伏玉潔，孫小燕，張學紅

卵巢是女性主要的內分泌和生殖器官。在青春期雙側卵巢約有40萬個原始卵泡。卵泡在女性35歲后消耗速度加快，到40歲時僅剩余25 000個[1]。在既定范圍內與年齡相符的功能性卵巢儲備下降稱為生理性卵巢衰老（normal ovarian aging，NOA）。大約有1%的女性會在40歲前出現(xiàn)卵巢內卵泡提前耗竭，月經(jīng)稀發(fā)或閉經(jīng)＞4個月，間隔4周的2次血清卵泡刺激素（follicle-stimulatinghormone，F(xiàn)SH）水平均＞25IU/L，稱為早發(fā)性卵巢功能不全（premature ovarian insufficiency，POI）。而POI的更嚴重階段為卵巢早衰（premature ovarian failure，POF），表現(xiàn)為40歲以前出現(xiàn)閉經(jīng)、FSH＞40 IU/L、雌激素水平降低，并伴有不同程度的圍絕經(jīng)期癥狀[2-3]。卵泡的消耗速度在女性之間有個體差異，取決于許多因素，如遺傳、年齡、藥物和環(huán)境等。POI影響全身多個系統(tǒng)和器官，導致相關疾病和綜合征的發(fā)生[4]。主要表現(xiàn)為月經(jīng)失調、潮熱、關節(jié)疼痛和失眠等不適。POI患者自發(fā)受孕的機會非常有限，受孕可能性在4%～8%[5]。POI的治療方法包括激素替代、補充褪黑激素、免疫調節(jié)和干細胞治療等[6]。雖然促排卵治療、輔助生殖技術、贈卵和移植卵巢組織等技術也給有生育要求的POI患者帶來生殖希望，但都不能從根本上治療POI。目前，研究POI的發(fā)病機制及治療方式主要依據(jù)POI動物模型，結合當前研究現(xiàn)狀和已發(fā)表文獻，本文對常見模型做一總結。

1 免疫反應誘導的POI模型

自身免疫性卵巢疾病（autoimmune ovariandisease，AOD）是POI的常見病因之一，約占20%，常與循環(huán)中的抗卵巢抗體有關[7]。理論上免疫應答可以靶向作用于卵泡顆粒層、卵泡膜和透明帶等卵巢成分。POI患者同時伴有一種或多種自身免疫性疾病，其中自身免疫性POI與原發(fā)性腎上腺皮質功能不全的伴發(fā)率高達10%～23%。目前認為POI不僅是一種自身免疫性疾病，也可能是全身自身免疫性疾病累及卵巢后的表現(xiàn)[8]。免疫反應致POI的造模成功率高，方法簡單，主要用于免疫原因與卵巢功能不全的研究。

1.1 透明帶3多肽（zona pellucida glycoprotein 3，pZP3）構建POI模型pZP3引起B(yǎng)6AF1（4周齡）、BALB/c和C57BL/6小鼠（7～8周齡）實驗性自身免疫性卵巢炎（experimentalautoimmuneoophorits，EAO）[7，9-10]。制備過程：具有正常動情周期的小鼠皮下注射經(jīng)過完全弗氏佐劑乳化，濃度為50 nmol/L的pZP3，0.16 mg/小鼠，2周后皮下注射經(jīng)不完全弗氏佐劑乳化的，相同劑量的pZP3。1周后根據(jù)血清抗透明帶抗體（anti zona pellucida antibody，AZPAb）證實免疫反應，如為陽性，提示造模成功[9]。此外，從給藥當天至實驗結束小鼠安樂死日，每日行陰道細胞學檢查，當出現(xiàn)不規(guī)則的動情周期也可反映造模成功[10]。處死小鼠后觀察卵巢形態(tài)并計數(shù)卵泡（卵巢纖維化加劇，卵泡數(shù)量減少），以及比較實驗前后血清FSH水平升高，雌二醇（estradiol，E2）水平下降也可提示造模成功[9-10]。利用此模型發(fā)現(xiàn)人胎盤間充質干細胞[9-10]、人羊膜上皮細胞[7]對自身免疫性POI小鼠的卵巢功能具有恢復作用。

1.2 新生胸腺摘除小鼠誘發(fā)EAO先天無胸腺小鼠具有垂體-性腺軸發(fā)育異常、延遲性成熟、生育力低下和生殖期較短的特征。新生小鼠在出生后第2～5天行全胸腺摘除術，在術后第28天可檢測到卵巢自身抗體。在術后第4～14周卵巢產(chǎn)生伴隨卵泡閉鎖的EAO。在術后14周活動性炎癥消退后，發(fā)生卵巢萎縮。通過此模型發(fā)現(xiàn)從免疫功能損害發(fā)生到卵巢組織學改變存在較明確的窗口期（即術后1～4周）[11]，在術后早期階段足夠數(shù)量的調節(jié)性T細胞可以改善AOD的卵巢損害[12]。上述發(fā)現(xiàn)為AOD的早期治療與預防提供了重要線索。

1.3 用抑制素α的p215-245肽免疫SWXJ雌性小鼠誘導的EAO6～8周齡SWXJ雌性小鼠經(jīng)腹部皮下注射200 μg的抑制素α的p215-245肽，免疫后7～9周的小鼠表現(xiàn)為生育力顯著提高，而免疫后43～45周時，卵巢組織顯著萎縮，免疫反應減少了抑制素介導的FSH釋放的下調，加速卵泡池耗竭[13]。這對于理解人類POI的發(fā)生和開發(fā)用于治療自身免疫介導的不育癥的有效替代療法具有重大意義。

2 化學治療藥物誘導的POI模型

化療藥物模型是研究POI的經(jīng)典模型?；熕幍姆沁x擇性分布給身體各器官系統(tǒng)帶來諸多毒副反應?；煂π韵俚挠绊懸蛩技膊〉念愋?、藥物種類、用藥方案和累積劑量等因素的不同而不同[14]。最近的研究揭示了化療藥物如何影響卵巢的不同細胞成分，誘導原始卵泡死亡、損害血管與基質腔室、加速卵泡活化及增加卵泡閉鎖[15-19]。

環(huán)磷酰胺（Cyclophosphamide，CPA）單次腹膜內注射（150 mg/kg）到出生后第5天的3種品系（CD-1，C57BL/6J和BALB/cJ）小鼠，分別在第1、3和7天后摘取卵巢組織。發(fā)現(xiàn)CPA特異性誘導原始卵泡凋亡，不會將原始卵泡激活到生長卵泡池中。卵巢組織體外培養(yǎng)實驗發(fā)現(xiàn)CPA代謝產(chǎn)物4-HC通過激活細胞凋亡途徑破壞原始卵泡，凋亡抑制劑（ETP-46464和CK2II）可保護卵泡免受4-HC在體外的損害作用[15]。這為進一步研究對抗化療藥物毒性作用的候選性腺保護劑提供了新的思路。

在6周齡的雌性瑞士小鼠單次腹膜內注射CPA（150 mg/kg） 伴或不伴重組抗苗勒管激素（anti-Müllerian hormone，AMH，0.5 mg/kg），分別在給藥后24 h和第8天摘取卵巢組織。發(fā)現(xiàn)CPA通過磷脂酰肌醇激酶（PI3K)/磷酸酯酶與張力蛋白同源物（PTEN）/蛋白激酶（AKT）信號通路使卵泡募集增加。AMH可通過抑制叉頭轉錄因子O3a（FOXO3a）的磷酸化和核輸出，減少CPA引起的原始卵泡的活化[16]。CPA（75 mg/kg）和AMH（0.5 mg/kg）聯(lián)合治療小鼠4周，發(fā)現(xiàn)共同用藥可以改善CPA治療小鼠的繁殖力。由于AMH僅由卵巢產(chǎn)生，并通過由卵巢表達的特異性受體起作用，因此AMH可能是保護卵巢儲備和提高生育力的靶向治療藥物[16]。

6周齡的C57BL/6雌性小鼠經(jīng)腹腔連續(xù)注射順鉑（2～2.5 mg/kg）7 d可誘導POI發(fā)生，通過動情周期與卵巢組織學變化判斷成模[17]。造模期間4-苯基丁酸（150 mg·kg-1·d-1）與順鉑的同時給藥，發(fā)現(xiàn)4-苯基丁酸通過減輕內質網(wǎng)應激來防止順鉑誘導的顆粒細胞凋亡和卵巢損傷[17]。5周齡的雌性CD-1小鼠經(jīng)腹腔連續(xù)注射順鉑（2 mg/kg）伴或不伴褪黑素（15～30 mg/kg）治療15 d，發(fā)現(xiàn)褪黑素通過抑制小鼠卵巢中的PTEN/AKT/FOXO3a途徑激活來防止順鉑誘導的原始卵泡丟失[18]。

在3周齡CD-1雌性小鼠單次腹膜內注射劑量為10 mg/kg的蒽環(huán)類抗生素多柔比星（doxorubicin，DOX），發(fā)現(xiàn)DOX通過原始卵泡閉鎖和過度激活來降低卵巢儲備功能。通過與5日齡、8周齡小鼠比較，發(fā)現(xiàn)DOX具有年齡依賴性的卵巢毒性作用。故臨床用藥需著重考慮癌癥治療期間使用DOX增加年輕女性癌癥患者POI的發(fā)生風險，需重點預防原始卵泡的閉鎖和過度活化以保存生育力[19]。

在8周齡的Wistar雌性大鼠的動情周期第1天，經(jīng)腹腔注射白消安（36 mg/kg），在給藥4周后摘取卵巢組織通過組織病理學與血清學檢測判斷POF成模。通過此模型發(fā)現(xiàn)人子宮內膜間充質干細胞（經(jīng)尾靜脈注射），主要通過遷移至未成熟卵泡的顆粒細胞層并分化為顆粒細胞，進而改善卵泡發(fā)育和激素的分泌[20]。這為干細胞移植治療POI提供了新的實驗依據(jù)。

化療導致POI模型的效果與化療劑量及持續(xù)時間有關，隨著化療時間延長，卵巢功能有自然恢復的可能性，不適合進行長期的探索性研究。但隨著模型動物體內外實驗對細胞毒性藥物的深入研究，新的生育力保存方法不斷被開發(fā)，這些研究有助于進一步了解卵巢損傷的機制和途徑。

3 放射治療誘導的POI模型

POI是癌癥放療的常見遠期并發(fā)癥。經(jīng)過X射線放療后，卵巢較全身其他器官損傷嚴重，在人和動物其嚴重程度均取決于輻照劑量和年齡，年齡越小，卵巢對放療越敏感，損傷也越大。8周齡的C57BL/6J小鼠以4 Gy為最低適宜劑量，單次全身X射線輻照后7～14 d能夠成功建立小鼠POI模型[21]。8 Gy的γ-射線單次全身輻照后20 d內無一例小鼠存活[22]。以小鼠的體質量、卵巢濕質量、激素水平、卵泡計數(shù)，以及全身各臟器形態(tài)學變化和動情周期變化判斷成模[21]。通過以上模型發(fā)現(xiàn)曲酸在體內和體外均具有顯著的放射防護作用[22]。該造模時間短、成功率高、死亡率低，為探討放療致POI的病理表現(xiàn)和發(fā)病機制提供了較可靠的實驗動物模型。

4 基因突變與基因編輯構建的POI動物模型

遺傳因素在女性POI中占20%～25%[23]。最常見的遺傳因素是X染色體連鎖缺陷，如特納綜合征[24]。單基因異常，包括X染色體上的基因如骨形態(tài)發(fā)生蛋白15（BMP15）基因[24-25]、脆性X智力低下1（FMR1）基因[26]和常染色體上的基因，如生長分化因子9（GDF9）基因[25]、新生兒卵巢同源盒（NOBOX）基因[24]、雌激素受體1（ESR1）基因[24]和卵泡刺激素受體（FSHR）基因[27]與POI呈正相關。在POI譜系中分離出的POI致病基因主要參與DNA損傷修復、同源重組和減數(shù)分裂，包括安樂鄉(xiāng)綜合征B-PiggyBac轉座子3（CSBPGBD3）融合基因、微小染色體微粒蛋白8（MCM8）基因、錯配修復蛋白5（MSH5）基因和基質抗原3（STAG3）基因等[28]。

對于FMR1基因敲除小鼠（FMR1-/-）的研究已二十余年，F(xiàn)MR1-/-小鼠表現(xiàn)出因原始卵泡的活化增加的生育力過早下降。FMR1-/-小鼠雷帕霉素靶蛋白（mTOR，PI3K途徑中的一種蛋白激酶）活性升高。經(jīng)雷帕霉素（mTOR拮抗劑）治療的FMR1-/-小鼠的卵巢表型和蛋白質水平發(fā)生逆轉，以及經(jīng)雷帕霉素治療的野生型小鼠的生殖壽命延長，表明mTOR途徑是潛在的POI治療靶點[26]。ESR1基因敲除小鼠表現(xiàn)出因卵泡成熟受損的生育力過早喪失，ESR1基因被認為是POI的潛在候選基因[24]。NOBOX基因敲除小鼠的POU結構域5類轉錄因子1（POU5F1）基因被顯著下調，使NOBOX基因成為研究POI的理想基因[24]。Basonuclin-1（BNC1）基因突變小鼠表現(xiàn)為POI，并通過該模型驗證了Basonuclin-1缺乏癥是人類常染色體顯性遺傳POI的遺傳原因[29]。WD重復區(qū)域62（Wdr62）基因敲除小鼠因卵母細胞減數(shù)分裂起始缺陷發(fā)生POI，并在POI患者中檢測到Wdr62突變，發(fā)現(xiàn)Wdr62基因與人類POI相關[30]。乳腺癌易感基因2（BRCA2）缺陷小鼠因卵泡發(fā)育受抑制及DNA損傷致卵母細胞的質量缺陷發(fā)生POI。BRCA2缺陷型卵母細胞中異位表達BRCA2可以部分恢復卵母細胞的發(fā)育和染色體穩(wěn)定性，提示BRCA2缺乏可能是人類POI的潛在驅動因素，為BRCA2缺乏誘導的POI患者提供了潛在的生育治療策略[31]。精卵生成堿性螺旋-環(huán)-螺旋轉錄因子2（Sohlh2）基因敲除小鼠因卵母細胞在早期發(fā)生過程中的分化受到損害而表現(xiàn)為POI[24]。生殖細胞特異性Atg7基因敲除小鼠品系，表現(xiàn)出因自噬破壞的嚴重卵泡丟失和生殖功能缺陷[32]。雜合的Fanca基因功能喪失小鼠（Fanca+/-）[28，33]、BMP15基因[24-25]、GDF9基因[25]敲除小鼠表現(xiàn)為POI。

POI是高度異質性的，POI的動物模型已成功用于鑒定該疾病的候選基因，已鑒定出80多個候選基因，其中約25%的基因表現(xiàn)出致病作用[30]。只有極少數(shù)（例如FMR1[26]、BMP15[25]、GDF9[25]和FSHR[27]）被用作診斷的生物標記物，這些基因可能是基因治療的好靶標。隨著目前基因編輯技術的快速發(fā)展，尤其是常間回文重復序列叢集/關聯(lián)蛋白（CRISPR/Cas）系統(tǒng)更容易構建各種物種的基因敲除/敲入動物模型，為新的POI基因突變動物模型制作提供了良好的技術支持。針對已有和新發(fā)致病基因的定點和定時誘導發(fā)病模型，是未來精準復制動物模型構建的大趨勢，可提高我們關于人類疾病病理進程的認識，幫助探索有效的治療策略。

5 連續(xù)超排卵誘導卵巢衰老加速模型

對于嚙齒類動物，使用孕母馬血清促性腺激素（pregnant mare serum gonadotropin，PMSG）和人絨毛膜促性腺激素（human chorionic gonadotropin，hCG）反復誘導超排卵，以前列腺素F2α（prostaglandin F2α，PGF2α）溶解黃體[34]。制備過程：7～8周齡的C57BL/6雌性小鼠經(jīng)腹腔注射5 IU的PMSG，48 h后經(jīng)腹腔注射5 IU的hCG，19 h后經(jīng)腹腔注射25 IU的PGF2α。3種藥物注射完成則組成一個完整的促排卵周期，下一個周期開始于12 h后，進行連續(xù)超排卵（continuous superovulation，CS）。判斷標準：超過10次CS模型小鼠的卵巢指數(shù)降低，原始卵泡池和卵巢功能均明顯下降，竇卵泡數(shù)量增加，凋亡細胞的數(shù)量顯著增加。CS15次組和自然衰老組（44周齡的C57BL/6小鼠）之間的卵泡數(shù)量無顯著差異。故連續(xù)10次以上CS建立了POI小鼠模型。通過該模型發(fā)現(xiàn)CS涉及p16和沉默信息調節(jié)因子2相關酶1/叉頭框蛋白O1（SIRT1/FOXO1）信號通路，增加氧化應激和卵巢細胞凋亡，進而降低卵母細胞質量和卵巢功能[34]。張金金[35]在以上CS 10次造模的基礎上聯(lián)合臭氧吸入建立卵巢衰老加速模型。區(qū)別于上述造模方法之處在于注射PGF2α的5 h后，開始下一次促排卵，共10個周期，期間運用定時開關，將小鼠每日暴露于臭氧的時間控制在10 h，臭氧濃度穩(wěn)定在1.2 mg/m3，成模判斷標準同前。通過此模型發(fā)現(xiàn)復方坤泰膠囊可能通過抗氧化應激、抗凋亡機制延緩卵巢衰老。該模型既有效模擬了自然狀態(tài)下卵巢衰老的兩大典型特征（卵泡數(shù)量減少和質量下降），又造成模型小鼠卵巢內分泌和生殖功能急劇下降，且模型在短期內不會自然恢復，有利于開展卵巢衰老絕經(jīng)領域的探索性研究。

6 D-半乳糖誘導的POI模型

糖化是內源性衰老的機制之一，D-半乳糖皮下注射是衰老造模的經(jīng)典方法?；加邪肴樘茄Y的婦女最終進展為POI。半乳糖及其衍生物的毒性作用于卵巢及周圍組織是造成卵巢病理性損傷的原因之一。造模方法：7～8周齡的C57BL/6雌性小鼠連續(xù)42 d經(jīng)皮下注射D-半乳糖（200 mg·kg-1·d-1）。第42天模型小鼠體質量增長緩慢，卵巢指數(shù)降低，E2明顯下降，F(xiàn)SH明顯升高；卵巢形態(tài)學表現(xiàn)為卵巢空泡化明顯，閉鎖卵泡增多，提示成功構建POI小鼠模型[36]。缺點：模型小鼠血清AMH、雄激素均增高，與卵巢衰老特征不符，因此不模擬卵巢衰老真正的病理生理條件。模型構建是藥物研究的基礎，通過此模型發(fā)現(xiàn)人參皂苷Rg1能靶向調控卵巢組織中沉默信息調節(jié)因子2相關酶1的表達而發(fā)揮延緩卵巢衰老的作用[37]。另有研究發(fā)現(xiàn)姜黃素通過核轉錄因子E2相關因子2（Nrf2）/血紅素加氧酶（HO-1）和PI3K/Akt信號通路可有效抑制D-半乳糖誘導的氧化應激、凋亡及卵巢損傷[36]。這對于發(fā)現(xiàn)潛在的POI保護劑具有重要意義。

7 環(huán)境化學毒物誘導卵巢衰老加速模型

4-乙烯環(huán)己烯二環(huán)氧化物（4-vinylcyclohexene diepoxide，VCD）是工業(yè)化學物質，能選擇性地破壞雌鼠和靈長類動物的原始卵泡和初級卵泡，具有卵巢毒性，在毒性研究中常被用作陽性對照。造模方法：21日齡SD雌性大鼠經(jīng)腹腔注射VCD（160 mg/kg），持續(xù)15 d。可成功構建以卵巢成熟卵泡減少、閉鎖卵泡顯著增加和AMH水平明顯降低為特征的POI模型[38]。通過此模型發(fā)現(xiàn)護陽養(yǎng)坤方通過Hippo-Janus蛋白酪氨酸激酶2（Hippo-JAK2）/信號轉導和轉錄活化因子3（STAT3）信號通路，改善POI大鼠的卵巢功能障礙并增強其卵巢功能[38]。VCD模型選擇性作用于始基和初級卵泡，加速始基卵泡池的激活和耗竭，進而加速卵巢衰老，最終在激素水平和動情周期等方面能模擬人類絕經(jīng)前、絕經(jīng)過渡早期、過渡晚期以及絕經(jīng)后的不同狀態(tài)。理論上非常適用于進行藥物實驗研究，但是由于衰老程度太快且不可逆，實際研究中應用較少。日常生活中通常單純暴露于一種環(huán)境化學毒物的機會比同時暴露于多種的情況少見，目前的研究越來越傾向于研究多個化學毒物聯(lián)合暴露后對卵巢等器官功能的影響，規(guī)避環(huán)境化學毒物對身體的損害顯得尤為重要。

8 結語

人類疾病動物模型作為重要的研究工具，在人類疾病的發(fā)生機制研究、防治藥物開發(fā)、診斷方法篩選等方面起著不可替代的作用。在POI的研究中，已經(jīng)建立了大量的動物模型，其中免疫反應、放化療、D-半乳糖是構建POI的經(jīng)典方法。這些方法側重于不同的病因學，均有著各自的獨特性和局限性?；蚯贸?敲入動物模型是未來精準復制動物模型構建的大趨勢，也存在外源性基因表達不穩(wěn)定可能、造模費時、費用高等缺陷。卵巢衰老加速模型對于絕經(jīng)領域的探索性研究具有重要意義。環(huán)境化學毒物對生殖內分泌的影響也逐漸成為關注的熱點。本文只列舉了幾種常見的POI模型，另外制動應激、高血壓、其他藥物如氫化可的松等也可致POI。POI的動物模型判斷標準除了血清激素水平和卵泡方面，目前多是生育功能方面的研究。在未來的研究中，可以考慮對POI模型的基因學和細胞組織學等方面進行定性、定量分析，也可以考慮多種因素造模法，各種模型制備方法相結合、取長補短、優(yōu)勢互補。這些方法是否可行，是否能通過對比找出理想的POI動物模型有待于以后的研究。目前多數(shù)處于基礎科研階段，后期臨床應用的安全性和可靠性有待進一步證實。延緩卵巢衰老、防治各因素導致的卵巢損傷仍任重而道遠。