代天 楊萍 劉波 張?zhí)K川

急性心肌梗死是引起人類死亡的常見的心血管疾病，其治療原則是恢復(fù)缺血心肌的血流灌注[1]，但這同時(shí)也會(huì)加重心肌結(jié)構(gòu)和功能的損傷，從而引起心功能降低、惡性心率失常等，即心肌缺血再灌注(ischemia/reperfusion,I/R)損傷[2]。目前，臨床治療心臟缺血過(guò)程中，I/R損傷是一大難題。所以，探討心肌I/R損傷的發(fā)病機(jī)制并在恢復(fù)血流灌注時(shí)減輕或者清除I/R損傷具有深遠(yuǎn)的現(xiàn)實(shí)意義。微小RNA(microRNA，miRNA)是一類小分子單鏈非編碼RNA，其在心血管系統(tǒng)中的作用一直被廣泛研究。如Zhang等[3]研究顯示，I/R損傷后的H9C2細(xì)胞中miR-208a升高，促進(jìn)miR-208a表達(dá)可增強(qiáng)細(xì)胞損傷并促進(jìn)細(xì)胞凋亡。miR-1224-5p是miRNA家族成員，其參與細(xì)胞增殖、凋亡、氧化應(yīng)激等過(guò)程[4,5]。但目前，miR-1224-5p對(duì)I/R損傷的影響還未知。StarBase在線網(wǎng)站預(yù)測(cè)顯示，血紅素加氧酶1(heme oxygenase 1，HMOX1)是miR-1224-5p的靶基因。HMOX1是血紅素降解的起始酶和限速酶，在心肌I/R損傷中發(fā)揮保護(hù)作用[6]。本研究通過(guò)體外培養(yǎng)心肌細(xì)胞H9C2并模擬I/R損傷，探討miR-1224-5p對(duì)心肌I/R損傷的影響及其是否通過(guò)調(diào)控HMOX1表達(dá)發(fā)揮作用。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞與實(shí)驗(yàn)試劑 大鼠心肌細(xì)胞H9C2，中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究所；胎牛血清(Fet al Bovine Serum，F(xiàn)BS)，杭州四季青公司；DMEM培養(yǎng)基，美國(guó)Gibco公司；胰蛋白酶和四甲基噻唑藍(lán)染色法(methylthiazoletrazolium，MTT)，美國(guó)Sigma公司；Trizol試劑、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和PCR試劑盒，深圳晶美公司；HMOX1抗體，上海允麥生物科技有限公司；LiPofectamineTM 2000試劑盒，美國(guó)Invitrogen公司；miR-144-3p模擬物(mimics)、抑制劑及陰性對(duì)照，廣州銳博生物有限公司；PCR引物序列，上海吉瑪公司；BCA蛋白測(cè)定試劑盒，北京索萊寶公司；雙熒光素酶活性檢測(cè)試劑盒，美國(guó)Promega公司；超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)、丙二醛(malondialdehyde，MDA)、乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase，LDH)和天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(aspartate aminotransferase，AST)試劑盒，南京建成生物工程研究所；Annexin V-FITC/PI試劑盒，艾美捷科技有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染:復(fù)蘇大鼠心肌細(xì)胞H9C2，加入含10% FBS的DMEM培養(yǎng)基，置于37℃、5% CO2、97%濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。根據(jù)細(xì)胞生長(zhǎng)狀況，每2～3天更換1次新鮮的培養(yǎng)基。待細(xì)胞融合至80%～90%時(shí)，加入適量的磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered saline，PBS)清洗細(xì)胞。吸棄PBS，加入0.25%胰蛋白酶溶液，消化后傳代培養(yǎng)。對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的H9C2細(xì)胞，以5×104個(gè)細(xì)胞接種于24孔板中。細(xì)胞融合至60%時(shí)，參照LiPofectamineTM 2000試劑盒操作說(shuō)明書，分別轉(zhuǎn)染miR-1224-5p 抑制劑(anti-miR-1224-5p組)、抑制劑陰性對(duì)照(anti-miR-con組)、共轉(zhuǎn)染miR-1224-5p 抑制劑與HMOX1小干擾RNA的si RNA(anti-miR-1224-5p+si-HMOX1組)、miR-1224-5p 抑制劑與小干擾RNA的si RNA陰性對(duì)照(anti-miR-1224-5p+si-con組)。轉(zhuǎn)染48 h后，收集細(xì)胞，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 IR損傷模型建立和細(xì)胞分組:未轉(zhuǎn)染的H9C2細(xì)胞、anti-miR-1224-5p組、anti-miR-con組、anti-miR-1224-5p+si-HMOX1組、anti-miR-1224-5p+si-con組細(xì)胞接種于96孔板中，每孔5×103個(gè)細(xì)胞。細(xì)胞貼壁后，參照文獻(xiàn)方法模擬IR損傷[7]：吸棄原培養(yǎng)，換用缺血緩沖液(pH值6.5)，置于37℃、21% O2、5% CO2培養(yǎng)箱中孵育2 h。然后換用正常培養(yǎng)基，在常規(guī)培養(yǎng)箱中再灌注4 h。細(xì)胞依次記為I/R損傷組(I/R組)、I/R+anti-miR-con組、I/R+anti-miR-1224-5p組、I/R+anti-miR-1224-5p+si-con組、I/R+anti-miR-1224-5p+si-HMOX1組。同時(shí)設(shè)置對(duì)照組(Control組)：細(xì)胞不做任何處理，常規(guī)培養(yǎng)。

1.2.3 細(xì)胞活性檢測(cè):細(xì)胞按照1.2.2分組處理后，每孔加入20 μl的MTT(5 g/L)，繼續(xù)孵育4 h。吸棄培養(yǎng)基，加入150 μl二甲基亞砜，反應(yīng)5 min，振蕩混勻后于酶標(biāo)儀490 nm處測(cè)定吸光度值(A)。細(xì)胞存活率(%)=A實(shí)驗(yàn)組/A對(duì)照組×100%。

1.2.4 細(xì)胞凋亡率檢測(cè):細(xì)胞按照1.2.2分組處理后，吸取細(xì)胞培養(yǎng)上清液，3 500 r/min離心10 min，-20℃保存?zhèn)溆谩BS清洗細(xì)胞，加入0.25%胰蛋白酶消化，收集細(xì)胞。參照Annexin V-FITC/PI試劑盒操作說(shuō)明書，加入400 μl結(jié)合緩沖液，移液器輕輕吹打，混懸細(xì)胞。加入10 μl Annexin V-FITC，37℃避光反應(yīng)10 min。再加入5 μl碘化丙啶(propidium iodide，PI)，37℃避光反應(yīng)5 min。最后加入100 μl結(jié)合緩沖液，混勻后，上流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡。

1.2.5 酶聯(lián)免疫法檢測(cè)SOD、MDA、LDH和AST水平:采用酶聯(lián)免疫吸附法檢測(cè)1.2.4保存的細(xì)胞培養(yǎng)上清液，分別按照SOD、MDA、LDH和AST試劑盒操作說(shuō)明書檢測(cè)其水平變化。

1.2.6 qRT-PCR檢測(cè)miR-1224-5p表達(dá):4組細(xì)胞加入Trizol試劑，提取細(xì)胞中總RNA。微量核酸儀檢測(cè)RNA的純度和濃度后，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。以cDNA為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。引物序列：miR-1224-5p上游5’-TGCGCGTGAGGACTCGGGA-3’，下游5’-CTCAAGTGTCGTGGAGTCGGCAA-3’；內(nèi)參U6上游5’-CGCTTCGGCAGCACATATAC-3’，下游5’-AAATATGGAACGCTTCAA-3’。PCR擴(kuò)增程序：95℃ 5 min(1個(gè)循環(huán))，95℃ 10 s、60℃ 30 s、72℃ 30 s(35個(gè)循環(huán))。以U6為內(nèi)參，2-ΔΔCt法計(jì)算miR-1224-5p的相對(duì)表達(dá)水平。

1.2.7 Western Blot法檢測(cè)HMOX1蛋白表達(dá):收集4組細(xì)胞，RIPA試劑，提取細(xì)胞中總蛋白。BCA蛋白試劑盒檢測(cè)蛋白濃度。取一定量的蛋白溶液，加入上樣緩沖液，沸水中煮沸5 min。蛋白變性后，以每孔30 μg蛋白，行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳。電泳結(jié)束后，濕轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)至硝酸纖維素膜，于5%脫脂奶粉溶液封閉1 h。加入HMOX1抗體(稀釋度1∶1 000)，4℃孵育過(guò)夜。TBST洗膜3次，5 min/次。加入辣根過(guò)氧化酶標(biāo)記的羊抗鼠二抗IgG(稀釋度1∶1 000)，37℃孵育1 h。TBST再次洗膜后，加入化學(xué)發(fā)光試劑ELC進(jìn)行避光顯影，凝膠成像系統(tǒng)曝光拍照。

1.2.8 雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)驗(yàn)證miR-1224-5p與HMOX1靶向關(guān)系:starBase在線網(wǎng)站預(yù)測(cè)顯示，HMOX1的3’-非翻譯區(qū)(3’UTR)存在miR-1224-5p的結(jié)合位點(diǎn)。構(gòu)建HMOX1的3’UTR野生型(WT)熒光素酶載體pGL3-HMOX1-WT和突變型(MUT)熒光素酶載體pGL3-HMOX1-MUT。采用LiPofectamineTM2000試劑盒將pGL3-HMOX1-WT與miR-1224-5p mimics或miR-con、pGL3-HMOX1-MUT與miR-1224-5p mimics或miR-con共轉(zhuǎn)染至H9C2細(xì)胞。轉(zhuǎn)染48 h后，使用雙熒光素酶活性檢測(cè)試劑盒檢測(cè)各組的熒光素酶活性。結(jié)果以熒光蟲活性/海腎熒光強(qiáng)度比值表示各組的熒光素酶活性。

2 結(jié)果

2.1 miR-1224-5p在I/R心肌H9C2細(xì)胞中的表達(dá)及轉(zhuǎn)染效果比較 與Control組比較，I/R組miR-1224-5p水平升高(P<0.05)。與I/R組比較，I/R+anti-miR-con組miR-1224-5p水平無(wú)明顯變化(P>0.05)，I/R+anti-miR-1224-5p組miR-1224-5p水平降低(P<0.05)。與I/R+anti-miR-con組比較，I/R+anti-miR-1224-5p組miR-1224-5p水平降低(P<0.05)。見表1。

表1 miR-1224-5p在I/R心肌細(xì)胞H9C2中的表達(dá)及轉(zhuǎn)染效果

2.2 miR-1224-5p對(duì)I/R心肌細(xì)胞H9C2存活率和凋亡的影響 與Control組比較，I/R組H9C2細(xì)胞存活率降低(P<0.05)，凋亡率升高(P<0.05)。與I/R組比較，I/R+anti-miR-con組H9C2細(xì)胞存活率和凋亡率無(wú)明顯變化(P>0.05)，I/R+anti-miR-1224-5p組H9C2細(xì)胞存活率升高(P<0.05)，凋亡率降低(P<0.05)。與I/R+anti-miR-con組比較，I/R+anti-miR-1224-5p組H9C2細(xì)胞存活率升高(P<0.05)，凋亡率降低(P<0.05)。見表2，圖1。

表2 miR-1224-5p對(duì)I/R心肌細(xì)胞存活率和凋亡的影響

圖1 miR-1224-5p對(duì)I/R心肌細(xì)胞凋亡的影響

2.3 miR-1224-5p對(duì)I/R心肌細(xì)胞氧化應(yīng)激水平和心肌酶活性的影響 與Control組比較，I/R組SOD水平降低(P<0.05)，MDA、LDH和AST水平升高(P<0.05)。與I/R組比較，I/R+anti-miR-con組SOD、MDA、LDH和AST水平均無(wú)明顯變化(P>0.05)，I/R+anti-miR-1224-5p組SOD水平升高(P<0.05)，MDA、LDH和AST水平降低(P<0.05)。與I/R+anti-miR-con組比較，I/R+anti-miR-1224-5p組SOD水平升高(P<0.05)，MDA、LDH和AST水平降低(P<0.05)。見表3。

表3 miR-1224-5p對(duì)I/R心肌細(xì)胞氧化應(yīng)激水平和心肌酶活性的影響

2.4 miR-1224-5p靶向抑制HMOX1的表達(dá) starBase在線網(wǎng)站預(yù)測(cè)顯示，HMOX1的3’UTR存在miR-1224-5p的結(jié)合位點(diǎn)。雙熒光素酶活性檢測(cè)結(jié)果顯示，miR-1224-5p+HMOX1(WT)組的熒光素酶活性顯著低于miR-con+HMOX1(WT)組(P<0.05)，miR-1224-5p+HMOX1(MUT)組的熒光素酶活性與miR-con+HMOX1(MUT)組比較差異物統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，表明miR-1224-5p可與HMOX1的3’UTR的靶向結(jié)合。Western blot進(jìn)一步檢測(cè)顯示，miR-1224-5p組HMOX1蛋白水平低于miR-con組(P<0.05)。見圖2、3，表4、5。

圖2 miR-1224-5p與HMOX1的結(jié)合位點(diǎn)

圖3 western blot檢測(cè)心肌細(xì)胞中miR-1224-5p的表達(dá)對(duì)HMOX1表達(dá)的影響；1 Control組；2 miR-con組；3 miR-1224-5p組

表4 雙熒光素酶活性檢測(cè)心肌細(xì)胞中miR-1224-5p與HMOX1的靶向關(guān)系

表5 western blot檢測(cè)心肌細(xì)胞中miR-1224-5p的表達(dá)對(duì)HMOX1表達(dá)的影響

2.5 HMOX1逆轉(zhuǎn)miR-1224-5p對(duì)I/R心肌細(xì)胞損傷的促進(jìn)作用 與I/R+anti-miR-1224-5p組比較，I/R+anti-miR-1224-5p+si-HMOX1組HMOX1水平降低，H9C2細(xì)胞存活率降低(P<0.05)，凋亡率升高(P<0.05)，SOD水平降低(P<0.05)，MDA、LDH和AST水平升高(P<0.05)，而I/R+anti-miR-1224-5p+si-con組各檢測(cè)指標(biāo)均無(wú)明顯變化(P>0.05)。與I/R+anti-miR-1224-5p+si-con組比較，I/R+anti-miR-1224-5p+si-HMOX1組HMOX1水平降低，H9C2細(xì)胞存活率降低(P<0.05)，凋亡率升高(P<0.05)，SOD水平降低(P<0.05)，MDA、LDH和AST水平升高(P<0.05)；I/R+anti-miR-1224-5p組各檢測(cè)指標(biāo)比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見圖4，表6、7。

圖4 western blot檢測(cè)3組細(xì)胞中HMOX1的表達(dá)；1 I/R+anti-miR-1224-5p組；2 I/R+anti-miR-1224-5p+si-con；3 I/R+anti-miR-1224-5p+si-HMOX1組

表6 HMOX1逆轉(zhuǎn)miR-1224-5p對(duì)I/R心肌細(xì)胞細(xì)胞存活率和凋亡的影響

表7 HMOX1逆轉(zhuǎn)miR-1224-5p對(duì)缺血再灌注心肌細(xì)胞氧化應(yīng)激水平和心肌酶活性的影響

3 討論

氧化應(yīng)激是心肌I/R損傷發(fā)生發(fā)展的重要病理基礎(chǔ)，I/R損傷發(fā)生時(shí)，機(jī)體內(nèi)氧化/抗氧化功能失調(diào)，自由基清除能力降低，體內(nèi)氧化應(yīng)激加劇，造成心肌損傷加重[8]。抑制氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡可有效降低I/R損傷。SOD是一種抗氧化酶，可有效清除自由基。MDA是脂質(zhì)過(guò)氧化產(chǎn)物之一，可反映機(jī)體內(nèi)脂質(zhì)過(guò)氧化程度，可間接反映機(jī)體組織細(xì)胞受損程度。心肌酶是心肌細(xì)胞缺血缺氧時(shí)發(fā)生明顯變化的標(biāo)志物，LDH和AST常用作I/R損傷的檢測(cè)指標(biāo)[9]。LDH是心肌細(xì)胞特異性表達(dá)的酶，存在于心肌細(xì)胞胞質(zhì)中。心肌細(xì)胞受損時(shí)，LDH大量釋放進(jìn)入血液，其水平越高，說(shuō)明I/R損傷越嚴(yán)重[10]。AST在心肌細(xì)胞中廣泛表達(dá)，與LDH相同，心肌損傷時(shí)，大量釋放進(jìn)入血液。本研究結(jié)果顯示，心肌細(xì)胞H9C2發(fā)生I/R時(shí)，細(xì)胞存活率降低，凋亡率和MDA、LDH和AST水平升高，而SOD活力降低，與相關(guān)研究結(jié)果[11,12]一致。

miRNA通常與靶mRNA的3’UTR結(jié)合或降解靶mRNA，在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控基因的表達(dá)，參與各種疾病的發(fā)生發(fā)展[13]。miRNA參與心肌I/R損傷發(fā)生發(fā)展過(guò)程，可作為IR損傷的特定標(biāo)志物，在臨床診斷和治療中具有廣闊的應(yīng)用前景[14,15]。研究顯示，miR-1224-5p參與調(diào)控瘢痕疙瘩成纖維細(xì)胞的增殖和凋亡[16]；抑制miR-1224-5p表達(dá)可減弱二氧化硅誘導(dǎo)的體內(nèi)肺纖維化[17]。目前，miR-1224-5p對(duì)I/R的影響及作用機(jī)制還未知。本研究結(jié)果顯示，I/R處理可促進(jìn)心肌細(xì)胞H9C2中miR-1224-5p表達(dá)，提示miR-1224-5p可能參與I/R損傷發(fā)生發(fā)展。轉(zhuǎn)染anti-miR-1224-5p抑制H9C2細(xì)胞中miR-1224-5p表達(dá)后，與I/R+anti-miR-con組比較，I/R+anti-miR-1224-5p組H9C2細(xì)胞存活率明顯升高，凋亡率明顯降低，提示抑制miR-1224-5p表達(dá)可促進(jìn)心肌細(xì)胞增殖，并抑制細(xì)胞凋亡。同時(shí)，抑制miR-1224-5p表達(dá)后，I/R處理的H9C2細(xì)胞MDA、LDH和AST表達(dá)明顯降低，SOD活力升高，提示抑制miR-1224-5p表達(dá)可能通過(guò)抗氧化應(yīng)激減輕I/R誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞損傷。

為了進(jìn)一步探討miR-1224-5p影響心肌I/R細(xì)胞的作用機(jī)制，本研究通過(guò)在線生物信息學(xué)軟件預(yù)測(cè)顯示，HMOX1的3’UTR存在miR-1224-5p的結(jié)合位點(diǎn)，提示HMOX1是miR-1224-5p的靶基因。雙熒光素酶活性檢測(cè)和Western blot檢測(cè)證實(shí)HMOX1是miR-1224-5p的靶基因，并且miR-1224-5p負(fù)調(diào)控HMOX1表達(dá)。HMOX1是血紅素加氧酶的一種亞型，具有廣泛的生理作用。HMOX1是心肌中一種重要的內(nèi)源性保護(hù)因子，其表達(dá)增加可抑制心肌細(xì)胞凋亡[18]。研究顯示，丹參水溶性提取物可激活心肌細(xì)胞HMOX1蛋白的表達(dá)，保護(hù)心肌細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷[19]。蘆丁可通過(guò)提高大鼠心肌組織HMOX1的表達(dá)對(duì)心肌缺血再灌注發(fā)揮保護(hù)作用[20]。本研究結(jié)果顯示，抑制HMOX1表達(dá)逆轉(zhuǎn)了抑制miR-1224-5p表達(dá)對(duì)I/R心肌細(xì)胞增殖、凋亡及氧化應(yīng)激指標(biāo)MDA、LDH、AST和SOD表達(dá)的影響，說(shuō)明抑制miR-1224-5p表達(dá)通過(guò)上調(diào)HMOX1表達(dá)對(duì)心肌細(xì)胞I/R發(fā)揮保護(hù)作用。

綜上所述，抑制miR-1224-5p表達(dá)可保護(hù)心肌細(xì)胞I/R損傷，其作用機(jī)制與上調(diào)HMOX1表達(dá)有關(guān)，是缺血性心臟疾病治療的的潛在靶點(diǎn)。但是心肌I/R損傷的作用機(jī)制較為復(fù)雜，miR-1224-5p信號(hào)通路可能不只miR-1224-5p/HMOX1途徑，還需要進(jìn)一步深入探討研究。