的大數(shù)據(jù)

5.1 輔助生殖與基因組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)2003年第一個(gè)人類基因組計(jì)劃的完成敲開了后基因組時(shí)代和基因組醫(yī)學(xué)的大門，生殖醫(yī)學(xué)也迅速地進(jìn)入了后基因組時(shí)代的應(yīng)用領(lǐng)域，我國(guó)的基因組分析技術(shù)走在世界前列，基因組分析技術(shù)已成功應(yīng)用于對(duì)人卵母細(xì)胞和早期胚胎發(fā)育的研究。北京大學(xué)喬杰研究組和湯富酬研究組合作，利用微量細(xì)胞甚至單個(gè)細(xì)胞DNA甲基化高通量測(cè)序技術(shù)首次解析了人類早期胚胎的DNA甲基化調(diào)控網(wǎng)絡(luò)[29]；后期又揭示了人類早期胚胎DNA去甲基化和從頭加甲基化的動(dòng)態(tài)變化、父母本基因組差異甲基化等關(guān)鍵特征，精確繪制了人類植入前胚胎和胎兒生殖細(xì)胞發(fā)育過程中的轉(zhuǎn)錄組、DNA甲基化組圖譜[30]。這一系列研究成果對(duì)于加深對(duì)人類早期胚胎發(fā)育表觀遺傳調(diào)控機(jī)制的認(rèn)識(shí)、改進(jìn)輔助生殖技術(shù)的安全性評(píng)估以及促進(jìn)臨床上早期胚胎發(fā)育異常疑難病例的診治具有非常重要的意義。

上海同濟(jì)大學(xué)薛志剛和南京醫(yī)科大學(xué)劉嘉茵等學(xué)者利用單細(xì)胞RNA測(cè)序技術(shù)，全面分析了鼠、人類卵母細(xì)胞以及早期胚胎不同發(fā)育階段基因轉(zhuǎn)錄組的動(dòng)態(tài)變化，發(fā)現(xiàn)胚胎早期發(fā)育各階段均存在母源或父源的單等位基因表達(dá)差異；胚胎早期發(fā)育各階段關(guān)于細(xì)胞周期、基因調(diào)控、蛋白質(zhì)翻譯以及代謝通路的基因轉(zhuǎn)錄變化以逐步啟動(dòng)的方式依序發(fā)生，胚胎早期發(fā)育由一些階段特異的關(guān)鍵樞紐基因來驅(qū)動(dòng)[31]。這些研究結(jié)果闡明了哺乳動(dòng)物早期胚胎不同發(fā)育階段轉(zhuǎn)錄組表達(dá)的特點(diǎn)，對(duì)于探討人類胚胎發(fā)育機(jī)制、對(duì)人類胎源性疾病的臨床診斷、預(yù)防和治療均具有重要意義。

5.2 大數(shù)據(jù)用于輔助生殖領(lǐng)域的臨床研究隨著互聯(lián)網(wǎng)時(shí)代的到來，醫(yī)療和健康數(shù)據(jù)越來越系統(tǒng)地被收集，并鏈接生物和基因數(shù)據(jù)庫，產(chǎn)生了具有海量的數(shù)據(jù)規(guī)模、高速的數(shù)據(jù)流轉(zhuǎn)、多樣的數(shù)據(jù)類型等特征的醫(yī)學(xué)“大數(shù)據(jù)”。這些大范圍的大數(shù)據(jù)研究具有很高的代表性和統(tǒng)計(jì)效能，通過分析和比對(duì)這些數(shù)據(jù)實(shí)現(xiàn)生殖醫(yī)學(xué)領(lǐng)域更高效益、更細(xì)致、更全面的研究，幫助實(shí)現(xiàn)最理想的孕育目標(biāo)。

Yu等[32]從上海市疾控中心出生登記數(shù)據(jù)庫中統(tǒng)計(jì)分析了2005—2016年誕生的共2 243 125例活產(chǎn)嬰兒，其中6 372例是通過輔助生殖技術(shù)誕生的，包括1 363例IVF鮮胚移植、2 012例凍胚IVF移植、1 063例ICSI鮮胚移植和1 934例ICSI凍胚移植，研究發(fā)現(xiàn)通過輔助生殖技術(shù)尤其是通過ICSI誕生的嬰兒，性別為女性的可能性提高，也更有可能是多胎妊娠的產(chǎn)兒；通過輔助生殖技術(shù)出生的嬰兒面臨著更高的出生缺陷風(fēng)險(xiǎn)，但這些風(fēng)險(xiǎn)在凍胚移植和鮮胚移植之間的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，還需要更大樣本的研究來驗(yàn)證。

美國(guó)杜卡大學(xué)的一項(xiàng)研究利用輔助生殖技術(shù)注冊(cè)協(xié)會(huì)（SART）收集的數(shù)據(jù)來比較鮮胚移植和凍胚移植臨床妊娠率和活產(chǎn)率的差異，該研究分析了82 935例胚胎移植（ET）者的移植周期，其中69 102例患者為首次鮮胚移植、13 833例患者為首次凍胚移植，結(jié)果顯示在卵巢低反應(yīng)和中反應(yīng)人群中鮮胚移植的妊娠率和活產(chǎn)率高于凍胚移植，而卵巢高反應(yīng)人群的結(jié)果卻相反[33]。

5.3 輔助生殖領(lǐng)域中的人工智能（artificial intelligence，AI）輔助生殖實(shí)驗(yàn)室最重要的工作是預(yù)測(cè)和鑒定最有活力和發(fā)育潛能的卵母細(xì)胞或胚胎用于移植，胚胎學(xué)家通過視覺檢查、利用形態(tài)學(xué)特征對(duì)胚胎進(jìn)行分級(jí)，已被成熟地應(yīng)用于臨床胚胎篩選工作當(dāng)中，但這種通過形態(tài)學(xué)評(píng)估胚胎的方法具有高度主觀性，在整個(gè)行業(yè)乃至單個(gè)中心都沒有統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)[34]。最近AI提取圖像紋理描述符的能力快速提升，在IVF-ET過程中用于卵母細(xì)胞或胚胎選擇的AI方法已經(jīng)顯示出越來越大的優(yōu)勢(shì)[35]。

Saeedi等[36]采用自動(dòng)算法對(duì)第5天囊胚特有的生物紋理信息和物理特征進(jìn)行分析，自動(dòng)分割出內(nèi)細(xì)胞 團(tuán) （inner cell mass，ICM） 和 滋 養(yǎng) 外 胚 層（trophectoderm，TE）的區(qū)域范圍。在211枚囊胚中，通過對(duì)ICM和TE的自動(dòng)分割及紋理特征的分析，對(duì)TE的識(shí)別準(zhǔn)確率為86.6%，對(duì)ICM識(shí)別的準(zhǔn)確率為91.3%。

Tran等[37]創(chuàng)建了一個(gè)名為IVY的深度學(xué)習(xí)模型（deep learning model），這是一個(gè)客觀的、完全自動(dòng)化的系統(tǒng)，其直接從原始的胚胎時(shí)差成像數(shù)據(jù)（timelapse imaging）來預(yù)測(cè)妊娠，而不需要手動(dòng)添加任何有關(guān)形態(tài)發(fā)生的注釋或囊胚形態(tài)評(píng)估數(shù)據(jù)。該研究對(duì)來自4個(gè)國(guó)家8個(gè)IVF中心2014年1月—2018年12月10 638個(gè)胚胎的第5天囊胚期時(shí)差成像數(shù)據(jù)和臨床結(jié)局進(jìn)行回顧性分析，運(yùn)用IVY預(yù)測(cè)妊娠真陽性率與假陽性率，其準(zhǔn)確率曲線下面積（AUC）為0.93，并且具有高度的可重復(fù)性。

美國(guó)Khosravi等[38]研究實(shí)現(xiàn)了基于深層神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)（DNNs）的AI方法來選擇最優(yōu)質(zhì)的胚胎，該研究根據(jù)Google的初始模型構(gòu)建一個(gè)基于DNNs的STORK框架，對(duì)美國(guó)康奈爾大學(xué)醫(yī)學(xué)院生殖醫(yī)學(xué)中心的10 148枚胚胎超過50 000張時(shí)差成像圖片識(shí)別胚胎質(zhì)量，準(zhǔn)確率達(dá)到95%以上，遠(yuǎn)遠(yuǎn)優(yōu)于單個(gè)胚胎學(xué)家的判斷。這種STORK框架是完全自動(dòng)的，并不需要對(duì)輸入圖像進(jìn)行任何手動(dòng)擴(kuò)充或預(yù)處理，更不需要復(fù)雜的計(jì)算公式，具有很高的普適性。該研究還根據(jù)2 082枚胚胎的臨床數(shù)據(jù)構(gòu)建了一個(gè)名叫CHAID的智能決策樹，能夠通過培養(yǎng)中的胚胎質(zhì)量結(jié)合患者年齡來預(yù)測(cè)臨床妊娠率。

6 結(jié)語與展望

不孕不育已成為僅次于腫瘤和心腦血管疾病的第三大疾病，生殖健康更是當(dāng)今世界的重大課題，受到國(guó)際社會(huì)的廣泛關(guān)注。明確不孕不育癥的病因，提高輔助生殖中篩選胚胎的精準(zhǔn)度，開發(fā)出具有針對(duì)性的精準(zhǔn)治療顯得尤其必要和意義重大。輔助生殖的發(fā)展已和精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)的理念密不可分，加快新一代測(cè)序技術(shù)、大數(shù)據(jù)分析、人工智能等技術(shù)應(yīng)用于臨床，生殖醫(yī)學(xué)必將迎來新的紀(jì)元。